全 文 ：第 １１ 卷第 ４ 期
２０１３ 年 ７ 月
生　 物　 加　 工　 过　 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ． １１ Ｎｏ． ４
Ｊｕｌ． ２０１３
ｄｏｉ：１０． ３９６９ ／ ｊ． ｉｓｓｎ． １６７２ － ３６７８． ２０１３． ０４． ００２
收稿日期：２０１２ － ０５ － ０４
基金项目：国家自然科学基金（２１００６０４９）； 国家科技支撑计划（２０１１ＢＡＤ２３Ｂ０３）； 江苏高校优势学科建设工程
作者简介：邓中涛（１９８７—），男，安徽寿县人，硕士研究生，研究方向：代谢工程与生物分离工程；纪晓俊（联系人），副教授，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｘｉａｏｊｕｎｊｉ＠
ｎｊｕｔ． ｅｄｕ． ｃｎ
高山被孢霉三阶段培养法生产花生四烯酸油脂
邓中涛，纪晓俊，聂志奎，颜佳铖，黄　 和
（南京工业大学 生物与制药工程学院 材料化学工程国家重点实验室，南京 ２１０００９）
摘　 要：为提高高山被孢霉（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）生物合成花生四烯酸油脂的生产效率，基于花生四烯酸油脂的积累机
制，建立了一种三阶段培养法：第一阶段在全培养基中培养促进菌体生物量的快速积累，确定了 ６０ ｇ ／ Ｌ糖初始质量浓
度时，最有利于生物量的快速积累；第二阶段在 Ｃ源丰富而其他营养缺乏的条件下培养，促进油脂快速积累，对糖最
佳初始浓度、接种时间、ｐＨ和培养时间进行了优化；第三阶段培养诱导油脂中花生四烯酸的高效积累，并确定此阶段
培养时间为 ３６ ｈ时为最佳时间。 实验结果表明：三阶段培养工艺条件下，菌体生物量、油脂量、花生四烯酸量分别为
４１􀆰 ６、２６􀆰 ６和 １１􀆰 ４ ｇ ／ Ｌ，本研究相比传统分批发酵工艺在产率和花生四烯酸最终产量方面都有了显著提高。
关键词：花生四烯酸油脂；微生物油脂；高山被孢霉；三阶段培养
中图分类号：Ｑ９３９． ９７　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２ － ３６７８（２０１３）０４ － ０００８ － ０６
Ｈｉｇｈ⁃ｌｅｖｅｌ ａｒａｃｈｉｄｏｎｉｃ ａｃｉｄ⁃ｒｉｃｈ ｏｉｌ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ
ｔｈｏｕｇｈ ｔｈｒｅｅ⁃ｓｔａｇｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｓｔｒａｔｅｇｙ
ＤＥＮＧ Ｚｈｏｎｇｔａｏ，ＪＩ Ｘｉａｏｊｕｎ，ＮＩＥ Ｚｈｉｋｕｉ，ＹＡＮ Ｊｉａｃｈｅｎｇ，ＨＵＡＮＧ Ｈｅ
（Ｓｔａｔｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ⁃Ｏｒｉｅｎｔｅｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ
Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｎａｎｊｉｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ ２１０００９，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ｔｈｅ ｒａｔｅ ｏｆ ａｒａｃｈｉｄｏｎｉｃ ａｃｉｄ （ＡＲＡ） ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ａ ｔｈｒｅｅ⁃ｓｔａｇｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ
ｓｔｒａｔｅｇｙ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｂｙ Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ，ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ＡＲＡ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ． Ｉｎ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｓｔａｇｅ，
ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ ｆｏｒ ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｎｕｔｒｉｅｎｔ⁃ｒｉｃｈ ｍｅｄｉｕｍ． Ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ ｃｅｌｌ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｗａｓ
ｏｂｔａｉｎｅｄ ｗｈｅｎ ｔｈｅ ｉｎｉｔｉａｌ ｇｌｕｃｏｓｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｗａｓ ６０ ｇ ／ Ｌ ｏｆ ｔｈｅ ｎｕｔｒｉｅｎｔ⁃ｒｉｃｈ ｍｅｄｉｕｍ． Ｉｎ ｔｈｅ ｓｅｃｏｎｄ ｓｔａｇｅ，ｃｅｌｌｓ
ｗｅｒｅ ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ ｔｏ ａｃｈｉｅｖｅ ｈｉｇｈ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｌｉｐｉｄ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ｇｌｕｃｏｓｅ⁃ｒｉｃｈ ｍｅｄｉｕｍ ｗｉｔｈｏｕｔ ｏｔｈｅｒ ｎｕｔｒｉｅｎｔｓ．
Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｇｌｕｃｏｓｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ｔｈｅ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ａｇｅ，ｐＨ ａｎｄ ｃｕｌｔｕｒｅ ｔｉｍｅ ｏｎ ｌｉｐｉｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｗｅｒｅ
ｓｔｕｄｉｅｄ ａｎｄ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ． Ｉｎ ｔｈｅ ｌａｓｔ ｓｔａｇｅ，ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ ｔｏ ａｃｈｉｅｖｅ ｈｉｇｈ ＡＲＡ ｃｏｎｔｅｎｔｓ． Ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔａｇｅ，
ＡＲＡ ｒａｐｉｄ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｗａｓ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｍｅｄｉｕｍ ｗｉｔｈｏｕｔ ｇｌｕｃｏｓｅ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｎｕｔｒｉｔｉｏｎｓ，ａｎｄ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ
ＡＲＡ ｃｏｎｔｅｎｔ ｗａｓ ｒｅａｃｈｅｄ ｗｈｅｎ ｔｈｅ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｗａｓ ３６ ｈ． Ａｆｔｅｒ ｔｈｒｅｅ⁃ｓｔａｇｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｔｈｅ ｄｒｙ ｃｅｌｌ
ｗｅｉｇｈｔ，ｔｏｔａｌ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ａｎｄ ＡＲＡ ｒｅａｃｈｅｄ ４１􀆰 ６，２６􀆰 ６ ａｎｄ １１􀆰 ４ ｇ ／ Ｌ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ
ｔｈｅ ｂａｔｃｈ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｈａｄ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ． Ｔｈｉｓ ｗａｓ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ｕｓｉｎｇ ａ ｔｈｒｅｅ⁃ｓｔａｇｅ
ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｉｎ ＡＲＡ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ， ａｎｄ ｉｔ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ａｐｐｌｉｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｏｔｈｅｒ ｓｉｍｉｌａｒ ｏｌｅａｇｉｎｏｕｓ
ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｔｏ ａｃｈｉｅｖｅ ｈｉｇｈ ｒｅｌａｔｅｄ ＰＵＦＡｓ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ａｒａｃｈｉｄｏｎｉｃ ａｃｉｄ；ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｌｉｐｉｄ；Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ；ｔｈｒｅｅ⁃ｓｔａｇｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ
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　 　 花生四烯酸（ａｒａｃｈｉｄｏｎｉｃ ａｃｉｄ，ＡＲＡ，即 ５，８，１１，
１４ 二十碳四烯酸）属于 ｎ ６ 系列长链多不饱和脂
肪酸（ＰＵＦＡｓ），是人体中含量最高、分布最广和最活
跃的一种必需 ＰＵＦＡｓ［１］。 作为前列腺素、环前列腺
素和白三烯类等类二十烷酸的直接前体［２ － ３］，具有
多种生物活性［４］，在促进智力发育、提高人体视力、
降低血脂、增强免疫力和抗癌等方面具有重要作
用［１］，因此在生物医药、化妆品、功能性食品和保健
品等领域具有广泛的应用［５］。
由于花生四烯酸在成年人体内合成量极少，并
且在婴幼儿体内因缺少相应的酶而无法合成，因此
从食物中摄取花生四烯酸对人体许多组织，特别是
脑组织的生长发育至关重要。 花生四烯酸的传统
来源是动物肝脏、猪肾上腺、蛋黄、深海鱼油［６］，但
动物组织中的花生四烯酸含量很低（质量分数约为
０． ２％ ），来源少，且受季节限制，价格昂贵，无法满
足日益增长的市场需求［７］。 而微生物发酵法生产
ＡＲＡ因其具有生产周期短、生产所占空间小，不受
原料、产地和季节限制等明显的优势和潜力而受到
重视［８］。 高山被孢霉（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）是世界上
最常用的 ＡＲＡ 生产菌株，围绕着高山被孢霉发酵法
生产 ＡＲＡ，国内外开展了多方面的研究工作，主要
集中在培养基的优化、菌种的筛选和关键酶的探索
等方面。
工业化生产 ＡＲＡ仍存在发酵过程难以控制，饱
和、单不饱和脂肪酸含量过高以及葡萄糖转化率低
等诸多问题。 Ｐｅｎｇ 等［９］报道了培养基中 Ｃ 源和其
他营养物质丰富的情况下，有利于菌体生物量的快
速积累的研究。 Ｓａｊｂｉｄｏｒ 等［１０］、Ｋｏｉｋｅ 等［１１］研究发
现，在 Ｎ源限制的条件下微生物油脂积累速度得到
显著提高，其机制也已经被系统的研究和阐
述［１２ － １３］。 另外，限制 Ｐ 源、Ｓ 源等有利于微生物油
脂积累也已有报道［１４ － １６］。 ２０１１ 年 Ｌｉｎ 等［１７］报道了
通过对 Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ ｓｔａｒｋｅｙｉ 的发酵液进行离心处理
后，进行双阶段培养生产生物柴油，取得了显著的
效果。 表明 Ｌ． ｓｔａｒｋｅｙｉ在 Ｃ源丰富的条件下，限制培
养基其他营养成分，会使油脂大量积累。
在以往的生物合成法产花生四烯酸实验中，通
常采用一步发酵法，即细胞增殖、油脂和花生四烯
酸的积累在同一培养液中进行。 然而在发酵过程
中，不同的阶段对营养成分的需求可能是不同的，
在初始阶段，培养液中 Ｎ 源对细胞快速增殖具有很
重要的影响；在中期油脂积累阶段，Ｎ源或其他营养
因子的限制对油脂的快速积累是必需的。 另外，发
酵过程中，生物量、油脂和花生四烯酸的积累在各
阶段可能是相互联系又相互独立的。 在此基础上，
笔者根据微生物油脂积累机制，结合 Ｃ 源和其他营
养成分对各阶段的影响，研究了三阶段培养法合成
花生四烯酸油脂的方法，以提高各阶段反应速率为
目标，对各阶段进行精确调控，以期提高花生四烯
酸油脂的生产效益。
１　 材料与方法
１． １　 菌株
高山被孢霉（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）ＭＥ １，由本实
验室保藏。
１． ２　 培养基及培养方法
种子在斜面 ＰＤＡ培养基上 ２５ ℃培养 ７ ～ ８ ｄ。
斜面培养基成分为（ｇ ／ Ｌ）土豆 ２００、葡萄糖 ２０、
琼脂 ２５；从斜面接入 ２５０ ｍＬ 种子摇瓶中进行种子
培养，摇瓶装液量为 ２０％ （体积分数）。
种子培养基成分（ｇ ／ Ｌ）：葡萄糖 ３０， 酵母膏 ６，
ＫＨ２ＰＯ４ ３、ＮａＮＯ３３、ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０􀆰 ５。
第一阶段进行最佳菌体量和最佳菌体得率的
培养。 通过选择最佳的葡萄糖初始浓度，并且保证
其他营养物质充足的情况下，以 １０％的接种量接到
５００ ｍＬ装有葡萄糖质量浓度分别为 ４０、６０、８０ 和
１００ ｇ ／ Ｌ的全培养基的摇瓶中培养，摇瓶装液量为
２０％ （体积分数），发酵培养基其他营养成分（ｇ ／ Ｌ）：
酵母膏 １１、ＫＨ２ ＰＯ４ ３􀆰 ８、ＮａＮＯ３ ３􀆰 ４、ＭｇＳＯ４·７Ｈ２ Ｏ
０􀆰 ５、泛酸钙 ０􀆰 ５、维生素 Ｂ６ ０􀆰 ２。
第二阶段进行促进油脂快速积累的培养。 菌
体收集方法：将第一阶段发酵液在无菌超净台中移
入灭菌后的 ５０ ｍＬ 离心管中，密封，在 ３ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ
下离心 ３ ｍｉｎ，返回无菌超净台用 ７５％酒精对离心
管外壁杀菌，然后去除上清，用无菌生理盐水洗涤，
洗涤重悬后在同样条件下离心，重复洗涤离心 ２ 次，
收集菌体。 菌体收集后于 ５００ ｍＬ摇瓶中培养，摇瓶
最终装液量为 ２０％ （体积分数），考察不同初始葡萄
糖浓度、接种时间、初始 ｐＨ 和培养时间等条件对油
脂积累的影响。
第三阶段进行花生四烯酸含量的快速积累。
在 Ｃ源缺乏的条件下培养，将油脂积累阶段的菌体
收集，收集方法同上，于 ５００ ｍＬ 装有生理盐水的摇
瓶中培养，摇瓶最终装液量为 ２０％ （体积分数），分
析优化培养时间，以提高花生四烯酸占总脂肪酸的
９　 第 ４ 期 邓中涛等：高山被孢霉三阶段培养法生产花生四烯酸油脂
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比例。
培养条件均为温度 ２５ ℃、转速 １２５ ｒ ／ ｍｉｎ、培养
时间 １８ ～ ２４ ｈ；所有培养基均在 １１５ ℃条件下灭菌
３０ ｍｉｎ；所有数据均为 ２ 个平行样的均值。
１． ３　 分析方法
１）葡萄糖浓度的测定　 利用生物传感仪 ＳＢＡ
４０Ｃ（山东省科学院生物研究所）测定，单位为 ｇ ／ Ｌ，
本文所指的糖浓度均为葡萄糖的质量浓度。
２）ｐＨ的测量　 利用 ＰＨＳ ３Ｃ精密 ｐＨ计测定。
３）生物量的测定　 采用菌丝体干质量法测定。
将发酵液抽滤，并用蒸馏水洗涤 ２ 次，抽干后，６０ ℃
烘干至恒质量，称质量。 生物量计算见式（１）。
Ｗ ＝ｍ ／ Ｖ （１）
式中：Ｗ 为生物量，ｇ ／ Ｌ；ｍ 为菌体干质量，ｇ；Ｖ 为发
酵液体积，Ｌ。
生物量生产强度计算见式（２）。
ｑ ＝Ｗ ／ ｔ （２）
式中：ｑ 为生物量生产强度，ｇ ／ （ Ｌ·ｈ）； ｔ 为培养时
间，ｈ。
４）油脂的提取 　 用索氏提取法提取油脂。 油
脂浓度计算见公式（３）。
Ｙ ＝ｍ１ ／ Ｖ （３）
式中：Ｙ为油脂质量浓度，ｇ ／ Ｌ；ｍ１ 为油脂质量，ｇ；Ｖ
为发酵液体积，Ｌ。
１． ４　 花生四烯酸含量的测量
混合脂肪酸甲酯的制备：取干菌体 ０􀆰 １ ｇ 于 ５
ｍＬ离心管中，加入 ２ ｍＬ色谱专用正己烷和 ０􀆰 ２ ｍＬ
４ ｍｏｌ ／ Ｌ ＫＯＨ 甲醇溶液，摇匀，静置 １０ ｍｉｎ。 ３ ０００
ｒ ／ ｍｉｎ下离心 ３ ｍｉｎ，取 ０􀆰 ３ ｍＬ上清液于 １􀆰 ５ ｍＬ 离
心管中，再加入 ０􀆰 ５ ｍＬ 去离子水摇匀，３ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ
下离心 ３ ｍｉｎ。 取上层清液 ０􀆰 ０５ ｍＬ于 １􀆰 ５ ｍＬ离心
管中加入 ０􀆰 ８ ｍＬ 色谱纯正己烷，再加入少许无水
Ｎａ２ＳＯ４（用于吸水），取 １ μＬ进样。
ＧＣ ＭＳ检测条件：用 Ｔｈｅｒｍｏ ｆｉｎｎｉｇａｎ ｔｒａｃｅ ＧＣ
２０００ ＤＳＱ 气相色谱质谱联用仪测定菌油组成。
ＤＢ ５ＭＳ石英毛细管柱 （３０ ｍ × ０􀆰 ２５ ｍｍ × ０􀆰 ２５
μｍ）。 进样室温度 ２５０ ℃，载气为 Ｈｅ，载气流速 １
ｍＬ ／ ｍｉｎ。 程序升温：初温 ８０ ℃，以 ４０ ℃ ／ ｍｉｎ 升温
到 ２００ ℃，然后 １０ ℃ ／ ｍｉｎ 升温到 ３００ ℃。 传输线
温度 ２５０ ℃，电离方式 ＥＩ，７０ ｅＶ，扫描范围 ５０ ～ ６００
ａｕｍ。 花生四烯酸含量计算见式（４）。
Ａ ＝ ｐ ／Ｍ （４）
式中：Ａ为花生四烯酸含量，％ ；ｐ 为花生四烯酸在
ＧＣ ＭＳ中的积分面积；Ｍ 为油脂在 ＧＣ ＭＳ 中的
积分面积。
花生四烯酸浓度（Ｈ）计算见式（５）。
Ｈ ＝ ＡＹ （５）
花生四烯酸生产强度（Ｘ）计算见式（６）。
Ｘ ＝ ＡＹ ／ ｔ （６）
２　 结果与讨论
２． １　 生物量积累阶段的研究
在生物量积累阶段营养元素起着很大的作
用，而葡萄糖作为 Ｃ 源是主要的营养元素，不同的
初始葡萄糖浓度对发酵过程影响很大，本文在生
物量积累阶段重点考察葡糖糖浓度对生物量积累
的影响。 通过实验将种子液分别接种到初糖质量
浓度为 ４０、６０、８０ 和 １００ ｇ ／ Ｌ 的全培养基中培养，
结果如表 １ 所示。
表 １　 初始糖质量浓度对 Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ
积累生物量的影响
Ｔａｂｌｅ １　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｉｎｉｔｉａｌ ｇｌｕｃｏｓｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｎ
ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ
ρ（葡萄糖） ／
（ｇ·Ｌ － １）
ρ（残糖） ／
（ｇ·Ｌ － １）
培养时间 ／
ｈ
生物量 ／
（ｇ·Ｌ － １）
生物量
生产强度 ／
（ｇ·Ｌ － １·ｈ － １）
４０ ０ ４８ ２０． ７ ０． ４３
６０ ０ ６０ ２７． ４３ ０． ４６
８０ ０ １２０ ３１． ２ ０． ２６
１００ ４３ １６８ ３３． ９ ０． ２０
由表 １ 可知：生物量随着糖初始浓度的升高而
升高，在 １００ ｇ ／ Ｌ时达到 ３３􀆰 ９ ｇ ／ Ｌ，但随着葡萄糖浓
度的升高葡萄糖耗尽所需要的时间也越长。 在糖
初始质量浓度分别为 ４０、６０ 和 ８０ ｇ ／ Ｌ时，其残糖耗
完的时间逐渐增长，分别为 ４８、６０ 和 １２０ ｈ，当糖初
始质量浓度增加到 １００ ｇ ／ Ｌ时，经过 １６８ ｈ的培养残
糖也没有耗完（４３ ｇ ／ Ｌ）；在 ６０ ｇ ／ Ｌ 后，生物量的生
产强度随着糖初始浓度的升高而降低，主要原因可
能是高糖浓度抑制了菌体的生长［１８］，在 １００ ｇ ／ Ｌ 时
菌体量的生产强度最低，为 ０􀆰 ２０ ｇ ／ （Ｌ·ｈ），而在糖
初始质量浓度（６０ ｇ ／ Ｌ）时菌体生产强度达到 ０􀆰 ４６
ｇ ／ （Ｌ·ｈ），此时生物量为 ２７􀆰 ４３ ｇ ／ Ｌ。 综合考虑生物
量的大小和生产强度的强弱，发现 ６０ ｇ ／ Ｌ 初始葡萄
糖是最佳生物量积累浓度。
０１ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １１ 卷　
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２． ２　 油脂积累阶段的研究
油脂积累阶段是在生物量培养阶段之后，于 Ｃ
源存在，而其他营养元素匮乏（通过离心操作，见培
养方法部分所述）的条件下进行，通过考察糖浓度、
接种时间、ｐＨ和培养时间对油脂积累阶段的影响，
寻找油脂积累阶段的最佳培养条件。
２． ２． １　 葡萄糖浓度对油脂积累的影响
在菌体生物量积累培养阶段后，收集菌体，分别
在不同初始浓度的葡萄糖（４０、６０、８０、１００、１２０ ｇ ／ Ｌ）
溶液中培养 ６０ ｈ后，结果见图 １。
图 １　 葡萄糖初始浓度对 Ｍ． ａｌｐｉｎａ积累
花生四烯酸油脂的影响
Ｆｉｇ． １　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｉｎｉｔｉａｌ ｇｌｕｃｏｓｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｎ
ｌｉｐｉｄ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｂｙ Ｍ． ａｌｐｉｎａ
由图 １ 可知，４０ ｇ ／ Ｌ 的葡萄糖溶液中的糖质量
已经被耗完，而在 ６０、８０、１００、１２０ ｇ ／ Ｌ 的糖初始浓
度下残糖分别为 １３、３６、５３ 和 ７８ ｇ ／ Ｌ。 油脂质量浓
度变化方面，随着糖初始质量浓度的增加先略有上
升然后下降，在 ６０ ｇ ／ Ｌ的葡萄糖溶液中的油脂质量
浓度最高，为 ２７􀆰 ９ ｇ ／ Ｌ。 通过比较，虽然在 ４０ ｇ ／ Ｌ
葡萄糖溶液中的油脂质量浓度（２５􀆰 ２５ ｇ ／ Ｌ）没有在
６０ ｇ ／ Ｌ葡萄糖溶液中的油脂质量浓度（２７􀆰 ９ ｇ ／ Ｌ）
高，但其残糖容易耗完，有利于缩短培养周期，所以
选择 ４０ ｇ ／ Ｌ为合适的糖初始质量浓度。 在糖初始
质量浓度为 １２０ ｇ ／ Ｌ 时，总油脂质量浓度为最低
（２３􀆰 ６２ ｇ ／ Ｌ），且发酵结束时细胞已经开始发生了自
溶，可能是糖初始质量浓度太高使得代谢过程中产
生了有害物质［１９］，另外高浓度的葡萄糖溶液会使得
溶液渗透压升高，从而不利于菌体的生长代谢［２０］。
２． ２． ２　 接种时间对油脂积累的影响
在菌体生物量积累阶段培养结束后，分别在不
同时间（３６、４８、６０ 和 ７２ ｈ）收集菌体，然后在初始质
量浓度为 ４０ ｇ ／ Ｌ的葡萄糖溶液中培养 ４８ ｈ，发现葡
萄糖已经全部被消耗尽，总体上生物量积累阶段的
培养时间长短对 Ｍ． ａｌｐｉｎａ 油脂积累阶段的影响不
显著，如图 ２ 所示，在 ６０ ｈ 接种时生物量和总油脂
质量浓度达到最大，分别为 ４１􀆰 ８２ 和 ２５􀆰 １４ ｇ ／ Ｌ。
图 ２　 接种时间对 Ｍ． ａｌｐｉｎａ积累花生四烯酸
油脂的影响
Ｆｉｇ． ２　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ａｇｅ ｏｎ ｌｉｐｉｄ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ
ｂｙ Ｍ． ａｌｐｉｎａ
２． ２． ３　 ｐＨ对油脂积累的影响
为了考察此阶段 ｐＨ对 Ｍ． ａｌｐｉｎａ积累花生四烯
酸油脂的影响，在获得菌体生物量的培养阶段后，
收集菌体，在不同初始 ｐＨ （５􀆰 ５、６􀆰 ０、６􀆰 ５、７􀆰 ０ 和
７􀆰 ５）时，在 ４０ ｇ ／ Ｌ 的葡萄糖溶液中培养 ４８ ｈ，结果
如图 ３ 所示。 由图 ３ 可知：只有在 ｐＨ ７􀆰 ５ 时，残糖
未耗完为 ４􀆰 ５ ｇ ／ Ｌ，其他条件下葡萄糖均已耗完。 在
ｐＨ ６􀆰 ０ 时生物量达到最大为 ４２􀆰 ４２ ｇ ／ Ｌ，在 ｐＨ ６􀆰 ５
时总油脂质量浓度达到最大（２６􀆰 ８７ ｇ ／ Ｌ），而在 ｐＨ
７􀆰 ５ 时为最低（２３􀆰 ５９ ｇ ／ Ｌ），可见偏酸有利于生物量
和总油脂质量浓度的提高。
图 ３　 ｐＨ对 Ｍ． ａｌｐｉｎａ积累花生四烯酸油脂的影响
Ｆｉｇ． ３　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｉｎｉｔｉａｌ ｐＨ ｏｎ ｌｉｐｉｄ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ
ｂｙ Ｍ． ａｌｐｉｎａ
２． ２． ４　 培养时间对油脂积累的影响
在菌体生物量的培养阶段后，收集菌体，于 ４０
ｇ ／ Ｌ 的葡萄糖溶液中培养， 考察培养时间对
Ｍ． ａｌｐｉｎａ积累花生四烯酸油脂的影响，结果见图 ４。
由图 ４ 可知：残糖质量浓度随时间迅速下降，总油脂
１１　 第 ４ 期 邓中涛等：高山被孢霉三阶段培养法生产花生四烯酸油脂
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质量浓度随着葡萄糖的消耗而快速积累，在 ４８ ｈ 时
残糖质量浓度降为 ７ ｇ ／ Ｌ，总油脂质量浓度达到最大
（２４􀆰 ８８ ｇ ／ Ｌ）。 从图 ４ 还可以看出，以残糖质量浓度
降至 ０ ｇ ／ Ｌ时为分水岭，即在葡萄糖被消耗完之前
油脂迅速的积累，而在葡萄糖消耗完之后油脂有所
下降。
图 ４　 培养时间对 Ｍ． ａｌｐｉｎａ积累花生四烯酸
油脂的影响
Ｆｉｇ． ４　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｃｕｌｔｕｒｅ ｔｉｍｅ ｏｎ ｌｉｐｉｄ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ
ｂｙ Ｍ． ａｌｐｉｎａ
２． ３　 花生四烯酸含量提高阶段的研究
花生四烯酸含量提高阶段在油脂积累阶段之
后，在营养物质匮乏的条件下进行。 通过实验发
现：在营养物质匮乏的条件下，随着培养时间的延
长，花生四烯酸含量会显著提高，但生物量和油脂
质量浓度会逐渐降低；而实际生产中既要考虑花生
四烯酸含量，又要考虑花生四烯酸的质量浓度。 因
此在花生四烯酸含量提高阶段的培养中培养时间
是最重要的因素。 按照培养方法部分的所述方法，
将油脂积累阶段培养后的菌体收集，于生理盐水中
分别培养 １２、３６ 和 ６０ ｈ，结果如图 ５ 所示。
图 ５　 花生四烯酸含量提高阶段培养时间的影响
Ｆｉｇ． ５　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｃｕｌｔｕｒｅ ｔｉｍｅ ｏｎ ＡＲＡ
ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｂｙ Ｍ． ａｌｐｉｎａ
由图 ５ 可知：１２、３６ 和 ６０ ｈ时，花生四烯酸的含
量分别为 ３８􀆰 ３％ 、４２􀆰 ６％和 ４３􀆰 ３％ ，出现了显著的
增加，但总油脂质量浓度呈现出明显的下降，从 １２ ｈ
时的 ２６􀆰 ５ ｇ ／ Ｌ下降到 ６０ ｈ时的 ２４􀆰 ７ ｇ ／ Ｌ，考虑到花
生四烯酸质量浓度在 ３６ ｈ 时达到最大，为 １１􀆰 ０３
ｇ ／ Ｌ。 综合考虑花生四烯酸含量和花生四烯酸的质
量浓度，确定 ３６ ｈ为最佳培养时间。
２． ４　 对三阶段法条件优化结果的研究
基于以上的研究，确定三阶段培养法的工艺：
在初糖为 ６０ ｇ ／ Ｌ的全培养基中培养 ６０ ｈ，然后收集
菌体，于初始 ｐＨ为 ６􀆰 ５ 的 ４０ ｇ ／ Ｌ 的葡萄糖溶液中
培养 ４８ ｈ，此时培养液中的葡萄糖已经被耗尽，收集
菌体，于生理盐水中培养 ３６ ｈ。 对照试验在初糖为
８０ ｇ ／ Ｌ的全培养基中培养，对照为正常的分批发酵
工艺，培养时间为 １８０ ｈ。 培养均在温度 ２５ ℃，转速
１２５ ｒ ／ ｍｉｎ条件下进行，结果如图 ６ 所示。
图 ６　 Ｍ． ａｌｐｉｎａ生物合成法产花生四烯酸油脂
三阶段培养工艺与分批发酵结果的比较
Ｆｉｇ． ６　 Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ａｒａｃｈｉｄｏｎｉｃ ａｃｉｄ⁃ｒｉｃｈ ｏｉｌ ｐｒｏｄｕｃｔ
ｂｙ Ｍ． ａｌｐｉｎｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｒｅｅ⁃ｓｔａｇｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ
ｓｔｒａｔｅｇｙ ａｎｄ ｂａｔｃｈ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ
由图 ６可知：在三阶段培养条件下生物量由分批
培养下的 ２８􀆰 ３３增加到 ４１􀆰 ６ ｇ ／ Ｌ；总油脂由分批培养
下的 １４􀆰 ３６ ｇ ／ Ｌ增加到 ２６􀆰 ６ ｇ ／ Ｌ；花生四烯酸由分批
培养下的 ５􀆰 ４５增加到 １１􀆰 ４ ｇ ／ Ｌ。 在三阶段培养条件
下花生四烯酸生产强度由分批培养下的 ０􀆰 ０３
ｇ ／ （Ｌ·ｈ）增加到 ０􀆰 ０７９ ｇ ／ （Ｌ·ｈ）。 可见，三阶段培养
条件可以显著提高发酵水平。
３　 结　 论
通过对 Ｍ． ａｌｐｉｎａ 生物合成积累花生四烯酸油
脂的研究，发现其生物量、油脂和花生四烯酸的积
累各阶段可以被分开，并可进行每个阶段的精确调
控。 在生物量积累阶段对糖初始浓度进行了研究；
在油脂积累阶段对对最佳糖初始浓度、接种时间、
ｐＨ和培养时间进行了优化；在花生四烯酸积累阶段
２１ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １１ 卷　
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重点考察了培养时间的影响。 在此基础上建立了
三阶段培养法培养 Ｍ． ａｌｐｉｎａ 高效合成花生四烯酸
油脂的工艺：在糖初始质量浓度为 ６０ ｇ ／ Ｌ 的全培养
基中培养 ６０ ｈ 后收集菌体，于初始 ｐＨ 为 ６􀆰 ５ 的
４０ ｇ ／ Ｌ的葡糖糖溶液中培养 ４８ ｈ，然后收集菌体，于
生理盐水中培养 ３６ ｈ。 在三阶段培养工艺条件下，
菌体生物量、总油脂量、花生四烯酸含量分别为
４１􀆰 ６、２６􀆰 ６ 和 １１􀆰 ４ ｇ ／ Ｌ，相比传统分批发酵工艺都
有了显著提高。 然而葡萄糖饥饿诱导花生四烯酸
的机理不清楚，在其诱导花生四烯酸快速积累的过
程中细胞为了维持生存总油脂会有所下降，如何解
决这些问题，值得进一步研究。
参考文献：
［ １ ］　 Ｌｏｍｂａｒｄｏ Ｙ Ｂ，Ｈｅｉｎ Ｇ，Ｃｈｉｃｃｏ Ａ． Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅ：ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ
ｎ⁃３ ＰＵＦＡｓ ｏｎ ａ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｄｙｓｌｉｐｉｄｅｍｉａ， ｉｎｓｕｌｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ａｎｄ
ａｄｉｐｏｓｉｔｙ［Ｊ］ ． Ｌｉｐｉｄｓ，２００７，４２（５）：４２７⁃４３７．
［ ２ ］ 　 Ｈｉｇａｓｈｉｙａｍａ Ｋ， Ｆｕｊｉｋａｗａ Ｓ， Ａｋｉｍｏｔｏ Ｋ， ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ
ａｒａｃｈｉｄｏｎｉｃ ａｃｉｄ ｂｙ Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｆｕｎｇｉ ［ Ｊ ］ ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ
Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２００２，７（５）：２５２⁃２６２．
［ ３ ］ 　 Ｓｉｎｇｈ Ｇ，Ｃｈａｎｄｒａ Ｒ Ｋ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｆｉｓｈ
ａｎｄ ｆｉｓｈ ｏｉｌｓ［Ｊ］ ． Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｆｏｏｄ ＆ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８８，１２
（４）：３７１⁃４１９．
［ ４ ］ 　 Ｇｉｌｌ Ｉ，Ｖａｌｉｖｔｒｙ Ｒ． Ｐｏｌｙｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ：ｐａｒｔ １． ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ，
ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ［ Ｊ］ ． Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，
１９９７，１５（１０）：４０１⁃４０９．
［ ５ ］ 　 Ｙｏｕ Ｊ Ｙ， Ｐｅｎｇ Ｃ， Ｌｉｕ Ｘ， ｅｔ ａｌ． Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ａｎｄ
ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｒａｃｈｉｄｏｎｉｃ ａｃｉｄ ｒｉｃｈ ｌｉｐｉｄｓ ｆｒｏｍ Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ
［Ｊ］ ． Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１１，１０２（１０）：６０８８⁃６０９４．
［ ６ ］ 　 Ｂａｊｐａｉ Ｐ Ｋ，Ｂａｊｐａｉ Ｐ，Ｗａｒｄ Ｏ Ｐ． Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｒａｃｈｉｄｏｎｉｃ ａｃｉｄ
ｂｙ Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ ＡＴＣＣ ３２２２２ ［ Ｊ］ ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９１，８（３）：１７９⁃１８６．
［ ７ ］ 　 Ｃｈｅｎ Ｈ， Ｃｈａｎｇ Ｃ， Ｃｈｅｎ Ｃ． Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｒａｃｈｉｄｏｎｉｃ ａｃｉｄ
ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ Ｗｕｊｉ⁃Ｈ４ ｉｓｏｌａｔｅ［ Ｊ］ ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｏｉｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｓ′ Ｓｏｃｉｅｔｙ，１９９７，７４（５）：５６９⁃５７８．
［ ８ ］ 　 Ｊｉｎ Ｍ Ｊ，Ｈｕａｎｇ Ｈ，Ｘｉａｏ Ａ Ｈ，ｅｔ ａｌ． Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ａｒａｃｈｉｄｏｎｉｃ ａｃｉｄ
ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ ＭＥ⁃１ ｕｓｉｎｇ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｍｙｃｅｌｉｕｍ
ａｇｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ［ Ｊ］ ． Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ ａｎｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，
２００８，３２（１）：１１７⁃１２２．
［ ９ ］ 　 Ｐｅｎｇ Ｃ， Ｈｕａｎｇ Ｈ， Ｊｉｎｇ Ｍ Ｊ， ｅｔ ａｌ． Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｄｉｕｍ
ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｆｏｒ ｂｉｏｍａｓｓ ａｎｄ ａｒａｃｈｉｄｏｎｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ
Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ ＭＥ⁃１ ｕｓｉｎｇ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ［Ｊ］ ．
Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００９，３０（１３）：２０５⁃２１１．
［１０］ 　 Ｓａｊｂｉｄｏｒ Ｊ，Ｄｏｂｒｏｎｏｖａ Ｓ，Ｃｅｒｔｉｋ Ｍ． Ａｒａｃｈｉｄｏｎｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
ｂｙ Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｓｐ． Ｓ⁃１７，ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｃ ／ Ｎ ｒａｔｉｏ［ Ｊ］ ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９９０，１２（６）：４５５⁃４５６．
［１１］ 　 Ｋｏｉｋｅ Ｙ， Ｃａｉ Ｈ Ｊ， Ｈｉｇａｓｈｉｙａｍａ Ｋ， ｅｔ ａｌ． Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｃｏｎｓｕｍｅｄ
ｃａｒｂｏｎ ｔｏ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｒａｔｉｏ ｏｎ ｍｙｃｅｌｉａｌ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ ａｒａｃｈｉｄｏｎｉｃ
ａｃｉｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ［ Ｊ］ ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２００１，９１（４）：３８２⁃３８９．
［１２］ 　 Ｐａｐａｎｉｋｏｌａｏｕ Ｓ，Ａｇｇｅｌｉｓ Ｇ． Ｌｉｐｉｄｓ ｏｆ ｏｌｅａｇｉｎｏｕｓ ｙｅａｓｔｓ： Ｐａｒｔ Ｉ．
ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ ｏｉｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ［Ｊ］ ． Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｌｉｐｉｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１１，１１３（８）：１０３１⁃１０５１．
［１３］ 　 Ｒａｔｌｅｄｇｅ Ｃ，Ｗｙｎｎ Ｊ． Ｔｈｅ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ
ｌｉｐｉｄ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｏｌｅａｇｉｎｏｕｓ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ［Ｊ］ ． Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ
Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００２，５１，１⁃５１．
［１４］ 　 Ｗｕ Ｓ，Ｈｕ Ｃ， Ｊｉｎ Ｇ， ｅｔ ａｌ． Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ⁃ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｌｉｐｉｄ
ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ ［ Ｊ ］ ． Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１０，１０１（１５）：６１２４⁃６１２９．
［１５］ 　 Ｗｕ Ｓ， Ｚｈａｏ Ｘ， Ｓｈｅｎ Ｈ， ｅｔ ａｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｌｉｐｉｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ
Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ ｕｎｄｅｒ ｓｕｌｆａｔｅ⁃ｌｉｍｉｔｅｄ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ［ Ｊ］ ．
Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１１，１０２（２）：１８０３⁃１８０７．
［１６］ 　 Ｇｉｌｌ Ｃ Ｏ， Ｈａｌｌ Ｍ Ｊ， Ｒａｔｌｅｄｇｅ Ｃ． Ｌｉｐｉｄ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ａｎ
ｏｌｅａｇｉｎｏｕｓ ｙｅａｓｔ （Ｃａｎｄｉｄａ １０７） ｇｒｏｗｉｎｇ ｏｎ ｇｌｕｃｏｓｅ ｉｎ ｓｉｎｇｌｅ⁃ｓｔａｇｅ
ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｃｕｌｔｕｒｅ［Ｊ］． Ａｐｐｌｉｅｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９７７，
３３（２）：２３１⁃２３９．
［１７］ 　 Ｌｉｎ Ｊ， Ｓｈｅｎ Ｈ， Ｔａｎ Ｈ， ｅｔ ａｌ． Ｌｉｐｉｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ
ｓｔａｒｋｅｙｉ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｇｌｕｃｏｓｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｗｉｔｈｏｕｔ ａｕｘｉｌｉａｒｙ ｎｕｔｒｉｅｎｔｓ［ Ｊ］ ．
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１１，１５２（４）：１８４⁃１８８．
［１８］ 　 Ｚｈｕ Ｍ，Ｙｕ Ｌ Ｊ， Ｌｉ Ｗ， ｅｔ ａｌ． Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｒａｃｈｉｄｏｎｉｃ ａｃｉｄ
ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｆｅｄ⁃ｂａｔｃｈ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ ｂａｓｅｄ ｏｎ
ｄｙｎａｍｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ［ Ｊ］ ． Ｅｎｚｙｍｅ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００６，
３８（６）：７３５⁃７４０．
［１９］ 　 Ｐａｐａｎｉｋｏｌａｏｕ Ｓ，Ｋｏｍａｉｔｉｓ Ｍ，Ａｇｇｅｌｉｓ Ｇ． Ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ ｏｉｌ （ ＳＣＯ）
ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｉｓａｂｅｌｌｉｎａ ｇｒｏｗｎ ｏｎ ｈｉｇｈ⁃ｓｕｇａｒ ｃｏｎｔｅｎｔ
ｍｅｄｉａ［Ｊ］ ． Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００４，９５（３）：２８７⁃２９１．
［２０］ 　 Ｚｈｕ Ｌ Ｙ， Ｚｏｎｇ Ｍ Ｈ， Ｗｕ Ｈ． Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｌｉｐｉｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ
Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ ａｎｄ ｉｔｓ ｕｓｅ ｆｏｒ ｂｉｏｄｉｅｓｅｌ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ［Ｊ］ ．
Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００８，９９（１６）：７８８１⁃７８８５．
３１　 第 ４ 期 邓中涛等：高山被孢霉三阶段培养法生产花生四烯酸油脂
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