全 文 ：第24卷 第9期
2012年9月
Vol. 24, No. 9
Sep., 2012
生命科学
Chinese Bulletin of Life Sciences
文章编号：1004-0374(2012)09-0991-06
深海微生物资源研究开发技术进展
曾润颖*，产竹华
(国家海洋局第三海洋研究所，国家海洋局海洋生物遗传资源重点实验室，厦门 361005)
摘　要：深海微生物由于生存环境的特殊性而具有各种与陆地和浅海微生物不同的功能，这些特殊功能具
有重要的应用价值，是争夺激烈的深海热点资源之一。近年来，不断有新的研究技术和方法得到应用，推
动了深海微生物资源的获取、研究和开发。对深海微生物菌株和基因资源研究开发方面的技术发展以及工
作策略进行了综述与讨论。
关键词：深海；极端微生物；基因资源
中图分类号：Q178.53 文献标志码：A
Progress in research and development techniques on deep sea
microorganism resource
ZENG Run-Ying*, CHAN Zhu-Hua
(Third Institute of Oceanography, SOA Key Lab of Marine Biogenetic Resources, SOA, Xiamen 361005, China)
Abstract: Deep sea microorganisms have many special functions that are different from terrigenous and shallow sea
microorganisms because of the particularities of their habitat. These special functions have important application
value, and become one of the hot deep sea resources which are strived strongly. In recent years, new research
techniques and methods were applied, accelerating the obtaining, research and development of deep sea
microorganism resources. In this paper, the technique development and study strategy for the research and
development of deep sea microbial strain and gene resources were summarized and discussed.
Key words: deep sea; extremophile; genetic resources
收稿日期：2012-05-21
基金项目：国家高技术研究发展计划(“863”项目)
(2012AA092103)
*通信作者：E-mail: zengrunying@126.com
海洋是地球上最大的生物栖息地，在地球生物
圈中，海洋生物圈占总体积的 90%以上和总面积
的 70%以上，而水深大于 1 000米的深海区域，约
占海洋总面积的 60%[1]。自从 1977年美国 Alvin号
深潜器在太平洋上的加拉帕戈斯群岛附近 2 500米
的深海热液区发现了完全不依赖于光合作用而独立
生存的生态系统以来 [2]，越来越多的研究表明，深
海蕴藏着种类繁多、数量庞大、性质独特的生物资
源，其中微生物是最主要的一类资源。据估算，仅
海底沉积物顶部 10 cm空间内就含有约 4.5亿 t
DNA，是地球上最大的基因储库 [3]。在陆地微生物
资源已被充分利用的今天，深海微生物及其基因资
源的开发将为生物制药、绿色化工、水污染处理、
石油采收等生物工程技术的发展提供新的途径与生
物材料。因此，深海这个地球上最大的微生物及其
基因资源库成为国际上争夺的焦点。
微生物资源一般是指有一定科学意义或实用价
值的菌株、病毒株、细胞株等可培养的微生物，可
以通过大规模地培养来进行研究与开发。而来自深
海的微生物由于其生存条件的特殊性，难以进行大
规模培养，需要通过基因工程、蛋白质工程等手段
才能实现研究与开发。因此，深海微生物资源的范
畴除了可培养微生物以外，还包括了来自可培养与
不可培养微生物的基因组资源。近年来，生物学研
究技术的发展可谓日新月异，也带动了深海微生物
研究开发技术，尤其是微生物资源获取与分析技术
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方面的快速发展。
1　深海微生物的分离培养
自然界中只有极少部分微生物能够在现有技术
条件下得到分离与培养，在深海环境中，可培养微
生物的比例被普遍认为还不到 1%。因此，获得纯
培养菌株在基础研究以及活性物质的研究开发等方
面均具有重要的意义。首先，可以通过大规模培养
获得足够的活性物质进行研究和开发；第二，可以
为活性物质的基因改造提供全面、准确的遗传信息；
第三，从生产菌株角度上来说，基因工程菌一般均
存在功能退化的现象，而利用纯培养的野生菌株作
为生产菌株则能保证菌株功能的稳定性。因此，尽
管目前宏基因组技术在深海中得到了越来越广泛的
应用，但分离培养技术的改进和创新一直是深海微
生物研究开发中的热点。
1.1　微生物平板培养方法
微生物平板培养方法是一种传统的实验方法，
利用该方法能够从深海环境样品中获得一些优势的
菌种。然而，如果需要获得深海环境样品中的那些
非优势菌种，则需要结合多种条件进行分离。通常
需要考虑的因素包括：营养基质的浓度及成分；压
力、温度等极端条件的模拟。
1.1.1　营养基质浓度与成分优化
深海不同类型的环境具有不同的特征，例如海
床区的特征是寡营养；热液区的特征是硫、重金属
含量高 [4]；冷渗区 (cold seep)的特征是甲烷和硫酸
盐的浓度高 [5]。在分离时需要根据不同环境特征进
行营养基质浓度与成分的优化。在分离过程中，为
了避免少数微生物形成优势种并抑制其他种类微生
物的生长，极限稀释法和菌落转移法等技术是必须
采用的 [6]。
绝大部分的深海环境是低温、寡营养的海床，
其中大部分的寡营养微生物尚未得到分离培养。寡
营养微生物被认为是可在低有机碳含量 (例如 1~15
mg/L[7]、1 mg/L以下 [8]或低于 6 mg/L[9])的培养基
上生长的微生物；但寡营养状态并非一个固定的
生理特征，因为有些寡营养菌在分离出来以后可
以逐渐适应富营养的培养条件 [10]。目前针对浅层海
水中寡营养菌的分离已经开展了大量的工作。Rappe
等 [11]通过寡营养的培养基首次获得了 11株属于
α-Proteobacteria的细菌，其中 Pelagibacter ubique已
经得到较为充分的研究。Vancanneyt等 [12]利用低于
1 mg/L有机碳的寡营养培养基分离到了 S. alaskensis
RB2256，该菌不能在超过 5 mg/L碳的培养基上生
长，目前被作为寡营养微生物的模式种进行研究。
在深海微生物中目前还未见到专门针对寡营养菌开
展研究的报道，但在深海微生物分离培养中，科研
人员已经普遍采用低有机碳浓度的培养基，并配合
极端稀释法、菌落转移法 [6]等方法来进行分离筛选。
深海冷渗区和热液区的环境非常独特，各种高
浓度的硫、重金属、甲烷、硫酸盐等“营养源”造
就了许多特殊的微生物。大部分的深海新种的发现
都是来源于这些环境中的样品。从这些样品中分离
微生物，更需要考虑营养基质中硫、重金属、硫酸盐、
硝酸盐等成分，而且采用先富集再分离的方法可以
大大提高所分离微生物的种类。Kwon等 [13]采用含
有芘和硫酸盐的培养基，以及先富集再分离的方法，
从日本鹿儿岛海湾的冷渗区样品中分离到一株新种
Altererythrobacter epoxidivorans 。Rosario-Passapera
等 [14]利用以正烷烃为唯一碳源的人工海水培养基从
东太平洋海隆热液羽流样品中分离到新种 Parvi­
baculum hydro carboniclasticum。彭亚林等 [15]采用含
有NaNO3、单质 S、Na2S的低有机碳寡营养培养基
对样品先富集，再进行分离，从印度洋深海热液区
分离到多株盐单胞菌。Makita等 [16]对马里亚纳弧
(Mariana Arc)的日光海山 (Nikko Seamount)区域的
热液样品进行了微生物的分离筛选，所采用的方法
同样是先用含有单质 S、Na2S、Na2S2O3、NaNO3的
培养基进行富集，再采用极限稀释法进行分离，最
终获得了新种 Thiofractor thiocaminus。
1.1.2　压力、温度等极端条件的模拟
绝大多数深海环境是恒定低温 (1~4 ℃ )，只有
热液喷口处是高温环境。因此，分离培养深海微生
物时一般都需要模拟样品的原位温度，这在技术上
不存在难度。此外，压力是深海典型的环境特征，
生存在这里的所有微生物均具有耐压的特性，其中
还包括少部分在常压下无法生长的嗜压菌 [17]。耐压
菌的分离培养可以在常压下进行，虽然目前没有明
确的证据，但是在分离中适当增加压力可能会提高
获得更多深海微生物纯培养的几率。嗜压菌属于深
海“土著”微生物，在科学研究上具有重要的价值。
它们的分离培养必须利用专用的压力模拟装置，在
高压下进行。这种压力模拟装置一般都是根据研究
需求自行设计的，Jannasch等 [18]设计了一套连续
培养系统，可以让微生物在高达 71 Mpa的压力下
持续生长。我国科研工作者也研发了深海微生物培
养模拟平台 [19]，并应用于耐压菌的分离与研究 [20]。
曾润颖，等：深海微生物资源研究开发技术进展第9期 993
在各种压力装置的辅助下获得了一些深海嗜压的微
生物 [21-24]，但由于培养条件要求比较严格，因此，
深海嗜压微生物的研究目前仍停留在理论研究阶
段。
1.2　海洋微生物高通量分离培养技术
提高可培养微生物比例需要考虑两方面因素，
其一是环境条件对微生物的影响，例如上述基于微
生物平板培养方法的改进；其二是在环境中微生物
之间的相互影响。作为一个完整的群落，不同微生
物的代谢产物对群落内其他微生物的生长具有不可
忽视的作用。近年来发展起来的高通量分离培养技
术就是针对这种作用而进行的改进 [25-26]。该技术的
基本要点是：首先，制备包埋单个微生物细胞的琼
脂糖 (或其他包埋基质 )微囊；然后，将包埋在微
囊中的微生物在缓慢流动的海水中进行培养，培养
结束后用流式细胞仪分选含有微菌落的微囊；最后，
将分选的微菌落进行扩大培养。该技术最大限度地
模拟了自然环境，使所有的微生物处在一个开放的、
连续的培养环境中，代谢产物和信号分子可以互相
交换，不破坏微生物之间的生态联系。同时，又将
单个微生物分离开培养，避免了混合培养时的营养
竞争问题，使大量的微生物能够获得纯培养。文献
[27-29]对包埋基质及包埋方法等进行了改进，并从
我国的黄海中获得了大量的新种，目前正进一步改
进该技术，以应用于深海微生物的分离培养。
2　深海微生物基因资源的获取与分析
2.1　宏基因组技术
宏基因组 (metagenome)的概念是 Handelsman
等 [30]于 1998年提出的 , 其定义为生境中全部微小
生物遗传物质的总和。它包含了可培养、不可培养、
未培养微生物的基因，避开了微生物分离培养的问
题，极大地扩展了微生物资源的利用空间。宏基因
组技术的一般流程包括：从环境样品中提取宏基因
组 DNA，克隆 DNA到合适的载体，导入宿主菌，
筛选目的转化子等。近年来宏基因组技术在深海微
生物研究开发中被广泛应用，包括微生物多样性、
种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及
与环境之间的关系等。
2.1.1　环境样品宏基因组DNA提取
高质量环境样品宏基因组 DNA是开展后续工
作的基础。2000年前后针对环境样品宏基因组
DNA的提取进行了大量的探索与改进 [31-34]，目前
已经有了较为成熟的试剂盒，基本解决了获取宏基
因组 DNA的问题；但相同重量或体积的深海沉积
物样品中微生物量远远低于陆地、近海的样品，因
此，在提取时仍需根据不同研究目标对方法进行改
进。
从原始样品中提取的宏基因组 DNA有可能来
自已经“死亡”的微生物或其他的微型生物，无法
获得样品中活动种群的信息。解决该问题的方法除
了用宏基因组 RNA代替 DNA作为研究对象以外，
通常的做法是根据目标种群或目标基因设计选择
培养基，对样品进行富集，然后再提取宏基因组
DNA。这种先富集后提取的方法一般应用于样品中
某个特定生态功能的微生物种群的多样性研究，或
者是特殊功能基因的获取。Takishita等 [35]提取了
原始样品和富集培养后样品的宏基因组 DNA，对
富含甲烷的深海冷渗区沉积物中的微生物多样性进
行了比较，发现富集培养后的宏基因组 DNA可以
更准确地反映该冷渗区环境特征。在功能基因获取
方面，Rees等 [36]通过在含有羧甲基纤维素的培养
基上富集培养，使构建的宏基因组文库中的纤维素
酶基因富集了 4倍。这一结果虽然是在盐碱湖中取
得的，但证明富集后再提取宏基因组 DNA的方法
可更加有效地获得深海等极端环境中的特殊功能基
因。
2.1.2　载体的选择
自从 1991年 Pace等 [37]首次构建了海洋微小
浮游生物环境 DNA文库以来 , 目前已构建众多的
海洋、深海环境样品的宏基因组文库。所采用的载
体种类包括 Cosmid、Fosmid、BAC、K2噬菌体以
及各种穿梭载体，其中 Cosmid、Fosmid和 BAC是
目前常用的载体。BAC插入的片段大 (可达 350
kb)，但克隆效率低，因此，目前仅应用于筛选微
生物次生代谢产物这类由基因簇控制的活性物质。
其他的深海微生物活性物质研究一般都采用Cosmid
和 Fosmid载体。这两个载体的插入片段较小 (35~40
kb)，但可以满足极端酶等单基因控制的活性物质
的研究。而且它们的克隆效率较高，尤其是 Fosmid
插入片段在 E. coli中的克隆效率和稳定性更高 [38]，
因此，目前 Fosmid已经成为最常用的载体。
2.1.3　宏基因组文库中目的转化子的筛选
环境样品宏基因组文库容量一般较大，活性克
隆的筛选成为研究开发的瓶颈。目前宏基因组文库
筛选方法大致包括两大类，即序列驱动筛选和功能
驱动筛选。
序列驱动筛选是利用已知序列设计保守引物或
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探针，利用 PCR或杂交等对文库克隆进行筛选，
其最大缺点是由于引物的设计依赖于已有的序列信
息，因此发现新功能基因的几率较低；但该方法简
便易行，效率高，在很多深海微生物研究中被采用。
在序列驱动筛选中，通过 PCR一般只能获得基因
的部分片段，而不能获得完整的功能基因。因此，
在获得基因片段之后，还需要利用各种方法来获得
完整的基因序列，包括快速步移法 (universal fast
walking)[39]、锅柄 PCR (panhandle PCR)[40]、随机引
物 PCR (random primed PCR)[41]、反向 PCR (inverse
PCR)和接头连接 PCR (adaptor ligation PCR)等 [42]。
功能驱动筛选不依赖于任何已知的序列信息，
仅根据文库克隆产生的活性进行筛选。该方法能够
发现全新的活性物质及其编码基因，目前在极端酶
筛选中应用最多 [43-47] ，但其工作量相对较大。由于
Cosmid和 Fosmid载体并不是表达载体，因此，所
获得的活性克隆中极端酶基因的表达是由插入片段
中自带的基因元件控制的。在理论上，通过目的基
因的亚克隆并在高效表达载体中进行表达，可进一
步提高酶的活性。然而目前的表达载体均为常温表
达载体，在低温或高温酶基因的表达中并不一定适
用。因此直接利用具有高酶活的宏基因组文库克隆
来生产低温酶是可行的 [48]。
2.1.4　宏基因组测序与分析
第二代测序技术的发展降低了环境样品宏基因
组序列的测序成本，提高了准确性，从而为基因、
基因簇的筛选和研究提供了有力的工具，但随之而
来的问题是如何对海量的宏基因组序列信息进行分
析，从中获得所需要的目的基因。在生态功能研究
方面，通过比较宏基因组学可以得到更为准确的结
果，例如 Xie等 [49]对胡安 ·德富卡海岭 Mothra热
液场 (Mothra Field of the Juan de FucaRidge)的热液
样品进行的比较宏基因组学研究，Quaiser等 [50]对
Marmara海域深海浮游生物和海底沉积物宏基因组
DNA的 454焦磷酸测序结果进行的比较宏基因组
学，都获得了微生物在所处环境的各种生物化学代
谢过程中的协同机制，以及其中的关键基因，在多
样性研究结果的基础上进一步较为准确地预测了微
生物的生态学功能。
2.2　未培养微生物单细胞基因组研究技术
采用宏基因组技术为深海极端生态系统中微生
物基因资源的研究开发提供了有力的工具，但目的
基因是从整个微生物群落的混合 DNA中获得的，
无法将其与具体的微生物个体对应起来，更无法进
一步获得单个微生物的基因组序列，因此，不能提
供足够的信息用于资源的发掘利用。单细胞基因组
分析技术弥补了宏基因组技术的这一缺陷，为分析
宏基因组信息的内涵和其中微生物的功能提供了新
的手段，其基本流程是单细胞分选、DNA提取、
多重置换扩增和基因组分析等，其中最关键的是单
细胞分选和多重置换扩增。
环境样品中单细胞的捕获可以采用诸如系列
稀释、流式分选、显微操作、光镊拉曼光谱技术
(laser-tweezers-Raman-spectroscopy，LTRS)[51-52] 以
及微流控芯片技术 [53]来实现，所捕获单细胞基因
组的扩增一般采用多重置换扩增 (multiple displace-
ment amplification，MDA)来进行。光镊拉曼光谱
技术将光学囚禁技术 (optical trapping)和拉曼光谱
分析 (raman spectroscopy)结合起来，形成了一种具
有非破坏性、灵敏度高和高度自动化的崭新技术，
并在各种单细胞的研究中得到广泛的应用。而
Quake研究组开发的微流控芯片技术 [53]是目前最
复杂但效率最高的技术，可将单细胞分选和后续的
MDA集合在一个芯片上完成，并能通过显微观察
和 Real-time PCR实现实时监测。目前这两个技术
正开始应用于深海微生物研究中。
3　结语
深海微生物资源的研究开发对海洋学、生物地
球化学、水化学、海洋地质和生物工艺学等相关学
科的依赖程度较高。在理论上，各种陆地与浅海的
研究技术均可应用于深海微生物资源的研究开发，
但都必须结合深海环境的特征，在策略上重新设计，
在技术上有针对性地进行改进，才能得到有效的应
用。随着我国 ROV、载人潜器、原位设备等深海
水下作业平台和工具的不断发展，将提高所采集样
品的质量，同时对深海环境参数的探测将越来越准
确、全面，从而大大提高我国深海微生物资源研究
开发技术的创新与应用水平。
[参　考　文　献]
[1] Lauro FM, McDougald D, Thomas T, et al. The genomic
basis of trophic strategy in marine bacteria. Proc Natl
Acad Sci USA, 2009, 106(37):15527-33
[2] Corliss JB, Dymond J, Gordon LI, et al. Submarine
thermal springs on the galapagos rift. Science, 1979,
203(4385):1073-83
[3] DellAnno A, Danovaro R. Extracellular DNA plays a key
role in deep-sea ecosystem functioning. Science, 2005,
309(5744): 2179
曾润颖，等：深海微生物资源研究开发技术进展第9期 995
[4] Luther GR, Rozan TF, Taillefert M, et al. Chemical
speciation drives hydrothermal vent ecology. Nature,
2001, 410(6830): 813-6
[5] Levin LA. Ecology of cold seep sediments: interactions of
fauna with flow, chemistry and microbes. Oceanogr Mar
Biol: An Annu Rev, 2005, 43: 1-46
[6] Raniey FA, Oren A. Methods in microbiology. Volume 35:
Extremophile[M]. Amsterdam: Acadimic Press, 2006
[7] Kuznetsov SI, Dubinina GA, Lapteva NA. Biology of
oligotrophic bacteria. Annu Rev Microbiol, 1979, 33: 377-
87
[8] Ishida Y, Imai I, Miyagaki T, et al. Growth and uptake
kinetics of a facultatively oligotrophic bacterium at low
nutrient concentrations. Microb Ecol, 1982, 8(1): 23-32
[9] Idwards C. Microbiology of extreme environments[M].
New York: McGraw-Hill, 1990: 93-116
[10] Schut F, de Vries EJ, Gottschal JC, et al. Isolation of
typical marine bacteria by dilution culture: growth, main-
tenance, and characteristics of isolates under labo ratory
conditions. Appl Environ Microbiol, 1993, 59(7): 2150-60
[11] Rappe MS, Connon SA, Vergin KL, et al. Cultivation of
the ubiquitous SAR11 marine bacterioplankton clade.
Nature, 2002, 418(6898): 630-3
[12] Vancanneyt M, Schut F, Snauwaert C, et al. Sphingomonas
alaskensis sp. nov., a dominant bacterium from a marine
oligotrophic environment. Int J Syst Evol Microbiol, 2001,
51(Pt 1): 73-9
[13] Kwon KK, Woo JH, Yang SH, et al. Altererythrobacter
epoxidivorans gen. nov., sp. nov., an epoxide hydrolase-
active, mesophilic marine bacterium isolated from cold-
seep sediment, and reclassification of Erythrobacter
luteolus Yoon et al. 2005 as Altererythrobacter luteolus
comb. nov. Int J Syst Evol Microbiol, 2007, 57(Pt 10):
2207-11
[14] Rosario-Passapera R, Keddis R, Wong R, et al. Par­
vibaculum hydrocarboniclasticum sp. nov., a meso philic,
alkane-oxidizing alphaproteobacterium isolated from a
deep-sea hydrothermal vent on the East Pacific Rise. Int J
Syst Evol Microbiol, 2012 [epub ahead print]
[15] 彭亚林, 何培青, 黄晓航, 等. 印度洋深海热液区一株盐
单胞菌Halomonas sp.YD-7的分离鉴定及研究. 海洋科
学进展, 2009, 27(3): 367-75
[16] Makita H, Nakagawa S, Miyazaki M, et al. Thiofractor
thiocaminus gen. nov., sp. nov., a novel hydrogen-
oxidizing, sulfur-reducing epsilonproteobacterium isolated
from a deep-sea hydrothermal vent chimney in the Nikko
Seamount field of the northern Mariana Arc. Arch
Microbiol, 2012, 194(9): 785-94
[17] Kato C, Bartlett DH. The molecular biology of barophilic
bacteria. Extremophiles, 1997, 1(3): 111-6
[18] Jannasch HW, Wirsen CO, Doherty KW. A pressurized
chemostat for the study of marine barophilic and
oligotrophic bacteria. Appl Environ Microbiol, 1996,
62(5): 1593-6
[19] 李世伦, 张建文, 叶树明,等. 深海微生物培养模拟平台
温度控制技术研究. 海洋工程, 2004, 22(3): 92-6
[20] 游志勇, 汤熙翔, 肖湘. 高压技术在深海沉积物兼性嗜
压菌的筛选和鉴定中的应用. 台湾海峡, 2007, 26(4):
555-61
[21] Eloe EA, Malfatti F, Gutierrez J, et al. Isolation and cha-
racterization of a psychropiezophilic α-proteo bacterium.
Appl Environ Microbiol, 2011, 77(22): 8145-53
[22] Kasahara R, Sato T, Tamegai H, et al. Piezo-adapted
3-isopropylmalate dehydrogenase of the obligate pie zo-
phile Shewanella benthica DB21MT-2 isolated from the
11,000-m depth of the mariana trench. Biosci Biotechnol
Biochem, 2009, 73(11): 2541-3
[23] Xu Y, Nogi Y, Kato C, et al. Moritella profunda sp. nov.
and Moritella abyssi sp. nov., two psychropiezophilic or-
ganisms isolated from deep Atlantic sediments. Int J Syst
Evol Microbiol, 2003, 53(Pt 2): 533-8
[24] Xu Y, Nogi Y, Kato C, et al. Psychromonas profunda sp.
nov., a psychropiezophilic bacterium from deep Atlantic
sediments. Int J Syst Evol Microbiol, 2003, 53(Pt 2): 527-
32
[25] Connon SA, Giovannoni SJ. High-throughput methods for
culturing microorganisms in very-low-nutrient media yield
diverse new marine isolates. Appl Environ Microbiol,
2002, 68(8): 3878-85
[26] Zengler K, Toledo G, Rappe M, et al. Cultivating the
uncultured. Proc Natl Acad Sci USA, 2002, 99(24):
15681-6
[27] Wang H, Zhang X, Yan S, et al. Huaishuia halophila gen.
nov., sp. nov., isolated from coastal seawater. Int J Syst
Evol Microbiol, 2012, 62(Pt 1): 223-8
[28] Wang H, Liu J, Wang Y, et al. Vibrio marisflavi sp. nov.,
isolated from seawater. Int J Syst Evol Microbiol, 2011,
61(Pt 3): 568-73
[29] Yan S, Yu M, Wang Y, et al. Catenovulum agarivorans
gen. nov., sp. nov., a peritrichously flagellated, chain-
forming, agar-hydrolysing γ-proteobacterium from
seawater. Int J Syst Evol Microbiol, 2011, 61(Pt 12):
2866-73
[30] Handelsman J, Rondon MR, Brady SF, et al. Molecular
biological access to the chemistry of unknown soil
microbes: a new frontier for natural products. Chem Biol,
1998, 5(10): R245-9
[31] Zhou J, Bruns MA , Tiedje JM. DNA recovery from soils
of diverse composition. Appl Environ Microbiol, 1996,
62(2): 316-22
[32] Bertrand H, Poly F, Van VT, et al. High molecular weight
DNA recovery from soils prerequisite for biotechnological
metagenomic library construction. J Microbiol Methods,
2005, 62(1):1-11
[33] Hurt RA, Qiu X, Wu L, et al. Simultaneous recovery of
RNA and DNA from soils and sediments. Appl Environ
Microbiol, 2001, 67(10): 4495-503
[34] 赵晶, 张锐, 林念炜, 等. 深海沉积物中微量DNA的提取
及应用. 海洋与湖沼, 2003, 34(3): 313-21
[35] Takishita K, Yubuki N, Kakizoe N, et al. Diversity of
microbial eukaryotes in sediment at a deep-sea methane
cold seep: surveys of ribosomal DNA libraries from raw
sediment samples and two enrichment cultures.
Extremophiles, 2007, 11(4): 563-76
生命科学 第24卷996
[36] Rees HC, Grant WD, Jones BE, et al . Diversity of Kenyan
soda lake alkaliphiles assessed by molecular methods.
Extremophiles, 2004, 8(1): 63-71
[37] Schmidt TM, DeLong EF, Pace NR. Analysis of a marine
picoplankton community by 16S rRNA gene cloning and
sequencing. J Bacteriol, 1991, 173(14): 4371-8
[38] Beja O. To BAC or not to BAC: marine ecogenomics.
Curr Opin Biotechnol, 2004, 15(3):187-90
[39] Myrick KV, Gelbart WM. Universal fast walking for direct
and versatile determination of flanking sequence. Gene,
2002, 284(1-2): 125-31
[40] Megonigal MD, Rappaport EF, Wilson RB, et al
Panhandle PCR for cDNA: a rapid method for isolation of
MLL fusion transcripts involving unknown partner genes.
Proc Natl Acad Sci USA, 2000, 97(17): 9597-602
[41] Liu YG , Whittier RF. Thermal asymmetric interlaced
PCR: automatable amplification and sequencing of insert
end fragments from P1 and YAC clones for chromosome
walking. Genomics, 1995, 25(3): 674-81
[42] Ochman H, Ayala FJ, Hartl DL. Use of polymerase chain
reaction to amplify segments outside boundaries of known
sequences. Methods Enzymol, 1993, 218: 309-21
[43] Fu C, Hu Y, Xie F, et al. Molecular cloning and charac-
terization of a new cold-active esterase from a deep-sea
metagenomic library. Appl Microbiol Biotechnol, 2011,
90(3): 961-70
[44] Jeon JH, Kim JT, Lee HS, et al. Novel lipolytic enzymes
identified from metagenomic library of deep-sea sediment.
Evid Based Complement Alternat Med, 2011, 2011:
271419
[45] Jiang X, Xu X, Huo Y, et al. Identification and charac-
terization of novel esterases from a deep-sea sediment
metagenome. Arch Microbiol, 2012, 194(3): 207-14
[46] 郭巧玲, 杨祥胜, 赵晶, 等. 深海沉积物宏基因组文库中
产蛋白酶克隆的筛选及性质分析. 应用与环境生物学
报, 2009, 15(4): 507-10
[47] 徐辉, 赵晶 , 曾润颖. 深海沉积物宏基因组文库中产蛋
白酶克隆CAPRO2的筛选及酶学性质分析. 台湾海峡,
2011, 30(4): 522-7
[48] 产竹华, 刘洋, 苏玉斌,等. 深海低温脂肪酶基因工程菌
LIP001发酵条件的优化. 中国生物工程杂志, 2011,
31(4): 65-70
[49] Xie W, Wang F, Guo L, et al. Comparative metagenomics
of microbial communities inhabiting deep-sea hydrothermal
vent chimneys with contrasting chemistries. ISME J, 2011,
5(3): 414-26
[50] Quaiser A, Zivanovic Y, Moreira D, et al. Comparative
metagenomics of bathypelagic plankton and bottom
sediment from the sea of Marmara. ISME J, 2011, 5(2):
285-304
[51] Xie C, Dinno MA, Li YQ. Near-infrared Raman
spectroscopy of single optically trapped biological cells.
Opt Lett, 2002, 27(4): 249-51
[52] Ajito K, Torimitsu K. Laser trapping and Raman
spectroscopy of single cellular organelles in the nanometer
range. Lab Chip, 2002, 2(1): 11-4
[53] Hansen C, Quake SR. Microfluidics in structural biology:
smaller, faster em leader better. Curr Opin Struct Biol,
2003, 13(5): 538-44