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Cellulase production by Trichoderma viride

绿色木霉ZY-1固态发酵产纤维素酶



全 文 :第7卷第1期
2009年1月
生 物 加 工 过 程
ChineseJournalofBioprocessEngineering
Vol.7No.1
Jan.2009
收稿日期:20080521
基金项目:合肥工业大学科学研究发展基金资助项目(060604F)
作者简介:于 莹(1983—),女,河南开封人,硕士研究生,研究方向:微生物发酵及酶工程;姚日生(联系人),教授,Email:yaors@163.com
绿色木霉 ZY1固态发酵产纤维素酶
于 莹1,姚日生1,2,齐本坤1,朱慧霞1,2
(1.合肥工业大学 化学工程学院,合肥 230009;
2.合肥工业大学 农产品生物化工教育部工程研究中心,合肥 230009)
摘 要:利用筛选的绿色木霉ZY1(TrichodermavirideZY1)固态发酵产纤维素酶,采用稻草和麸皮为底物,考察稻
草与麸皮比例随发酵时间对产酶的影响。结果表明:底物中,在 m(稻草)∶m(麸皮)为0∶5和1∶4时,发酵48h,pH
保持45左右,还原糖量急剧上升,胞外蛋白产量最低;仅以稻草作底物时,整个发酵过程中pH约为7,还原糖量最
低,胞外蛋白产量较高而滤纸酶活、羧甲基纤维素酶(CMCase)和 β-葡萄糖苷酶(βGase)酶活均较低;在
m(稻草)∶m(麸皮)为3∶2时,发酵96h,滤纸酶活达最大值501U/g干曲;m(稻草):m(麸皮)为1∶4时,发酵96h,
βGase酶活达最大值46U/g干曲;m(稻草):m(麸皮)为4∶1时,发酵72h,CMCase酶活达最大值601U/g干曲。
因此,底物中存在适量的稻草和麸皮有利于TrichodermavirideZY1产纤维素酶。
关键词:纤维素酶;酶活;稻草;固态发酵;麸皮
中图分类号:Q5393    文献标志码:A    文章编号:1672-3678(2009)01-0054-05
CelulaseproductionbyTrichodermavirideZY1undersolidstatefermentation
YUYing1,YAORisheng1,2,QIBenkun1,ZHUHuixia1,2
(1.SchoolofChemicalEngineering,HefeiUniversityofTechnology,Hefei230009,China;
2.EngineeringResearchCenterofBioprocessofMinistryofEducation,HefeiUniversityofTechnology,Hefei230009,China)
Abstract:CelulasewasproducedundersolidstatefermentationbyTrichodermavirideZY1usingwheat
branandstrawasasubstrate.Theratioefectsofthericestrawtowheatbranoncelulaseproductionwas
studied.Theresultsshowedthatathigherconcentrationofwheat,bran,viz.thequalitativeratioofthe
ricestrawtothewheatbranwas0∶5and1∶4,afterincubationfor48handpHremainedat45,the
concentrationofextracelularproteinwasthelowest,theconcentrationofreducingsugarswasthehigh
est,andactivitiesoffilterpapercelulase(FPase),carboxymethylcelulase(CMCase),andβglucosi
dase(βGase)werelow.WhenricestrawwasusedassolesubstrateandpHremainedat7,theconcen
trationofreducingsugarswasthelowest,buttheconcentrationsofextracelularproteinwashigh,the
FPase,CMCase,andβGaseactivitieswerelow.Astheratioofthericestrawtothewheatbranwas3∶
2and1∶4,theactivitiesofFPaseandβGasereachedthehighest,i.e.501U/gdriedsubstrateand
46U/gdriedsubstrate,respectively.Astheratioofthericestrawtothewheatbranwas4∶1,andfer
mentationtimewas72h,CMCaseactivityreachedthehighestat601U/gdriedsubstrate.
Keywords:celulase;enzymeactivity;ricestraw;solidstatefermentation;wheatbran
  生物转化可再生的、廉价的、来源丰富的纤维
原料生产乙醇和乳酸等产品,已成为近年来的研究
热点[1-2]。
  固体发酵技术有着悠久的历史,一直都被用于
白酒和食品添加剂等生产中[3-4]。目前用于生产纤
维素酶的真菌中,绿色木霉是产纤维素酶较高的一
种,它生长在纤维原料表面,通过菌丝分泌纤维素
酶系来降解纤维素[5],且霉菌一般喜欢在潮湿的固
体基质上生长[6]。霉菌固态发酵产纤维素酶的量
和活力均比液态发酵的高[7]。用作固态发酵的支
持物和/或营养物以及底物是一些工农业废弃物,
如稻草、玉米秸秆、甘蔗渣、玉米芯等[8]。在固态发
酵中使用废弃残渣不但可以解决这些物质累积污
染的问题,而且还降低固态发酵的成本。
  本文对实验室分离筛选的 Trichodermaviride
ZY1固态发酵产纤维素酶进行研究,以稻草和麸皮
为底物,考察稻草麸皮比例对产酶的影响,初步揭
示稻草和麸皮在产酶中的作用,期望为进一步降低
纤维素酶的生产成本提供依据。
1 材料与方法
11 实验材料
111 菌种
  TrichodermavirideZY1由本课题组筛选得到。
112 试剂与药品
  稻草、麸皮,65℃烘干至恒质量,过80目筛备
用;葡萄糖,蛋白胨,酵母膏,(NH4)2SO4,KH2PO4,
CaCl2等试剂均是市售生化试剂或分析纯。
113 仪器
  GL20GⅡ型冷冻离心机(上海市安亭科学仪
器厂),WFZ800D3B型紫外可见分光光度计(北京
瑞利分析仪器厂),PHS3CT型酸度计(上海大中分
析仪器厂)。
114 培养基
  PDA培养基(g/L):马铃薯 200,葡萄糖 20,琼
脂 20。自然pH。
  固态发酵培养基:5g不同比例的 m(稻草)∶
m(麸皮)=(0∶5)~(5∶0),营养盐溶液125mL,其成
分(g/L)为(NH4)2SO410,KH2PO44,MgSO4·7H2O05,
CaCl205。起始pH调为6,底物含水质量分数为75%。
12 实验方法
121 固态发酵
  接种T.virideZY1菌种于PDA平板,30℃恒温
培养5d;向平板加无菌水9mL制成孢子悬液,并调
整孢子密度为107个/mL,取此孢子悬液2mL接种于
固态发酵产纤维素酶培养基,30℃恒温培养6d。
122 粗酶液提取
  粗酶液提取方法见文献[9]。
123 酶活测定方法
  滤纸酶、羧甲基纤维素酶(CMCase)、β-葡萄糖
苷酶(βGase)酶活测定和酶活计算方法均按照文献
[10]进行。以3,5-二硝基水杨酸(DNS)钝化的粗
酶液作为空白对照。
124 还原糖测定方法
  还原糖测定见文献[10]。
125 胞外蛋白含量的测定。
  考马斯亮蓝G250染色法
[10]。
2 结果与分析
21 稻草麸皮比例对 pH、还原糖时间进程和产胞
外蛋白的影响
  通过考察稻草麸皮比例对pH、还原糖时间进程
和产胞外蛋白的影响来分析三者对 Trichoderma
virideZY1产酶的影响。
  底物中稻草和麸皮都存在的情况下,pH在24h
后急剧下降(图1(a)),可能是木霉在生长过程中
产生的有机酸所致。发酵48h后,当 m(稻草)∶m
(麸皮)为2∶3、3∶2和4∶1时,pH逐渐上升;当底物中
麸皮含量高(m(稻草)∶m(麸皮)为0∶5和1∶4)时,
pH降至约为45而几乎不再随发酵进程变化;非常
明显的是底物中仅有稻草时,整个发酵过程中体系
的pH保持在7左右。
  稻草麸皮比例对还原糖时间进程的影响结果
见图1(b),在m(稻草)∶m(麸皮)为0∶5和1∶4时,
发酵48h后,还原糖质量浓度急剧增加且在96h达
到最大,分别为688mg/mL和668mg/mL,其他比
例的还原糖量随着麸皮含量的降低而降低。由此
可见,图1(a)中高稻草比例体系的 pH在发酵过程
中或发酵后期较其他体系的高并接近中性的原因
只可能是:在葡萄糖缺乏或不足的情况下,或者说
在高稻草比例体系中,木霉利用了体系中的有机酸
作C源,使得酸量减少以致pH上升。
  稻草麸皮比例对绿色木霉产胞外蛋白量的影
响结果见图1(c),当 m(稻草)∶m(麸皮)为0∶5和
1∶4时的胞外蛋白产量变化曲线相似且产量都较
低;在其比例为2∶3、3∶2和4∶1时,三者胞外蛋白
55 第1期 于 莹等:绿色木霉ZY1固态发酵产纤维素酶
产量变化趋势也相似且产量都较高,仅以稻草为
发酵底物时蛋白产量也较高;发酵120h后,所有
比例产胞外蛋白量均开始下降,则可能是胞外蛋
白被水解所致。同时,结合图 1(b)的结果可知,
能够高产还原糖的体系蛋白表达总量小,即所产
蛋白总量中水解纤维二糖或小分子糖的酶所占比
例较大;而低还原糖量的体系蛋白表达总量大,也
就是说,底物中稻草比例的增大促进了其他酶(可
能是纤维素酶)的产生,通过以上分析,底物中稻
草和麸皮含量的变化对所产胞外蛋白中纤维素酶
的影响还需要进一步研究。
图1 不同稻草麸皮比例对pH、还原糖时间进程和产胞外酶的影响
Fig.1 TheratioefectsofricestrawandwheatbranonthetimecourseofpH(a),concentrationsof
reducingsugars(b)andextracelularproteinconcentration(c)YL001
图2 不同稻草麸皮比例对产滤纸酶活(a)、羧甲基纤维素酶活(b)和β-葡萄糖苷酶活(c)的影响
Fig.2 TheratioefectsofricestrawandwheatbranonFPase(a),CMCase(b)andβGase(c)activity
22 稻草麸皮比例对固态发酵产酶的影响
221 稻草麸皮比例对产滤纸酶的影响
  对一些真菌而言,在固态培养基中添加麸皮
对纤维素酶有负面影响,Kang等[11]研究发现曲霉
Aniger单独以稻草为底物固态发酵产纤维素酶是
以稻草和麸皮的混合物为底物产酶量的 18倍。
由图 2(a)可以看出,本实验室筛选的绿色木霉
ZY1以稻草和麸皮为底物产纤维素酶与 Kang
等[11]研究的 Aniger结果不同。图2(a)显示,底
物中麸皮含量高时(m(稻草)∶m(麸皮)为0∶5和
1∶4),滤纸酶活较低;仅以稻草作为底物时,滤纸
酶活最低;在 m(稻草)∶m(麸皮)为3∶2发酵96h
时,每克干曲中滤纸酶活达到最大值501U,说明
稻草底物中添加适量的麸皮有利于产酶,而仅以
稻草作为底物酶活最低,其原因只可能是木霉无
法得到充足的营养物质所致。在稻草培养基中添
加麸皮有利于T.virideZY1产酶但对 Aniger产
酶有负面作用,其原因可能是两种真菌水解稻草
的程度不同所致。
222 稻草麸皮比例对产羧甲基纤维素酶(CM
Case)的影响
  由图2(b)可以看出,底物中只含有稻草或麸皮
含量高时(m(稻草)∶m(麸皮)为0∶5和1∶4),酶活
均较低;当其比例为4∶1发酵72h时,每克干曲中
CMCase酶活达最大值601U。由图2(b)还可以看
出,CMCase酶活的变化都表现出先上升后下降的趋
势,这可能是由于高酶活的 CMCase同时使麸皮或
稻草表面糖化,纤维素水解葡萄糖或纤维二糖与
65 生 物 加 工 过 程   第7卷 
CMCase结合形成非竞争性抑制而使得 CMCase酶
活下降。
223 稻草麸皮比例对产β-葡萄糖苷酶的影响
  由图2(c)可见,当m(稻草)∶m(麸皮)为0∶5、
1∶4和2∶3时,βGase酶活均较高,且其比例为1∶4和
2∶3发酵96h时,βGase酶活达最大值,分别为46
U/g干曲和 45U/g干曲,这也许是 m(稻草)∶
m(麸皮)为0∶5和1∶4体系高产还原糖的根本原因。
继续增加底物中的稻草含量时,酶活则下降,最低
值出现在比例为5∶0。不同真菌酶活最大值可能在
不同比例出现,而 Jatinder等[12]对 S.thermophilum
产酶进行优化研究,发现在m(稻草)∶m(麸皮)比例
为1∶3和45℃的条件下,才出现酶活最大值。
  综合图1和图2结果发现,底物中麸皮含量高
时,滤纸酶活较低,随着稻草比例的增加,滤纸酶活
增大,最大值出现在3∶2时,说明稻草能诱导滤纸酶
的产生。在其比例为4∶1发酵72h时,CMCase酶活
达最大,这一方面是因为发酵72h时,比例为4∶1的
培养基中还原糖量最低(高浓度的还原糖量会抑制
木霉产酶);其次,大量稻草的存在诱导了 CMCase
的产生。已有相关报道指出[13],纤维素酶是一种诱
导酶,稻草是一种纤维素含量高的底物,它能够诱
导纤维素酶的产生。虽稻草能诱导滤纸酶和 CM
Case的产生,但底物中仅有稻草时,滤纸酶活和
CMCase酶活均最低,其原因只可能是培养基中无充
足的营养物质(还原糖量最低)所致,说明稻草底物
中存在适量的麸皮为木霉提供充足的营养物质从
而有利于纤维素酶的产生。当 m(稻草)∶m(麸皮)
为2∶3、3∶2和4∶1时,底物中三者的pH、还原糖量和
胞外蛋白产量变化曲线相似,且胞外蛋白产量相差
不大,而滤纸酶活和 CMCase酶活分别在不同比例
达到最大值,说明不同的稻草麸皮比例对产滤纸酶
和CMCase有不同的促进作用。
  βGase酶活在m(稻草)∶m(麸皮)为1∶4,发酵
96h时达最大值,由图1可知:底物中大量麸皮的存
在可能会诱导水解纤维二糖和小分子多糖酶的产
生;另外,由图 2(c)看出:βGase比酶活高
(m(稻草)∶m(麸皮)为0∶5和1∶4)是体系高产还原
糖的根本原因;以上说明,大量麸皮的存在可诱导
βGase的产生。但是,当底物中只有麸皮存在时,β
Gase比酶活并不是最大,这是因为底物中仅有麸皮
时可能会使培养基的疏松程度降低,而底物中存在
稻草时,它可以作为木霉的生长支架,从而增加培
养基的通气量;另外,麸皮本身含有易被 βGase水
解的淀粉,即培养基中高浓度的还原糖阻遏了酶的
产生。
3 结 论
  通过考察不同稻草麸皮比例对TvirideZY1产
酶的影响发现,当底物中只含有稻草或麸皮时,每
克干曲中滤纸酶活、CMCase和 βGase酶活分别都
低于21U、45U、36U,当底物中稻草和麸皮都存
在的情况下,即在m(稻草)∶m(麸皮)分别为 3∶2、
1∶4和 4∶1时,每克干曲中滤纸酶活达 501U、
βGase酶活达 46U和CMCase酶活达 601U。因
此,底物中存在适量的稻草和麸皮有利于 Tviride
ZY1产酶。另外,也可以通过调整稻草麸皮比例来
控制纤维素酶中不同酶酶活的大小变化,从而为进
一步研究纤维素酶和纤维素酶工业化生产提供
依据。
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85 生 物 加 工 过 程   第7卷