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Antimicrobial activity and mechanism of silver nitrate on Escherichia coli and Staphylococcus aureus

AgNO3对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌作用及机制



全 文 :第9卷第3期
2011年5月
生 物 加 工 过 程
ChineseJournalofBioprocessEngineering
Vol.9No.3
May2011
doi:10.3969/j.issn.1672-3678.2011.03.011
收稿日期:2010-10-18
基金项目:“十一五”国家科技支撑计划资助项目(2006BAD07A07-08)
作者简介:赵清风(1986—),男,山东临朐人,硕士研究生,研究方向:生物化学与分子生物学;陈介男(联系人),教授,博士生导师,Email:
chenjnx@gmail.com
AgNO3对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的
抗菌作用及机制
赵清风1,2,陈介南1,张 林1,张伟涛1,何 刚1,2
(1.中南林业科技大学 生物环境科学与技术研究所,长沙 410004;
2.中南林业科技大学 生命科学与技术学院,长沙 410004)
摘 要:以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为模式菌,对 AgNO3的抗菌效果进行研究,并对其抗菌机制作初步探讨。
AgNO3对大肠杆菌的抑制生长曲线表明:2891mg/L的 AgNO3能够完全抑制10
6个/mL的大肠杆菌细胞生长,
AgNO3使大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的延滞期加长,并且浓度越高,延滞期越长。另外,AgNO3对大肠杆菌和金黄
色葡萄球菌脱氢酶的活性有明显影响,随着AgNO3浓度的提高,脱氢酶的活性逐渐降低。AgNO3溶液作用于细菌
后,细菌表面疏水性均有不同程度地下降,且浓度越大对其影响也越明显,大肠杆菌的下降程度要大于金黄色葡萄
球菌。
关键词:AgNO3;大肠杆菌;金黄色葡萄球菌
中图分类号:Q599    文献标志码:A    文章编号:1672-3678(2011)03-0052-05
Antimicrobialactivityandmechanismofsilvernitrateon
EscherichiacoliandStaphylococcusaureus
ZHAOQingfeng1,2,CHENJienan1,ZHANGLin1,ZHANGWeitao1,HEGang1,2
(1.InstituteofBiologicalandEnviromentalScienceandTechnology,CentralSouthUniversityofForestryandTechnology,Changsha
410004,China;2.ColegeofLifeScienceandTechnology,CentralSouthUniversityofForestryandTechnology,Changsha410004,China)
Abstract:UsingEscherichiacoliandStaphylococcusaureusasmodelstrains,theantibacterialefectand
themechanismofsilvernitratewereinvestigated.Experimentalresultsindicatedthatthesilvernitrateof
2891mg/mLcouldinhibitcompletelythegrowthof106cfu/mLcelsinliquidLBmedium,andthatsil
vernitrateprolongedthelagphaseofE.coliandS.aureus,thehighertheconcentration,thelongerthe
lagphase.Inaddition,silvernitratehadamarkedefectonthedehydrogenaseactivityofE.coliandS.
aureus,thedehydrogenaseactivitydecreasedastheconcentrationincreased.Thesurfacehydrophobicity
ofbacterialcelsalhadadeclinetosomeextentfolowedthesolutionofsilvernitrateworkedonthebac
teria,andthehighertheconcentration,themoreitsefect.ThedescendingdegreeinE.coliwaslarger
thanthatinS.aureus.
Keywords:silvernitrate;Escherichiacoli;Staphylococcusaureus
  近年来抗生素、杀虫剂和灭菌剂等化学药物
被大量使用,使得微生物耐药性增强,人类健康
和生存环境受到很大的威胁。研发新型抗菌材
料已成为防止微生物灾害事件发生的一种趋势。
无机抗菌材料具有很多优点,如安全性高、持久
性好、耐热性强、不易产生抗药性等,从 20世纪
80年代开始被陆续开发与应用[1-2]。其中,载银
无机抗菌材料由于具有抗菌活性高、抗菌谱广、
毒性低等特点已成为应用最广泛的无机抗菌
材料。
Ag+可以强烈地吸引细菌体中蛋白酶上的巯基
(—SH),迅速与其结合,使蛋白酶丧失活性,导致细
菌死亡。当细菌被 Ag+杀死后,Ag+又从细菌中游
离出来,再与其他菌落接触,不断地进行上述过程,
这也是Ag+能持续杀菌的原因[3-4]。但是,在长期
的环境适应条件下,很多细菌产生了对Ag+的抗性,
这种抗性与细菌对Ag+的有效外排作用以及周质空
间对Ag+的吸收和外膜缺失孔道等机制有关[3]。
对无机载银抗菌材料的抗菌机制以及细菌的抗银
机制进行深入的研究,将为开发更加广谱高效的抗
菌材料提供理论基础。
无机载银抗菌材料主要是通过释放 Ag+来发
挥其抗菌活性的,因此其抗菌机制通常以 Ag+作
为实验材料进行研究。笔者以大肠杆菌和金黄色
葡萄球菌为模式菌,研究 AgNO3对它们的抗菌作
用,以期为无机载银抗菌材料的广泛应用奠定科
学基础。
1 材料与方法
11 实验材料
037mg/mLAgNO3溶液,自配;大肠杆菌(Esche
richiacoli)ATCC8739购自美国菌种保藏中心;金
黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)CICC20235
购自中国工业微生物菌种保藏中心;LB培养基,
自配。
12 实验方法
121 AgNO3的最小抑菌浓度实验
配制质量浓度为370mg/L的AgNO3溶液,然后
按对倍稀释的方法将其依次稀释至初始浓度的1/
512。配备双倍浓度的 LB培养基灭菌处理。在试
管中分别加入25mL不同浓度的抗菌液、25mL
培养基、01mL菌液,置于(37±2)℃的恒温培养箱
培养48h,观察结果。
122 AgNO3对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌生长
曲线的影响
取6个三角瓶分别加入25mL灭菌的双倍 LB
培养基、25mLAgNO3溶液和大肠杆菌菌液,AgNO3
质量浓度分别取 0、0723、1445、2891和 4625
mg/L5个梯度。大肠杆菌密度约为 106个/mL;再
取6个三角瓶,分别加入25mL灭菌的双倍 LB培
养基、25mLAgNO3溶液和金黄色葡萄球菌菌液,
AgNO3质量浓度分别取 0、0723、1445、5781和
4625mg/L5个梯度。金黄色葡萄球菌浓度约106
个/mL。放入(37±2)℃摇床中恒温振荡培养。每
隔一段时间取样,用 UV 5420型分光光度计(日
本岛津)测定 OD600,以培养时间为横坐标,OD600为
纵坐标,绘制生长曲线。
123 AgNO3对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌脱氢
酶活性的影响
取002gAgNO3溶于50mL灭菌蒸馏水中,将其
对倍稀释至原浓度的1/16。将大肠杆菌和金黄色葡萄
球菌分别接入培养基过夜活化;在具塞试管中加入
1mL菌液然后依次加入2mL005mol/L的TrisHCl
缓冲液、2mL01mol/L的葡萄糖溶液、2mL1mg/mL
的氯化三苯基四氮唑(TTC)溶液;在各个试管中分别
加入质量浓度为400、200、100、50和25mg/L的AgNO3
溶液,将其充分混匀后放入37℃恒温箱静置30min加
入2滴浓H2SO4终止反应,分别加入5mL甲苯振荡萃
取产物;取上层有机物4000r/min离心5min,以甲苯
为参比,490nm处比色。
124 AgNO3对细菌细胞表面疏水性的影响
称取AgNO3002g溶于50mL灭菌蒸馏水中,
将其稀释至初始浓度的 1/64、1/128、1/256。配制
双倍浓度的牛肉膏蛋白胨培养基灭菌处理,取 25
mL培养基分别与25mL不同浓度的 AgNO3溶液混
合然后接入1mL菌液。将其放入恒温摇床培养16
h,用01mol/LKNO3(pH62)将静止生长期的细
菌清洗2次,5000r/min离心10min,将沉淀重新
悬于 01mol/LKNO3(pH62),使 OD400 =04
(A0)。用 pH74的 10mmol/L磷酸钠缓冲液
(NAPB)作为对照。取 4mL细菌悬浮液加入 02
mL十六烷,室温下静置10min,然后在旋涡振荡器
振荡混合2min。待混合物完全两相分离后移出水
相并测其 OD400(A1)。细菌吸附百分率以下式计
算:(1-A1/A0)×100%,作为细菌细胞表面疏水性
指标[5]。实验重复2次。
35 第3期 赵清风等:AgNO3对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌作用及机制
2 结果与讨论
21 AgNO3对大肠杆菌以及金黄色葡萄球菌的抑
菌效果
  AgNO3抗菌实验结果如表1所示。从表1可以看
出:AgNO3对大肠杆菌的最小抑菌浓度为2891mg/L,
对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为5781mg/L。
表1 AgNO3最低抑菌浓度实验
Table1 Minimuminhibitoryconcentrationofsilvernitrate
ρ(AgNO3)/
(mg·L-1)
大肠杆菌 金黄色葡萄球菌
1# 2# 1# 2#
185000 - - - -
92500 - - - -
46250 - - - -
23130 - - - -
11560 - - - -
5781 - - - -
2891 - - + +
1445 + + + +
0723 + + + +
  注:+表示有菌体生长;-表示无菌体生长。
22 AgNO3对大肠杆菌及金黄色葡萄球菌生长曲
线的影响
  AgNO3对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制生
长曲线,如图1和图2所示。
图1 AgNO3对大肠杆菌的抑制生长曲线
Fig.1 GrowthcurvesofEscherichiacoliondiferent
concentrationsofsilvernitrate
从图1和图2可以看出:AgNO3质量浓度为0、
0723和1445mg/L时,2种菌的生长均为典型的
生长曲线。与对照组(0mg/L)相比较,可以看出
图2 AgNO3对金黄色葡萄球菌的抑制生长曲线
Fig.2 GrowthcurvesofStaphylococcusaureuson
diferentconcentrationsofsilvernitrate
AgNO3能够使这2种菌的延滞期延长,且 AgNO3浓
度越高延滞期越长。当 AgNO3质量浓度达到
2891、4625mg/L时,大肠杆菌的生长被完全抑
制。当AgNO3质量浓度达到5781、4625mg/L时,
金黄色葡萄球菌的生长被完全抑制。培养至48h
后取样进行平皿培养,均没有长出菌落。因为OD600
测得的是活菌和死菌的总数,所以衰亡期不明显。
图3 AgNO3对大肠杆菌脱氢酶活性的影响
Fig.3 Efectsofsilvernitrateonthedehydrogenase
activityofEscherichiacoli
23 AgNO3对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌脱氢酶
活性的影响结果
  脱氢酶是细菌呼吸代谢过程中所必需的酶,以
脱氢酶催化氯化三苯基四氮唑(TCC)生成三苯基甲
脂(TF)的量即可衡量脱氢酶的活性,从而反映细菌
细胞被破坏的程度[6]。图3为不同浓度的AgNO3对
大肠杆菌脱氢酶活性的影响曲线。图4为不同质量
浓度的AgNO3对金黄色葡萄球菌脱氢酶活性的影响
曲线。从图3和图4中可以看出:2种菌在加入低
浓度的AgNO3溶液时仍然有部分TTC转化为TF,这
说明低浓度的AgNO3并没有使细菌脱氢酶活性完全
丧失,或者说不是所有细菌的活性都受到了抑
制[7],随着 AgNO3浓度的增加,脱氢酶的活性逐渐
45 生 物 加 工 过 程   第9卷 
减弱,由此可知,低浓度的AgNO3溶液能够影响细菌
脱氢酶的活性从而影响细菌的正常生命代谢,当
AgNO3达到一定浓度时,可完全抑制细菌的活性,使
其新陈代谢过程终止从而死亡。
图4 AgNO3对金黄色葡萄球菌脱氢酶活性的影响
Fig.4 Efectsofsilvernitrateonthedehydrogenase
activityofStaphylococcusaureus
24 AgNO3对细菌细胞疏水性的影响
细菌细胞表面同时存在有亲水性位点和疏水
性位点。亲水性位点主要是磷酸基团、羧基、胍基
以及氨基等带电荷的基团,也包括不带电荷的二羟
基基团等;疏水性位点主要是脂多糖、脂类、蛋白
质。影响细胞表面疏水性的因素主要有蛋白、多糖
的比例,细胞外层中碳水化合物与多糖的类型、排
列方向[8]。Im等[9]以重组型乳酸菌与野生型乳酸
菌为模式菌研究发现,细菌的表层蛋白影响细菌表
面的疏水性,通过疏水相互作用增强了细菌对十六
烷的吸附。笔者同样利用十六烷的疏水性以及对
细菌的吸附性来检验AgNO3对细菌细胞表面疏水性
的影响。
图5和图6分别为不同浓度的AgNO3对大肠杆
菌和金黄色葡萄球菌细胞表面疏水性的影响。
AgNO3作用于细菌的第一步是与细菌表面相接触,
带正电荷的银离子与带负电荷的细菌表面脂多糖
相结合,从而影响细菌的表面特性,细菌的表面特
性主要包括表面电荷与表面疏水性[9]。由图 5和
图6可知:经AgNO3处理后2种细菌细胞表面疏水
性均有不同程度的下降。这可能是因为Ag+带正电
荷,吸引细菌表面带负电荷的基团趋向表面分布进
行重排,从而导致细菌表面疏水性下降。从图5和
图6可以看出:AgNO3溶液作用于细菌后,细菌细胞
表面疏水性均有不同程度的下降,且浓度越大影响
也越明显。大肠杆菌的下降程度要大于金黄色葡
萄球菌的下降程度。
图5 AgNO3对大肠杆菌细胞
表面疏水性的影响
Fig.5 Efectsofsilvernitrateonthebacterialcel
surfacechargeofEscherichiacoli
图6 AgNO3对金黄色葡萄球菌
细胞表面疏水性的影响
Fig.6 Efectsofsilvernitrateonthebacterialcel
surfacechargeofStaphylococcusaureus
3 结论
AgNO3溶液能在较低的浓度下抑制细菌生长。
AgNO3使大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长延滞
期加长,并且 AgNO3浓度越高,生长延滞期越长。
较低浓度的 AgNO3溶液并不能使大肠杆菌悬液、
金黄色葡萄球菌细菌脱氢酶的活性完全丧失,但
随着 AgNO3浓度的增加,脱氢酶的活性逐渐减弱
直至完全失活。由此可知:低浓度的 AgNO3溶液
能够影响细菌的正常生命代谢活动,当达到一定
浓度时,即可完全抑制细菌的活性,使其新陈代谢
过程终止。AgNO3溶液作用于细菌后,细菌细胞表
面疏水性均有不同程下降,且浓度越大,对其影响
也越明显。大肠杆菌的下降程度要大于金黄色葡
萄球菌的下降程度。
55 第3期 赵清风等:AgNO3对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌作用及机制
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