全 文 ：第 １１ 卷第 ６ 期
２０１３ 年 １１ 月
生　 物　 加　 工　 过　 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ． １１ Ｎｏ． ６
Ｎｏｖ． ２０１３
ｄｏｉ：１０． ３９６９ ／ ｊ． ｉｓｓｎ． １６７２ － ３６７８． ２０１３． ０６． ００３
收稿日期：２０１２ － ０８ － １２
基金项目：国家高技术研究发展计划（８６３ 计划）（２００８ＡＡ０２Ｚ２１２）
作者简介：宋灿辉（１９８６—），男，河南洛阳人，硕士研究生，研究方向：基因工程；张伟国（联系人），教授，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｚｈａｎｇｗｇ１６８＠ １２６． ｃｏｍ
敲除 ａｃｅＥ基因对大肠杆菌生长和丙酮酸代谢的影响
宋灿辉，张伟国
（江南大学 工业生物技术教育部重点实验室，无锡 ２１４１２２）
摘　 要：大肠杆菌 ａｃｅＥ基因是编码丙酮酸脱氢酶多酶复合体 ＰｄｈＲ的关键酶之一。 利用 Ｒｅｄ重组系统敲除大肠杆
菌 ＭＧ１６５５ 的 ａｃｅＥ基因后，阻断了丙酮酸流向 ＴＣＡ循环，导致丙酮酸的累积，也使菌体生长受到影响，在培养基中
补加 ５ ｇ ／ Ｌ ＫＡｃ后可以在一定程度上弥补菌株在生长上的缺陷。 摇瓶发酵 ３６ ｈ，ＭＧ１６５５ 没有积累丙酮酸，
ＭＧ１６５５ΔａｃｅＥ∷ｃａｔ菌株可以积累 ２６􀆰 ７７ ｇ ／ Ｌ丙酮酸，为利用大肠杆菌发酵生产丙酮酸奠定了基础。
关键词：ａｃｅＥ；大肠杆菌；丙酮酸；Ｒｅｄ重组
中图分类号：Ｑ８１４　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２ － ３６７８（２０１３）０６ － ００１５ － ０４
Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａｃｅＥ ｇｅｎｅ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｏｎ ｇｒｏｗｉｎｇ ａｎｄ
ｐｙｒｕｖａｔｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｅ． ｃｏｌｉ
ＳＯＮＧ Ｃａｎｈｕｉ，ＺＨＡＮＧ Ｗｅｉｇｕｏ
（Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，Ｊｉａｎｇｎａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｘｉ ２１４１２２， Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｇｅｎｅ ａｃｅＥ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｗａｓ ｏｎｅ ｏｆ ｔｈｅ ｋｅｙ ｅｎｚｙｍｅｓ ｏｆ ｐｙｒｕｖａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｃｏｍｐｌｅｘ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ．
Ｕｓｉｎｇ Ｒｅｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ，ｔｈｅ ｇｅｎｅ ａｃｅＥ ｏｆ Ｅ． ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５ ｗａｓ ｋｎｏｃｋｏｕｔｅｄ ｔｏ ｂｌｏｃｋ ｔｈｅ ｐｙｒｕｖａｔｅ ｆｌｏｗ
ＴＣＡ ｃｙｃｌｅ，ｃａｕｓｉｎｇ ｐｙｒｕｖａｔｅ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｒｏｗｔｈ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ． Ｔｈｅ ｍｅｄｉｕｍ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ ｗｉｔｈ ５ ｇ ／ Ｌ
ＫＯＡｃ ｃｏｕｌｄ ｍａｋｅ ｕｐ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｄｅｆｅｃｔ ｔｏ ａ ｃｅｒｔａｉｎ ｅｘｔｅｎｔ ｓｔｒａｉｎｓ． ＭＧ１６５５ΔａｃｅＥ∷ｃａｔ ｉｎ ｓｈａｋｅ ｆｌａｓｋ
ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｆｏｒ ３６ ｈ ｃｏｕｌｄ ｐｒｏｄｕｃｅ ｐｙｒｕｖａｔｅ ｗｉｔｈ ２６􀆰 ７７ ｇ ／ Ｌ， ｉｎｉｔｉａｌ ｓｔｒａｉｎ ＭＧ１６５５ ｄｉｄ ｎｏｔ ｐｒｏｄｕｃｅ
ｐｙｒｕｖａｔｅ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ａｃｅＥ；Ｅ． ｃｏｌｉ；ｐｙｒｕｖａｔｅ；Ｒｅｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ
　 　 丙酮酸是一种重要的有机中间体，在化工、制
药和农用化学品等工业及科学研究中有着广泛的
用途［１］。 丙酮酸是机体代谢的中间产物，处于糖酵
解途径的末端，同时又连接着己糖磷酸途径（ＥＭＰ）
和三羟酸循环（ＴＣＡ），处于代谢途径中的关键代谢
支点，在细胞中很容易代谢为其他产物，难以积累，
只有切断或弱化丙酮酸的进一步代谢，才能达到使
其在细胞中积累并分泌到胞外的目的［２］。 丙酮酸
脱氢酶（ＰＤＨ）多酶复合体包含了 ３ 种酶：丙酮酸脱
氢酶（Ｅ１ｐ）、二氢硫辛酰转乙酰基酶（Ｅ２ｐ）和二氢
硫辛酸脱氢酶（Ｅ３）。 其中，ａｃｅＥ、ａｃｅＦ 和 ｌｐｄＡ 分别
编码这 ３ 种蛋白［３］。 当敲除 ａｃｅＥ 后，ＰＤＨ 失去将
丙酮酸转化为乙酰 ＣｏＡ的能力，中心代谢途径因为
没有足量的乙酰 ＣｏＡ供应而出现障碍，但是在培养
基中添加一定量的乙酸盐，菌体可以利用乙酸盐合
成乙酰 ＣｏＡ，从而可以弥补生长上的不足［４］，并开始
积累丙酮酸。
目前，用于丙酮酸生产的菌株有酵母、放线菌
和细菌［２］。 工业化生产所用菌株主要是酵母，其中
以球拟酵母的研究和应用最多，发酵所用酵母都为
维生素等多种营养缺陷性，培养基配制比较复杂，
且发酵温度较低，一般在 ３０ ℃左右，发酵周期为
６０ ｈ［５ － ６］。 大肠杆菌最适培养温度为 ３７ ℃，具有发
酵温度高和繁殖速度快等优点。 利用大肠杆菌产
丙酮酸的策略是阻断丙酮酸进入 ＴＣＡ循环，如敲除
ｌｐｄＡ基因可以积累一定量的丙酮酸［７ － ８］。 本文中
笔者主要考察敲除大肠杆菌 ＭＧ１６５５ 的 ａｃｅＥ 基因
对菌体生长和产丙酮酸的影响，以期获得高产丙酮
酸的大肠杆菌菌株，为选育产丙酮酸的工业化生产
菌株奠定基础。
１　 材料和方法
１． １　 菌株和质粒
大肠杆菌 ＭＧ１６５５ （Ｅ． ｃｏｌｉ ｓｔｒ． Ｋ １２ ｓｕｂｓｔｒ．
ＡＴＣＣ ４７０７６）、质粒 ｐＫＤ４６ 和 ｐＫＤ３ 由笔者所在实
验室保藏。
１． ２　 试剂
Ｌ 阿拉伯糖、氨苄青霉素（Ａｍｐ）、氯霉素（Ｃｍ）、
琼脂糖、Ｔｒｉｓ、ＳＤＳ、胶回收试剂盒和基因组提取试剂
盒，上海生工；Ｐｒｉｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ、Ｄｐｎ Ｉ、ＤＬ １５ ０００ 和 ＤＬ
１０ ０００，ＴａＫａＲａ（大连）公司；蛋白胨、酵母膏，Ｄｉｆｉｃｏ公
司；葡糖糖为食品级，ＮａＣｌ、 （ＮＨ４）２ＳＯ４、ＫＨ２ ＰＯ４、
ＭｇＳＯ４·７Ｈ２ Ｏ、ＦｅＳＯ４·７Ｈ２ Ｏ、ＭｎＳＯ４·５Ｈ２ Ｏ、ＮａＯＨ、
ＫＡｃ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２和 ＣａＣｌ２均为市售国产分析纯试剂。
１． ３　 培养基和培养条件
ＬＢ培养基（１ ０００ ｍＬ）：蛋白胨 １０ ｇ，酵母膏 ５
ｇ，ＮａＣｌ １０ ｇ；ｐＨ ７􀆰 ０。
ＳＯＢ培养基（１ ０００ ｍＬ）：蛋白胨 ２０ ｇ，酵母膏 ５
ｇ，ＮａＣｌ ０􀆰 ５ ｇ，１ ｍｏｌ ／ Ｌ ＫＣｌ ２􀆰 ５ ｍＬ；ｐＨ ７􀆰 ０。 灭菌
后，加入 １ ｍｏｌ ／ Ｌ ＭｇＣｌ２ ２０ ｍＬ。
ＳＯＣ培养基（１ ０００ ｍＬ）：蛋白胨 ２０ ｇ，酵母膏 ５
ｇ，ＮａＣｌ ０􀆰 ５ ｇ，１ ｍｏｌ ／ Ｌ ＫＣｌ ２􀆰 ５ ｍＬ；ｐＨ ７􀆰 ０。 灭菌后，
加入 １ ｍｏｌ ／ Ｌ ＭｇＣｌ２ １０ ｍＬ，１ ｍｏｌ ／ Ｌ 葡萄糖 ２０ ｍＬ。
摇瓶种子培养基 （１ ０００ ｍＬ）：葡萄糖 ２５ ｇ，
（ＮＨ４）２ＳＯ４ １５ ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ １ ｇ，酵母膏 ２ ｇ，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ
０􀆰 ５ ｇ，ＦｅＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０􀆰 ０１ ｇ，ＭｎＳＯ４·５Ｈ２Ｏ ０􀆰 ０１ ｇ，ＫＡｃ ５
ｇ，ＣａＣＯ３ ４０ ｇ。 用ＮａＯＨ调 ｐＨ ７􀆰 ０，１２１ ℃灭菌２０ ｍｉｎ。
摇瓶发酵培养基 （１ ０００ ｍＬ）：葡萄糖 ４０ ｇ，
（ＮＨ４）２ＳＯ４ １６ ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ １ ｇ，酵母膏 ２ ｇ，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ
１ ｇ，ＦｅＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０􀆰 ０１ ｇ，ＭｎＳＯ４·５Ｈ２Ｏ ０􀆰 ０１ｇ，ＫＡｃ ５ ｇ，
ＣａＣＯ３ ４０ ｇ。 用 ＮａＯＨ调 ｐＨ ７􀆰 ０，１２１ ℃灭菌 ２０ ｍｉｎ。
摇瓶发酵：装液量为 ２５ ｍＬ（５００ ｍＬ 摇瓶）；用
接种环取两环 ＭＧ１６５５ΔａｃｅＥ∷ｃａｔ 在种子培养基中
培养１２ ｈ，按 ８％的接种量转接于发酵培养基中，培
养３６ ｈ后，葡萄糖消耗完，发酵结束。
大肠杆菌培养条件 ３７ ℃、１００ ｒ ／ ｍｉｎ；氨苄青霉
素使用终质量浓度 １００ μｇ ／ ｍＬ、氯霉素使用终质量
浓度 ２５ μｇ ／ ｍＬ；需要添加 ＫＡｃ 时，加入量为 ５ ｇ ／ Ｌ；
相应固体培养基中添加 ２０ ｇ ／ Ｌ的琼脂。
１． ４　 丙酮酸测定方法
取适当发酵液，稀释 １００倍后，１０ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ离心
５ ｍｉｎ，上清经 ０􀆰 ２２ μｍ滤膜过滤，采用 ＨＰＬＣ测定其
中丙酮酸含量。 ＤＩＯＮＥＸＰ６８０ 型色谱仪（美国戴安公
司）：色谱柱 Ｋｒｏｍａｓｉｌ １００ ５ Ｃ１８ ２５０ ｍｍ ×４􀆰 ６ ｍｍ；流
动相水（含 ０􀆰 ０２ ｍｏｌ ／ Ｌ ＫＨ２ＰＯ４）和乙腈，两者体积比
为 ９０ ∶ １０；流速 ０􀆰 ６ ｍＬ ／ ｍｉｎ；进样量 １０ μＬ；紫外检测
器；检测波长 ２１０ ｎｍ；柱温 ２５ ℃。
１． ５　 ａｃｅＥ的敲除
将 ｐＫＤ４６（Ａｍｒ）化转 ＭＧ１６５５，涂布氨苄平板，在
３０ ℃培养 １２ ｈ后，挑取单菌转接液体 ＬＢ，于３０ ℃培
养 １２ ｈ。 取 １ ｍＬ培养的菌液转接于 １００ ｍＬ 新鲜液
体 ＬＢ中（Ａｍｐ １００ μｇ ／ ｍＬ，Ｌ 阿拉伯糖 １０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ），
于 ３０ ℃培养。 当菌液 ＯＤ６００为 ０􀆰 ２ 时，将 Ｌ 阿拉伯
糖浓度调为 ３０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ，继续培养至 ＯＤ６００为 ０􀆰 ６，将
菌液冰浴 ２０ ｍｉｎ，４ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ、４ ℃离心 １０ ｍｉｎ 收集
菌体，用预冷的 １０％甘油洗涤 ４ 次后，将菌体浓缩为
１ ｍＬ感受态细胞，５０ μＬ分装，于 －２０ ℃保存。
打靶片段 ＭａｃｅＥ 的获得：用引物 ＭａｃｅＥ⁃Ｆ、
ＭａｃｅＥ⁃Ｒ以 ｐＫＤ３ 为模板， ＰＣＲ 扩增出打靶片段
ＭａｃｅＥ，用 Ｄｐｎ Ｉ隔夜消化模板后，胶回收，最后用灭
菌双蒸水洗脱。
电转化体系：５０ μＬ感受态细胞和 １０ μＬ ＭａｃｅＥ
轻柔混匀后，加入电击杯，冰浴 １０ ｍｉｎ。
电转化条件：１ ｍｍ 电击杯，１ ８００ Ｖ，５ ｍｓ，２５
μＦ，２００ Ω。
电转化后，立即加入 １ ｍＬ 预热至 ３７ ℃的 ＳＯＣ
（含有 ５ ｇ ／ Ｌ ＫＡｃ），３７ ℃复苏 ２ ｈ，离心收集菌体后，
浓缩为 ２００ μＬ，涂布于 ２ 个 ＳＯＢ 平板（２５ μｇ ／ ｍＬ
Ｃｍ，２０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ ＭｇＣｌ２，５ ｇ ／ Ｌ ＫＡｃ）。 于 ３７ ℃培养
１６ ｈ后，挑取阳性转化子于 ＳＯＢ 平板并用鉴定引物
ａｃｅＥ⁃Ｆ和 ａｃｅＥ⁃Ｒ 进行菌落 ＰＣＲ，鉴定 ＭａｃｅＥ 是否
重组到 ａｃｅＥ 中。 将菌落 ＰＣＲ 鉴定正确的单菌，切
胶回收 ΔａｃｅＥ片段，进行测序。
６１ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １１ 卷　
表 １　 Ｒｅｄ重组所用的引物
Ｔａｂｌｅ １　 Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｕｓｅｄ ｆｏｒ Ｒｅｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ
引物 ５′→３′
ＭａｃｅＥ⁃Ｆ
ＡＴＧＴＣＡＧＡＡＣＧＴＴＴＣＣＣＡＡＡＴＧＡＣＧ⁃
ＴＧＧＡＴＣＣＧＡＴＣＧＡＡＡＣＴＣＧＣＧＡＣＴＧ⁃
ＣＧＡＴＴＧＴＧＴＡＧＧＣＴＧＧＡＧ
ＭａｃｅＥ⁃Ｒ
ＴＴＡＣＧＣＣＡＧＡＣＧＣＧＧＧＴＴＡＡＣＴＴＴＡ⁃
ＴＣＴＧＣＡＴＣＧＡＴＧＴＴＧＡＡＴＴＴＧＡＡＴＴＡ⁃
ＡＣＧＧＣＴＧＡＣＡＴＧＧＧＡＡＴＴＡＧ
ａｃｅＥ⁃Ｆ ＡＡＴＧＧＧＡＣＡＧＧＴＴＣＣＡＧＡＡＡ
ａｃｅＥ⁃Ｒ ＴＴＴＣＧＡＴＡＧＣＣＡＴＴＡＴＴＣＴＴ
　 注：引物 ＭａｃｅＥ⁃Ｆ和 ＭａｃｅＥ⁃Ｒ有 ２ 部分组成（加粗部分序列分别
为 ａｃｅＥ 的左同源臂 Ｓ１ 和右同源臂 Ｓ２；下划线部分序列为
ｐＫＤ３ 的结合区域 Ｐ１ 和 Ｐ２）；ａｃｅＥ⁃Ｆ和 ａｃｅＥ⁃Ｒ为鉴定引物。
表 ２　 扩增ＭａｃｅＥ的反应体系和条件
Ｔａｂｌｅ ２　 ＰＣＲ ｐｒｏｔｏｃｏｌ ａｎｄ ｐｒｏｇｒａｍ ｆｏｒ
ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＭａｃｅＥ
反应体系 添加量 ／μＬ
反应
步骤
反应
温度 ／ ℃
反应
时间 ／ ｓ
产物长
度 ／ ｂｐ
ＭａｃｅＥ⁃Ｆ ０． ５ Ｓｔｅｐ１ ９４ ３００
ＭａｃｅＥ⁃Ｒ ０． ５ Ｓｔｅｐ２ ９４ ３０
ｐＫＤ３ １ Ｓｔｅｐ３ ５５ ４５
双蒸水 ２３ Ｓｔｅｐ４ ７２ ８０ １ １４６
Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ ２５ Ｓｔｅｐ５ ７２ ６００
Ｔｏｔａｌ ５０ Ｓｔｅｐ６ １０ Ｆｏｒ ｅｖｅｒ
表 ３　 扩增 ａｃｅＥ和 ΔａｃｅＥ∷ｃａｔ的反应体系和条件
Ｔａｂｌｅ ３　 ＰＣＲ ｐｒｏｔｏｃｏｌ ａｎｄ ｐｒｏｇｒａｍ ｆｏｒ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ｏｆ ａｃｅＥ ａｎｄ ΔａｃｅＥ∷ｃａｔ
反应体系 添加量 ／μＬ
反应
步骤
反应
温度 ／ ℃
反应
时间 ／ ｓ
产物长
度 ／ ｂｐ
ａｃｅＥ⁃Ｆ １ Ｓｔｅｐ１ ９４ ３００
ａｃｅＥ⁃Ｒ １ Ｓｔｅｐ２ ９４ ３０
基因组 ＤＮＡ １ Ｓｔｅｐ３ ５５ ３０
双蒸水 ２２ Ｓｔｅｐ４ ７２ １８０
Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ ２５ Ｓｔｅｐ５ ７２ ６００
Ｔｏｔａｌ ５０ Ｓｔｅｐ６ １０ Ｆｏｒ ｅｖｅｒ
　 注：初步筛选 ＭＧ１６５５ΔａｃｅＥ∷ｃａｔ，采用菌落 ＰＣＲ，Ｓｔｅｐ１ 为 ９４ ℃、
１０ ｍｉｎ，Ｓｔｅｐ４ 为 ７２ ℃、１８０ ｓ，敲除成功则扩增出 １ ２２６ ｂｐ 片
段，敲除失败则扩增出 ２ ８００ ｂｐ片段。
ｐＫＤ４６ 的去除：将测序正确的菌落接于 ＬＢ（Ｃｍ
２５ μｇ ／ ｍＬ，ＫＡｃ ５ ｇ ／ Ｌ）中，于 ４２ ℃培养 １２ ｈ 后，在
氯霉素抗性平板上划线培养，将长出的单菌分别点
在氯霉素抗性和氨苄抗性的平板。 挑取在氯霉素
抗性平板长，在氨苄抗性板上不长的菌即为去除
ｐＫＤ４６ 的 ＭＧ１６５５ΔａｃｅＥ∷ｃａｔ。
２　 结果与讨论
２． １　 ａｃｅＥ基因的敲除
利用 Ｒｅｄ重组系统，成功将 ａｃｅＥ基因敲除并鉴
定，结果如图 １ 所示。 由图 １ 可知：用鉴定引物扩增
ＭＧ１６５５ 基因组，能扩增出 ２ ８００ ｐｂ 条带；扩增
ＭＧ１６５５ΔａｃｅＥ∷ｃａｔ 能扩增出 １ ２２６ ｂｐ 条带。 将扩
增出的 １ ２２６ ｂｐ 条带进行胶回收，送往上海生工进
行测序，测序结果显示 Ｃｍ抗性基因 ｃａｔ成功替换掉
了 ａｃｅＥ基因。
Ｍ—ＤＬ １５，０００ ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ；１—ＭａｃｅＥ（１ １４６ ｂｐ）；
２—ＭＧ１６５５ ａｃｅＥ ＰＣＲ产物（２ ８００ ｂｐ）；
３—鉴定菌 ａｃｅＥ ＰＣＲ产物（１ ２２６ ｂｐ）
图 １　 利用 ｐＫＤ３ 敲除 ａｃｅＥ的 ＰＣＲ鉴定
Ｆｉｇ． １　 ＰＣＲ ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｅＥ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｉｎ ＭＧ１６５５
２． ２　 ＫＡｃ对 ＭＧ１６５５ 和 ＭＧ１６５５ΔａｃｅＥ∷ｃａｔ 生长
的影响
　 　 在 ＬＢ 培养基中分别添加 ０、５、１０、１５ 和 ２０ ｇ ／ Ｌ
ＫＡｃ，取ＭＧ１６５５和ＭＧ１６５５ΔａｃｅＥ∷ｃａｔ的隔夜培养物
５００ μＬ转接于 ５０ ｍＬ ＬＢ，培养 １２ ｈ，每隔 ２ ｈ 测定
６００ ｎｍ处的吸光值，绘制生长曲线见图 ２和图 ３。
图 ２　 ＫＡｃ添加量对ＭＧ１６５５ 的影响
Ｆｉｇ． ２　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ＫＡｃ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
ｏｎ ＭＧ１６５５ ｇｒｏｗｔｈ
７１　 第 ６ 期 宋灿辉等：敲除 ａｃｅＥ基因对大肠杆菌生长和丙酮酸代谢的影响
由图 ２可以看出：添加 ＫＡｃ使ＭＧ１６５５的对数期
延迟，随着添加量的增大，进入对数期越晚；添加
５ ｇ ／ Ｌ的 ＫＡｃ 和不添加 ＫＡｃ 的对数期一致，说明 ５
ｇ ／ Ｌ ＫＡｃ的添加量对菌体生长几乎没有抑制作用；添
加 ５、１０、１５和２０ ｇ ／ Ｌ ＫＡｃ后，菌体的生物量分别比未
添加 ＫＡｃ 增加了 １５􀆰 １％、２０􀆰 ９％，２３􀆰 ４％和 １８􀆰 ９％，
说明菌体利用乙酸盐作为 Ｃ 源，有助于生物量的
增加。
图 ３　 ＫＡｃ添加量对ＭＧ１６５５ΔａｃｅＥ∷ｃａｔ生长的影响
Ｆｉｇ． ３　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ＫＡｃ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｎ
ＭＧ１６５５ΔａｃｅＥ∷ｃａｔ ｇｒｏｗｔｈ
由图 ３可知： ａｃｅＥ的缺失，造成丙酮酸不能进入
ＴＣＡ循环，使中心代谢途径出现严重障碍，生长缓慢。
在添加 ５ ｇ ／ Ｌ ＫＡｃ后，在 ４ ｈ后才进入对数期，与图 ２
结果相比，比 ＭＧ１６５５的对数期延迟了约 ２ ｈ；未添加
ＫＡｃ，菌体在 ８ ｈ后也出现增长，可能是菌体利用接种
的 ５００ μＬ过夜培养物中的少量 ＫＡｃ的缘故。
２． ３　 ＭＧ１６５５ΔａｃｅＥ∷ｃａｔ的摇瓶发酵结果
经过３６ ｈ的摇瓶发酵，葡萄糖耗尽，取发酵液测定
丙酮酸的含量。 图 ４为 ＭＧ１６５５和 ＭＧ１６５５ΔａｃｅＥ∷ｃａｔ
发酵液中的丙酮酸 ＨＰＬＣ 分析结果。 由图 ４ 可知：
ＭＧ１６５５发酵液中未检测到丙酮酸，而 ＭＧ１６５５ΔａｃｅＥ∷
ｃａｔ发酵液中含有丙酮酸。 经测定，ＭＧ１６５５ΔａｃｅＥ∷ｃａｔ
发酵液中丙酮酸含量为 ２６􀆰 ７７ ｇ ／ Ｌ。
３　 结　 论
ａｃｅＥ基因的敲除对大肠杆菌生长有严重的负面影
响，需在培养基中添加 ５ ｇ ／ Ｌ 的 ＫＡｃ 以维持生长；
ＭＧ１６５５和ＭＧ１６５５ΔａｃｅＥ∷ｃａｔ在４０ ｇ ／ Ｌ葡萄糖的发酵
培养基中培养 ３６ ｈ 后， ＭＧ１６５５ 不产丙酮酸，
ＭＧ１６５５ΔａｃｅＥ∷ｃａｔ产丙酮酸为 ２６􀆰 ７７ ｇ ／ Ｌ，对葡萄糖转
化率为 ０􀆰 ６７ ｇ ／ ｇ。
在后期的研究中，可以对发酵培养基的葡萄
糖、玉米浆、（ＮＨ４） ２ＳＯ４ 和 ＣａＣＯ３ 的浓度及接种量
进行进一步的优化，以实现丙酮酸的进一步积累。
图 ４　 标准品及ＭＧ１６５５ 和ＭＧ１６５５ΔａｃｅＥ∷ｃａｔ
发酵液 ＨＰＬＣ分析图谱
Ｆｉｇ． ４　 ＨＰＬＣ ｓｔａｎｄａｒｄ ｍｉｘｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｓａｍｐｌｅｓ
ｏｆ ＭＧ１６５５ ａｎｄ ＭＧ１６５５ΔａｃｅＥ∷ｃａｔ
参考文献：
［ １ ］ 　 张宗祥．采用微生物发酵制取丙酮酸的研究［Ｄ］． 南京：南京
理工大学，２００４．
［ ２ ］ 　 刘立明，李寅，堵国成． 生物技术法生产丙酮酸的研究进展
［Ｊ］ ．生物工程学报，２００２，１８（６）：６５１⁃６５５．
［ ３ ］ 　 Ｏｇａｓａｗａｒａ Ｈ， Ｉｓｈｉｄａ Ｙ， Ｙａｍａｄａ Ｋ， ｅｔ ａｌ． ＰｄｈＲ （ ｐｙｒｕｖａｔｅ
ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｃｏｍｐｌｅｘ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ） ｃｏｎｔｒｏｌｓ ｔｈｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ
ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ［ Ｊ］ ． Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，
２００７，１８９（５）：５５３４⁃５５４１．
［ ４ ］ 　 翁志明．用代谢工程构建高产番茄红素大肠杆菌［Ｄ］． 广州：
中山大学，２０１０．
［ ５ ］ 　 Ｌｉｕ Ｌ Ｍ， Ｌｉ Ｙ， Ｄｕ Ｇ Ｃ， ｅｔ ａｌ． Ｂｒｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｈｉｇｈ⁃ｐｙｒｕｖａｔｅ⁃
ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ ｇｌａｂｒａｔａ ｗｉｔｈ ａｃｅｔａｔｅ ａｓ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ｃａｔｂｏｎ
ｓｏｕｒｃｅ［Ｊ］ ． Ｉｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００２，３２（３）：２１⁃２６．
［ ６ ］ 　 杨松鑫，王蒙，汪军．基于光滑球拟酵母环境适应性的丙酮酸
中试条件优化［Ｊ］ ．过程工程学报，２０１１，１１（６）：１０４４⁃１０４９．
［ ７ ］ 　 李迈．不同碳源及通气条件下 ｌｐｄＡ 基因敲除对大肠杆菌代
谢的影响［Ｊ］ ．化工学报，２００６，５７（４）：８８０⁃８８５．
［ ８ ］ 　 王佶．大肠杆菌积累丙酮酸的研究［Ｄ］．杭州：浙江大学，２００８．
８１ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １１ 卷