全 文 :第9卷第3期
2011年5月
生 物 加 工 过 程
ChineseJournalofBioprocessEngineering
Vol.9No.3
May2011
doi:10.3969/j.issn.1672-3678.2011.03.011
收稿日期:2010-10-18
基金项目:“十一五”国家科技支撑计划资助项目(2006BAD07A07-08)
作者简介:赵清风(1986—),男,山东临朐人,硕士研究生,研究方向:生物化学与分子生物学;陈介男(联系人),教授,博士生导师,Email:
chenjnx@gmail.com
AgNO3对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的
抗菌作用及机制
赵清风1,2,陈介南1,张 林1,张伟涛1,何 刚1,2
(1.中南林业科技大学 生物环境科学与技术研究所,长沙 410004;
2.中南林业科技大学 生命科学与技术学院,长沙 410004)
摘 要:以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为模式菌,对 AgNO3的抗菌效果进行研究,并对其抗菌机制作初步探讨。
AgNO3对大肠杆菌的抑制生长曲线表明:2891mg/L的 AgNO3能够完全抑制10
6个/mL的大肠杆菌细胞生长,
AgNO3使大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的延滞期加长,并且浓度越高,延滞期越长。另外,AgNO3对大肠杆菌和金黄
色葡萄球菌脱氢酶的活性有明显影响,随着AgNO3浓度的提高,脱氢酶的活性逐渐降低。AgNO3溶液作用于细菌
后,细菌表面疏水性均有不同程度地下降,且浓度越大对其影响也越明显,大肠杆菌的下降程度要大于金黄色葡萄
球菌。
关键词:AgNO3;大肠杆菌;金黄色葡萄球菌
中图分类号:Q599 文献标志码:A 文章编号:1672-3678(2011)03-0052-05
Antimicrobialactivityandmechanismofsilvernitrateon
EscherichiacoliandStaphylococcusaureus
ZHAOQingfeng1,2,CHENJienan1,ZHANGLin1,ZHANGWeitao1,HEGang1,2
(1.InstituteofBiologicalandEnviromentalScienceandTechnology,CentralSouthUniversityofForestryandTechnology,Changsha
410004,China;2.ColegeofLifeScienceandTechnology,CentralSouthUniversityofForestryandTechnology,Changsha410004,China)
Abstract:UsingEscherichiacoliandStaphylococcusaureusasmodelstrains,theantibacterialefectand
themechanismofsilvernitratewereinvestigated.Experimentalresultsindicatedthatthesilvernitrateof
2891mg/mLcouldinhibitcompletelythegrowthof106cfu/mLcelsinliquidLBmedium,andthatsil
vernitrateprolongedthelagphaseofE.coliandS.aureus,thehighertheconcentration,thelongerthe
lagphase.Inaddition,silvernitratehadamarkedefectonthedehydrogenaseactivityofE.coliandS.
aureus,thedehydrogenaseactivitydecreasedastheconcentrationincreased.Thesurfacehydrophobicity
ofbacterialcelsalhadadeclinetosomeextentfolowedthesolutionofsilvernitrateworkedonthebac
teria,andthehighertheconcentration,themoreitsefect.ThedescendingdegreeinE.coliwaslarger
thanthatinS.aureus.
Keywords:silvernitrate;Escherichiacoli;Staphylococcusaureus
近年来抗生素、杀虫剂和灭菌剂等化学药物
被大量使用,使得微生物耐药性增强,人类健康
和生存环境受到很大的威胁。研发新型抗菌材
料已成为防止微生物灾害事件发生的一种趋势。
无机抗菌材料具有很多优点,如安全性高、持久
性好、耐热性强、不易产生抗药性等,从 20世纪
80年代开始被陆续开发与应用[1-2]。其中,载银
无机抗菌材料由于具有抗菌活性高、抗菌谱广、
毒性低等特点已成为应用最广泛的无机抗菌
材料。
Ag+可以强烈地吸引细菌体中蛋白酶上的巯基
(—SH),迅速与其结合,使蛋白酶丧失活性,导致细
菌死亡。当细菌被 Ag+杀死后,Ag+又从细菌中游
离出来,再与其他菌落接触,不断地进行上述过程,
这也是Ag+能持续杀菌的原因[3-4]。但是,在长期
的环境适应条件下,很多细菌产生了对Ag+的抗性,
这种抗性与细菌对Ag+的有效外排作用以及周质空
间对Ag+的吸收和外膜缺失孔道等机制有关[3]。
对无机载银抗菌材料的抗菌机制以及细菌的抗银
机制进行深入的研究,将为开发更加广谱高效的抗
菌材料提供理论基础。
无机载银抗菌材料主要是通过释放 Ag+来发
挥其抗菌活性的,因此其抗菌机制通常以 Ag+作
为实验材料进行研究。笔者以大肠杆菌和金黄色
葡萄球菌为模式菌,研究 AgNO3对它们的抗菌作
用,以期为无机载银抗菌材料的广泛应用奠定科
学基础。
1 材料与方法
11 实验材料
037mg/mLAgNO3溶液,自配;大肠杆菌(Esche
richiacoli)ATCC8739购自美国菌种保藏中心;金
黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)CICC20235
购自中国工业微生物菌种保藏中心;LB培养基,
自配。
12 实验方法
121 AgNO3的最小抑菌浓度实验
配制质量浓度为370mg/L的AgNO3溶液,然后
按对倍稀释的方法将其依次稀释至初始浓度的1/
512。配备双倍浓度的 LB培养基灭菌处理。在试
管中分别加入25mL不同浓度的抗菌液、25mL
培养基、01mL菌液,置于(37±2)℃的恒温培养箱
培养48h,观察结果。
122 AgNO3对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌生长
曲线的影响
取6个三角瓶分别加入25mL灭菌的双倍 LB
培养基、25mLAgNO3溶液和大肠杆菌菌液,AgNO3
质量浓度分别取 0、0723、1445、2891和 4625
mg/L5个梯度。大肠杆菌密度约为 106个/mL;再
取6个三角瓶,分别加入25mL灭菌的双倍 LB培
养基、25mLAgNO3溶液和金黄色葡萄球菌菌液,
AgNO3质量浓度分别取 0、0723、1445、5781和
4625mg/L5个梯度。金黄色葡萄球菌浓度约106
个/mL。放入(37±2)℃摇床中恒温振荡培养。每
隔一段时间取样,用 UV 5420型分光光度计(日
本岛津)测定 OD600,以培养时间为横坐标,OD600为
纵坐标,绘制生长曲线。
123 AgNO3对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌脱氢
酶活性的影响
取002gAgNO3溶于50mL灭菌蒸馏水中,将其
对倍稀释至原浓度的1/16。将大肠杆菌和金黄色葡萄
球菌分别接入培养基过夜活化;在具塞试管中加入
1mL菌液然后依次加入2mL005mol/L的TrisHCl
缓冲液、2mL01mol/L的葡萄糖溶液、2mL1mg/mL
的氯化三苯基四氮唑(TTC)溶液;在各个试管中分别
加入质量浓度为400、200、100、50和25mg/L的AgNO3
溶液,将其充分混匀后放入37℃恒温箱静置30min加
入2滴浓H2SO4终止反应,分别加入5mL甲苯振荡萃
取产物;取上层有机物4000r/min离心5min,以甲苯
为参比,490nm处比色。
124 AgNO3对细菌细胞表面疏水性的影响
称取AgNO3002g溶于50mL灭菌蒸馏水中,
将其稀释至初始浓度的 1/64、1/128、1/256。配制
双倍浓度的牛肉膏蛋白胨培养基灭菌处理,取 25
mL培养基分别与25mL不同浓度的 AgNO3溶液混
合然后接入1mL菌液。将其放入恒温摇床培养16
h,用01mol/LKNO3(pH62)将静止生长期的细
菌清洗2次,5000r/min离心10min,将沉淀重新
悬于 01mol/LKNO3(pH62),使 OD400 =04
(A0)。用 pH74的 10mmol/L磷酸钠缓冲液
(NAPB)作为对照。取 4mL细菌悬浮液加入 02
mL十六烷,室温下静置10min,然后在旋涡振荡器
振荡混合2min。待混合物完全两相分离后移出水
相并测其 OD400(A1)。细菌吸附百分率以下式计
算:(1-A1/A0)×100%,作为细菌细胞表面疏水性
指标[5]。实验重复2次。
35 第3期 赵清风等:AgNO3对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌作用及机制
2 结果与讨论
21 AgNO3对大肠杆菌以及金黄色葡萄球菌的抑
菌效果
AgNO3抗菌实验结果如表1所示。从表1可以看
出:AgNO3对大肠杆菌的最小抑菌浓度为2891mg/L,
对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为5781mg/L。
表1 AgNO3最低抑菌浓度实验
Table1 Minimuminhibitoryconcentrationofsilvernitrate
ρ(AgNO3)/
(mg·L-1)
大肠杆菌 金黄色葡萄球菌
1# 2# 1# 2#
185000 - - - -
92500 - - - -
46250 - - - -
23130 - - - -
11560 - - - -
5781 - - - -
2891 - - + +
1445 + + + +
0723 + + + +
注:+表示有菌体生长;-表示无菌体生长。
22 AgNO3对大肠杆菌及金黄色葡萄球菌生长曲
线的影响
AgNO3对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制生
长曲线,如图1和图2所示。
图1 AgNO3对大肠杆菌的抑制生长曲线
Fig.1 GrowthcurvesofEscherichiacoliondiferent
concentrationsofsilvernitrate
从图1和图2可以看出:AgNO3质量浓度为0、
0723和1445mg/L时,2种菌的生长均为典型的
生长曲线。与对照组(0mg/L)相比较,可以看出
图2 AgNO3对金黄色葡萄球菌的抑制生长曲线
Fig.2 GrowthcurvesofStaphylococcusaureuson
diferentconcentrationsofsilvernitrate
AgNO3能够使这2种菌的延滞期延长,且 AgNO3浓
度越高延滞期越长。当 AgNO3质量浓度达到
2891、4625mg/L时,大肠杆菌的生长被完全抑
制。当AgNO3质量浓度达到5781、4625mg/L时,
金黄色葡萄球菌的生长被完全抑制。培养至48h
后取样进行平皿培养,均没有长出菌落。因为OD600
测得的是活菌和死菌的总数,所以衰亡期不明显。
图3 AgNO3对大肠杆菌脱氢酶活性的影响
Fig.3 Efectsofsilvernitrateonthedehydrogenase
activityofEscherichiacoli
23 AgNO3对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌脱氢酶
活性的影响结果
脱氢酶是细菌呼吸代谢过程中所必需的酶,以
脱氢酶催化氯化三苯基四氮唑(TCC)生成三苯基甲
脂(TF)的量即可衡量脱氢酶的活性,从而反映细菌
细胞被破坏的程度[6]。图3为不同浓度的AgNO3对
大肠杆菌脱氢酶活性的影响曲线。图4为不同质量
浓度的AgNO3对金黄色葡萄球菌脱氢酶活性的影响
曲线。从图3和图4中可以看出:2种菌在加入低
浓度的AgNO3溶液时仍然有部分TTC转化为TF,这
说明低浓度的AgNO3并没有使细菌脱氢酶活性完全
丧失,或者说不是所有细菌的活性都受到了抑
制[7],随着 AgNO3浓度的增加,脱氢酶的活性逐渐
45 生 物 加 工 过 程 第9卷
减弱,由此可知,低浓度的AgNO3溶液能够影响细菌
脱氢酶的活性从而影响细菌的正常生命代谢,当
AgNO3达到一定浓度时,可完全抑制细菌的活性,使
其新陈代谢过程终止从而死亡。
图4 AgNO3对金黄色葡萄球菌脱氢酶活性的影响
Fig.4 Efectsofsilvernitrateonthedehydrogenase
activityofStaphylococcusaureus
24 AgNO3对细菌细胞疏水性的影响
细菌细胞表面同时存在有亲水性位点和疏水
性位点。亲水性位点主要是磷酸基团、羧基、胍基
以及氨基等带电荷的基团,也包括不带电荷的二羟
基基团等;疏水性位点主要是脂多糖、脂类、蛋白
质。影响细胞表面疏水性的因素主要有蛋白、多糖
的比例,细胞外层中碳水化合物与多糖的类型、排
列方向[8]。Im等[9]以重组型乳酸菌与野生型乳酸
菌为模式菌研究发现,细菌的表层蛋白影响细菌表
面的疏水性,通过疏水相互作用增强了细菌对十六
烷的吸附。笔者同样利用十六烷的疏水性以及对
细菌的吸附性来检验AgNO3对细菌细胞表面疏水性
的影响。
图5和图6分别为不同浓度的AgNO3对大肠杆
菌和金黄色葡萄球菌细胞表面疏水性的影响。
AgNO3作用于细菌的第一步是与细菌表面相接触,
带正电荷的银离子与带负电荷的细菌表面脂多糖
相结合,从而影响细菌的表面特性,细菌的表面特
性主要包括表面电荷与表面疏水性[9]。由图 5和
图6可知:经AgNO3处理后2种细菌细胞表面疏水
性均有不同程度的下降。这可能是因为Ag+带正电
荷,吸引细菌表面带负电荷的基团趋向表面分布进
行重排,从而导致细菌表面疏水性下降。从图5和
图6可以看出:AgNO3溶液作用于细菌后,细菌细胞
表面疏水性均有不同程度的下降,且浓度越大影响
也越明显。大肠杆菌的下降程度要大于金黄色葡
萄球菌的下降程度。
图5 AgNO3对大肠杆菌细胞
表面疏水性的影响
Fig.5 Efectsofsilvernitrateonthebacterialcel
surfacechargeofEscherichiacoli
图6 AgNO3对金黄色葡萄球菌
细胞表面疏水性的影响
Fig.6 Efectsofsilvernitrateonthebacterialcel
surfacechargeofStaphylococcusaureus
3 结论
AgNO3溶液能在较低的浓度下抑制细菌生长。
AgNO3使大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长延滞
期加长,并且 AgNO3浓度越高,生长延滞期越长。
较低浓度的 AgNO3溶液并不能使大肠杆菌悬液、
金黄色葡萄球菌细菌脱氢酶的活性完全丧失,但
随着 AgNO3浓度的增加,脱氢酶的活性逐渐减弱
直至完全失活。由此可知:低浓度的 AgNO3溶液
能够影响细菌的正常生命代谢活动,当达到一定
浓度时,即可完全抑制细菌的活性,使其新陈代谢
过程终止。AgNO3溶液作用于细菌后,细菌细胞表
面疏水性均有不同程下降,且浓度越大,对其影响
也越明显。大肠杆菌的下降程度要大于金黄色葡
萄球菌的下降程度。
55 第3期 赵清风等:AgNO3对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌作用及机制
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269274.
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日本开发出高效培养心肌细胞的方法
日本一个研究小组开发出了利用诱导多功能干细胞(iPS细胞)高效培养心肌细胞的方法,今后如果能
够利用这一方法大量培养心肌细胞,将可用于恢复因心肌梗死而受损的心脏功能。京都大学 iPS细胞研究
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培养的心肌细胞与人类心脏心室细胞拥有同样的性质和结构。相关论文已刊登在美国科学杂志《公共科学
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英国爱丁堡大学的科学家在实验室中利用人的羊水和动物的胚胎细胞培育出了人体肾脏,其长度同未
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直希望能用人体干细胞培育出功能性的器官,现在,我们制造出了和正常的胎儿肾脏一样复杂的事物。”戴
维斯表示,新技术将于10年左右应用于人体。
(胡晓丽)
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