全 文 :第7卷第1期
2009年1月
生 物 加 工 过 程
ChineseJournalofBioprocessEngineering
Vol.7No.1
Jan.2009
收稿日期:20080521
基金项目:合肥工业大学科学研究发展基金资助项目(060604F)
作者简介:于 莹(1983—),女,河南开封人,硕士研究生,研究方向:微生物发酵及酶工程;姚日生(联系人),教授,Email:yaors@163.com
绿色木霉 ZY1固态发酵产纤维素酶
于 莹1,姚日生1,2,齐本坤1,朱慧霞1,2
(1.合肥工业大学 化学工程学院,合肥 230009;
2.合肥工业大学 农产品生物化工教育部工程研究中心,合肥 230009)
摘 要:利用筛选的绿色木霉ZY1(TrichodermavirideZY1)固态发酵产纤维素酶,采用稻草和麸皮为底物,考察稻
草与麸皮比例随发酵时间对产酶的影响。结果表明:底物中,在 m(稻草)∶m(麸皮)为0∶5和1∶4时,发酵48h,pH
保持45左右,还原糖量急剧上升,胞外蛋白产量最低;仅以稻草作底物时,整个发酵过程中pH约为7,还原糖量最
低,胞外蛋白产量较高而滤纸酶活、羧甲基纤维素酶(CMCase)和 β-葡萄糖苷酶(βGase)酶活均较低;在
m(稻草)∶m(麸皮)为3∶2时,发酵96h,滤纸酶活达最大值501U/g干曲;m(稻草):m(麸皮)为1∶4时,发酵96h,
βGase酶活达最大值46U/g干曲;m(稻草):m(麸皮)为4∶1时,发酵72h,CMCase酶活达最大值601U/g干曲。
因此,底物中存在适量的稻草和麸皮有利于TrichodermavirideZY1产纤维素酶。
关键词:纤维素酶;酶活;稻草;固态发酵;麸皮
中图分类号:Q5393 文献标志码:A 文章编号:1672-3678(2009)01-0054-05
CelulaseproductionbyTrichodermavirideZY1undersolidstatefermentation
YUYing1,YAORisheng1,2,QIBenkun1,ZHUHuixia1,2
(1.SchoolofChemicalEngineering,HefeiUniversityofTechnology,Hefei230009,China;
2.EngineeringResearchCenterofBioprocessofMinistryofEducation,HefeiUniversityofTechnology,Hefei230009,China)
Abstract:CelulasewasproducedundersolidstatefermentationbyTrichodermavirideZY1usingwheat
branandstrawasasubstrate.Theratioefectsofthericestrawtowheatbranoncelulaseproductionwas
studied.Theresultsshowedthatathigherconcentrationofwheat,bran,viz.thequalitativeratioofthe
ricestrawtothewheatbranwas0∶5and1∶4,afterincubationfor48handpHremainedat45,the
concentrationofextracelularproteinwasthelowest,theconcentrationofreducingsugarswasthehigh
est,andactivitiesoffilterpapercelulase(FPase),carboxymethylcelulase(CMCase),andβglucosi
dase(βGase)werelow.WhenricestrawwasusedassolesubstrateandpHremainedat7,theconcen
trationofreducingsugarswasthelowest,buttheconcentrationsofextracelularproteinwashigh,the
FPase,CMCase,andβGaseactivitieswerelow.Astheratioofthericestrawtothewheatbranwas3∶
2and1∶4,theactivitiesofFPaseandβGasereachedthehighest,i.e.501U/gdriedsubstrateand
46U/gdriedsubstrate,respectively.Astheratioofthericestrawtothewheatbranwas4∶1,andfer
mentationtimewas72h,CMCaseactivityreachedthehighestat601U/gdriedsubstrate.
Keywords:celulase;enzymeactivity;ricestraw;solidstatefermentation;wheatbran
生物转化可再生的、廉价的、来源丰富的纤维
原料生产乙醇和乳酸等产品,已成为近年来的研究
热点[1-2]。
固体发酵技术有着悠久的历史,一直都被用于
白酒和食品添加剂等生产中[3-4]。目前用于生产纤
维素酶的真菌中,绿色木霉是产纤维素酶较高的一
种,它生长在纤维原料表面,通过菌丝分泌纤维素
酶系来降解纤维素[5],且霉菌一般喜欢在潮湿的固
体基质上生长[6]。霉菌固态发酵产纤维素酶的量
和活力均比液态发酵的高[7]。用作固态发酵的支
持物和/或营养物以及底物是一些工农业废弃物,
如稻草、玉米秸秆、甘蔗渣、玉米芯等[8]。在固态发
酵中使用废弃残渣不但可以解决这些物质累积污
染的问题,而且还降低固态发酵的成本。
本文对实验室分离筛选的 Trichodermaviride
ZY1固态发酵产纤维素酶进行研究,以稻草和麸皮
为底物,考察稻草麸皮比例对产酶的影响,初步揭
示稻草和麸皮在产酶中的作用,期望为进一步降低
纤维素酶的生产成本提供依据。
1 材料与方法
11 实验材料
111 菌种
TrichodermavirideZY1由本课题组筛选得到。
112 试剂与药品
稻草、麸皮,65℃烘干至恒质量,过80目筛备
用;葡萄糖,蛋白胨,酵母膏,(NH4)2SO4,KH2PO4,
CaCl2等试剂均是市售生化试剂或分析纯。
113 仪器
GL20GⅡ型冷冻离心机(上海市安亭科学仪
器厂),WFZ800D3B型紫外可见分光光度计(北京
瑞利分析仪器厂),PHS3CT型酸度计(上海大中分
析仪器厂)。
114 培养基
PDA培养基(g/L):马铃薯 200,葡萄糖 20,琼
脂 20。自然pH。
固态发酵培养基:5g不同比例的 m(稻草)∶
m(麸皮)=(0∶5)~(5∶0),营养盐溶液125mL,其成
分(g/L)为(NH4)2SO410,KH2PO44,MgSO4·7H2O05,
CaCl205。起始pH调为6,底物含水质量分数为75%。
12 实验方法
121 固态发酵
接种T.virideZY1菌种于PDA平板,30℃恒温
培养5d;向平板加无菌水9mL制成孢子悬液,并调
整孢子密度为107个/mL,取此孢子悬液2mL接种于
固态发酵产纤维素酶培养基,30℃恒温培养6d。
122 粗酶液提取
粗酶液提取方法见文献[9]。
123 酶活测定方法
滤纸酶、羧甲基纤维素酶(CMCase)、β-葡萄糖
苷酶(βGase)酶活测定和酶活计算方法均按照文献
[10]进行。以3,5-二硝基水杨酸(DNS)钝化的粗
酶液作为空白对照。
124 还原糖测定方法
还原糖测定见文献[10]。
125 胞外蛋白含量的测定。
考马斯亮蓝G250染色法
[10]。
2 结果与分析
21 稻草麸皮比例对 pH、还原糖时间进程和产胞
外蛋白的影响
通过考察稻草麸皮比例对pH、还原糖时间进程
和产胞外蛋白的影响来分析三者对 Trichoderma
virideZY1产酶的影响。
底物中稻草和麸皮都存在的情况下,pH在24h
后急剧下降(图1(a)),可能是木霉在生长过程中
产生的有机酸所致。发酵48h后,当 m(稻草)∶m
(麸皮)为2∶3、3∶2和4∶1时,pH逐渐上升;当底物中
麸皮含量高(m(稻草)∶m(麸皮)为0∶5和1∶4)时,
pH降至约为45而几乎不再随发酵进程变化;非常
明显的是底物中仅有稻草时,整个发酵过程中体系
的pH保持在7左右。
稻草麸皮比例对还原糖时间进程的影响结果
见图1(b),在m(稻草)∶m(麸皮)为0∶5和1∶4时,
发酵48h后,还原糖质量浓度急剧增加且在96h达
到最大,分别为688mg/mL和668mg/mL,其他比
例的还原糖量随着麸皮含量的降低而降低。由此
可见,图1(a)中高稻草比例体系的 pH在发酵过程
中或发酵后期较其他体系的高并接近中性的原因
只可能是:在葡萄糖缺乏或不足的情况下,或者说
在高稻草比例体系中,木霉利用了体系中的有机酸
作C源,使得酸量减少以致pH上升。
稻草麸皮比例对绿色木霉产胞外蛋白量的影
响结果见图1(c),当 m(稻草)∶m(麸皮)为0∶5和
1∶4时的胞外蛋白产量变化曲线相似且产量都较
低;在其比例为2∶3、3∶2和4∶1时,三者胞外蛋白
55 第1期 于 莹等:绿色木霉ZY1固态发酵产纤维素酶
产量变化趋势也相似且产量都较高,仅以稻草为
发酵底物时蛋白产量也较高;发酵120h后,所有
比例产胞外蛋白量均开始下降,则可能是胞外蛋
白被水解所致。同时,结合图 1(b)的结果可知,
能够高产还原糖的体系蛋白表达总量小,即所产
蛋白总量中水解纤维二糖或小分子糖的酶所占比
例较大;而低还原糖量的体系蛋白表达总量大,也
就是说,底物中稻草比例的增大促进了其他酶(可
能是纤维素酶)的产生,通过以上分析,底物中稻
草和麸皮含量的变化对所产胞外蛋白中纤维素酶
的影响还需要进一步研究。
图1 不同稻草麸皮比例对pH、还原糖时间进程和产胞外酶的影响
Fig.1 TheratioefectsofricestrawandwheatbranonthetimecourseofpH(a),concentrationsof
reducingsugars(b)andextracelularproteinconcentration(c)YL001
图2 不同稻草麸皮比例对产滤纸酶活(a)、羧甲基纤维素酶活(b)和β-葡萄糖苷酶活(c)的影响
Fig.2 TheratioefectsofricestrawandwheatbranonFPase(a),CMCase(b)andβGase(c)activity
22 稻草麸皮比例对固态发酵产酶的影响
221 稻草麸皮比例对产滤纸酶的影响
对一些真菌而言,在固态培养基中添加麸皮
对纤维素酶有负面影响,Kang等[11]研究发现曲霉
Aniger单独以稻草为底物固态发酵产纤维素酶是
以稻草和麸皮的混合物为底物产酶量的 18倍。
由图 2(a)可以看出,本实验室筛选的绿色木霉
ZY1以稻草和麸皮为底物产纤维素酶与 Kang
等[11]研究的 Aniger结果不同。图2(a)显示,底
物中麸皮含量高时(m(稻草)∶m(麸皮)为0∶5和
1∶4),滤纸酶活较低;仅以稻草作为底物时,滤纸
酶活最低;在 m(稻草)∶m(麸皮)为3∶2发酵96h
时,每克干曲中滤纸酶活达到最大值501U,说明
稻草底物中添加适量的麸皮有利于产酶,而仅以
稻草作为底物酶活最低,其原因只可能是木霉无
法得到充足的营养物质所致。在稻草培养基中添
加麸皮有利于T.virideZY1产酶但对 Aniger产
酶有负面作用,其原因可能是两种真菌水解稻草
的程度不同所致。
222 稻草麸皮比例对产羧甲基纤维素酶(CM
Case)的影响
由图2(b)可以看出,底物中只含有稻草或麸皮
含量高时(m(稻草)∶m(麸皮)为0∶5和1∶4),酶活
均较低;当其比例为4∶1发酵72h时,每克干曲中
CMCase酶活达最大值601U。由图2(b)还可以看
出,CMCase酶活的变化都表现出先上升后下降的趋
势,这可能是由于高酶活的 CMCase同时使麸皮或
稻草表面糖化,纤维素水解葡萄糖或纤维二糖与
65 生 物 加 工 过 程 第7卷
CMCase结合形成非竞争性抑制而使得 CMCase酶
活下降。
223 稻草麸皮比例对产β-葡萄糖苷酶的影响
由图2(c)可见,当m(稻草)∶m(麸皮)为0∶5、
1∶4和2∶3时,βGase酶活均较高,且其比例为1∶4和
2∶3发酵96h时,βGase酶活达最大值,分别为46
U/g干曲和 45U/g干曲,这也许是 m(稻草)∶
m(麸皮)为0∶5和1∶4体系高产还原糖的根本原因。
继续增加底物中的稻草含量时,酶活则下降,最低
值出现在比例为5∶0。不同真菌酶活最大值可能在
不同比例出现,而 Jatinder等[12]对 S.thermophilum
产酶进行优化研究,发现在m(稻草)∶m(麸皮)比例
为1∶3和45℃的条件下,才出现酶活最大值。
综合图1和图2结果发现,底物中麸皮含量高
时,滤纸酶活较低,随着稻草比例的增加,滤纸酶活
增大,最大值出现在3∶2时,说明稻草能诱导滤纸酶
的产生。在其比例为4∶1发酵72h时,CMCase酶活
达最大,这一方面是因为发酵72h时,比例为4∶1的
培养基中还原糖量最低(高浓度的还原糖量会抑制
木霉产酶);其次,大量稻草的存在诱导了 CMCase
的产生。已有相关报道指出[13],纤维素酶是一种诱
导酶,稻草是一种纤维素含量高的底物,它能够诱
导纤维素酶的产生。虽稻草能诱导滤纸酶和 CM
Case的产生,但底物中仅有稻草时,滤纸酶活和
CMCase酶活均最低,其原因只可能是培养基中无充
足的营养物质(还原糖量最低)所致,说明稻草底物
中存在适量的麸皮为木霉提供充足的营养物质从
而有利于纤维素酶的产生。当 m(稻草)∶m(麸皮)
为2∶3、3∶2和4∶1时,底物中三者的pH、还原糖量和
胞外蛋白产量变化曲线相似,且胞外蛋白产量相差
不大,而滤纸酶活和 CMCase酶活分别在不同比例
达到最大值,说明不同的稻草麸皮比例对产滤纸酶
和CMCase有不同的促进作用。
βGase酶活在m(稻草)∶m(麸皮)为1∶4,发酵
96h时达最大值,由图1可知:底物中大量麸皮的存
在可能会诱导水解纤维二糖和小分子多糖酶的产
生;另外,由图 2(c)看出:βGase比酶活高
(m(稻草)∶m(麸皮)为0∶5和1∶4)是体系高产还原
糖的根本原因;以上说明,大量麸皮的存在可诱导
βGase的产生。但是,当底物中只有麸皮存在时,β
Gase比酶活并不是最大,这是因为底物中仅有麸皮
时可能会使培养基的疏松程度降低,而底物中存在
稻草时,它可以作为木霉的生长支架,从而增加培
养基的通气量;另外,麸皮本身含有易被 βGase水
解的淀粉,即培养基中高浓度的还原糖阻遏了酶的
产生。
3 结 论
通过考察不同稻草麸皮比例对TvirideZY1产
酶的影响发现,当底物中只含有稻草或麸皮时,每
克干曲中滤纸酶活、CMCase和 βGase酶活分别都
低于21U、45U、36U,当底物中稻草和麸皮都存
在的情况下,即在m(稻草)∶m(麸皮)分别为 3∶2、
1∶4和 4∶1时,每克干曲中滤纸酶活达 501U、
βGase酶活达 46U和CMCase酶活达 601U。因
此,底物中存在适量的稻草和麸皮有利于 Tviride
ZY1产酶。另外,也可以通过调整稻草麸皮比例来
控制纤维素酶中不同酶酶活的大小变化,从而为进
一步研究纤维素酶和纤维素酶工业化生产提供
依据。
参考文献:
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櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒
13.
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(文伟河)
85 生 物 加 工 过 程 第7卷