全 文 ：第 １２卷第 ２期
２０１４年 ３月
生　 物　 加　 工　 过　 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ􀆰 １２ Ｎｏ􀆰 ２
Ｍａｒ􀆰 ２０１４
ｄｏｉ：１０􀆰 ３９６９ ／ ｊ􀆰 ｉｓｓｎ􀆰 １６７２－３６７８􀆰 ２０１４􀆰 ０２􀆰 ０１３
收稿日期：２０１２－０６－０５
基金项目：国家高技术研究发展计划（８６３计划）（２０１４ＡＡ０２１７０３）；国家自然科学基金（２１３７６００２）；江苏省自然科学基金（ＢＫ２０１３１４０５）；江苏
高校优势学科建设工程
作者简介：颜佳铖（１９８８—），女，江苏南通人，硕士研究生，研究方向：生物化工；纪晓俊（联系人），副教授，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｘｉａｏｊｕｎｊｉ＠ ｎｊｔｅｃｈ􀆰 ｅｄｕ􀆰 ｃｎ
微生物油脂中花生四烯酸含量的准确快速测定
颜佳铖，纪晓俊，聂志奎，邓中涛，任路静，黄　 和
（南京工业大学 生物与制药工程学院 材料化学工程国家重点实验室，南京 ２１０００９）
摘　 要：建立了快速、准确测定微生物油脂中花生四烯酸（ＡＲＡ）含量的气相色谱检测方法。 选用 ＤＢ ２３毛细管色
谱柱，设置合适的载气压力，采用 ＦＩＤ检测器，对 ＡＲＡ含量进行了定量分析。 测定结果表明：油脂中各脂肪酸组分
可有效分离，分析时间仅需 ２０ ｍｉｎ，ＡＲＡ的回收率为 ９０􀆰 １４６％～１００􀆰 ６３４％，相对标准偏差为 ４􀆰 １７５％。
关键词：ＡＲＡ；气相色谱分析；微生物油脂
中图分类号：Ｑ８１５　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２－３６７８（２０１４）０２－００６６－０４
Ｆａｓｔ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ａｒａｃｈｉｄｏｎｉｃ ａｃｉｄ ｉｎ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｏｉｌｓ
ＹＡＮ Ｊｉａｃｈｅｎｇ，ＪＩ Ｘｉａｏｊｕｎ，ＮＩＥ Ｚｈｉｋｕｉ，ＤＥＮＧ Ｚｈｏｎｇｔａｏ，ＲＥＮ Ｌｕｊｉｎｇ，ＨＵＡＮＧ Ｈｅ
（Ｓｔａｔｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ⁃Ｏｒｉｅｎｔｅｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ
Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｎａｎｊｉｎｇ Ｔｅｃｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ ２１０００９，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｇａｓ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｗａｓ ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ａｒａｃｈｉｄｏｎｉｃ ａｃｉｄ （ＡＲＡ） ｐｒｏｄｕｃｅｄ
ｂｙ ｍｉｃｒｏ⁃ｏｒｇａｎｉｓｍｓ􀆰 Ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｃｏｌｕｍｎ ＤＢ⁃２３ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｗｉｔｈ ＦＩＤ ａｎｄ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｃａｒｒｉｅｒ ｇａｓ ｆｏｒ ｔｈｅ
ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ􀆰 Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｃｏｕｌｄ ｓｅｐａｒａｔｅ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ ｗｅｌｌ ｉｎ ２０ ｍｉｎ ｏｎ ｇｏｏｄ ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ
ａｎｄ ｒｅｃｏｖｅｒｙ􀆰 Ｔｈｅ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｒａｔｅ ｏｆ ＡＲＡ ｗａｓ ９０􀆰 １４６％ ｔｏ １００􀆰 ６３４％，ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｓｔａｎｄａｒｄ ｄｅｖｉａｔｉｏｎ
ｗａｓ ４􀆰 １７５％􀆰 Ｔｈｕｓ，ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＡＲＡ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ ｍｉｃｒｏ⁃ｏｒｇａｎｉｓｍｓ􀆰
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ａｒａｃｈｉｄｏｎｉｃ ａｃｉｄ；ｇａｓ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ；ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｏｉｌｓ
　 　 花生四烯酸（Ａｒａｃｈｉｄｏｎｉｃ Ａｃｉｄ，简称 ＡＲＡ）属
于 ω ６ 系列长链多不饱和脂肪酸。 作为人体必
需 的 多 不 饱 和 脂 肪 酸， 是 前 列 腺 素
（ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ）、凝血恶烷（ ｔｈｒｏｍｂｏｘａｎｅ）和白三烯
（ ｌｅｕｃｏｔｒｉｅｎｅ）等类二十烷酸的前体物质［１－４］ 。 ＡＲＡ
具有多种生理活性，在医药、食品和化妆品等领域
都有广泛的应用［５］ 。
ＡＲＡ普遍存在于陆地动物的油脂中，但含量不
高，无法满足日益增长的需求，采用微生物发酵是
获取 ＡＲＡ 的方式之一［６］。 目前，ＡＲＡ 分析检测技
术主要有甲酯化气相色谱法［７］、高效液相色谱
法［８］、薄层色谱法［９］及柱层析［１０］等。 其中应用最为
广泛的是气相色谱法。
脂肪酸含量的测定多采用面积归一化法，但该
法将各脂肪酸的校正因子视为相等，不能正确反映
细胞内 ＡＲＡ含量。 而外标法需要进样量精确，对进
样技术要求较高。 采用内标法可克服上述方法的
缺陷，内标物选择待测物中不含的脂肪酸，如奇数
碳脂肪酸（Ｃ１３ ∶０，Ｃ１７ ∶０等） ［１１－１２］。 笔者采用内标
法，以十三烷酸甲酯（Ｃ１３ ∶０甲酯）为内标，ＤＢ ２３
为分离柱，建立测定微生物油脂中 ＡＲＡ 含量的方
法，以期实现 ＡＲＡ 含量的快速准确测定，满足工业
化生产的要求。
１　 材料与方法
１􀆰 １　 实验材料与仪器设备
１􀆰 １􀆰 １　 实验原料
材料：微生物油脂，取高山被孢霉发酵中期提
取的油脂。
标准试剂： ＡＲＡ 甲酯 １００ ｍｇ （纯度 ９９％），
ＡＲＡ 甘油三酯 １００ ｍｇ（纯度 ９９％），十三烷酸甲酯
１ ０００ ｍｇ （纯度 ９７％），均为色谱纯试剂，购自
Ｓｉｇｍａ公司。
试剂：０􀆰 ５ ｍｏｌ ／ Ｌ ＫＯＨ ＣＨ３ＯＨ分析纯，购自国
药集团化学试剂有限公司；ＢＦ３ 乙醚 甲醇溶液
（Ｖ（ＢＦ３ 乙醚） ∶Ｖ（甲醇）＝ ３ ∶７）分析纯，其中 ＢＦ３
乙醚购自江苏永华精细化学品有限公司；ＮａＣｌ 分析
纯，购自西陇化工股份有限公司；正己烷色谱纯，购
自山东禹王实业有限公司。
１􀆰 １􀆰 ２　 仪器设备
在岛津 ＧＣ ２０１０ 气相色谱仪上，用 ＤＢ ２３
（６０ ｍｍ×０􀆰 ２５ ｍｍ×０􀆰 ２５ μｍ）毛细管柱进行分析，载
气为高纯度 Ｎ２，柱流 １􀆰 ５６ ｍＬ ／ ｍｉｎ，尾吹流速 ３０
ｍＬ ／ ｍｉｎ，Ｈ２流速 ３０ ｍＬ ／ ｍｉｎ，空气流速 ４００ ｍＬ ／ ｍｉｎ，
分流比为 ３０ ∶１。
汽化室温度为 ２５０ ℃，检测器温度为 ２８０ ℃，色
谱柱初始温度为 １００ ℃，以 ２５ ℃ ／ ｍｉｎ 升至 １９６ ℃，
再以 ２ ℃ ／ ｍｉｎ升至 ２２０ ℃，保持 ６ ｍｉｎ。 进样量为 １
μＬ；其中毛细管柱购自安捷伦公司。
１􀆰 ２　 实验方法
１􀆰 ２􀆰 １　 标准溶液的配制
ＡＲＡ甲酯储备液的配制：取 １０ ｍＬ 容量瓶，正
己烷洗数次。 称取 ＡＲＡ 甲酯 ４８􀆰 ２ ｍｇ，用正己烷溶
解后转移至上述容量瓶中，定容、摇匀，得到 ＡＲＡ甲
酯储备液的质量浓度为 ４􀆰 ７８ ｍｇ ／ ｍＬ。
Ｃ１３ ∶０甲酯溶液的配制：取 ２５ ｍＬ 容量瓶，正己
烷冲洗数次。 称取内标物 Ｃ１３ ∶０甲酯 ５６􀆰 ２ ｍｇ，正己
烷溶解后转移至该容量瓶中，定容、摇匀，所得内标
物的质量浓度为 ２􀆰 １８ ｍｇ ／ ｍＬ。
标准工作溶液的配制：按下表分别移取适量
ＡＲＡ甲酯储备液于 ４ 个 ５ ｍＬ 容量瓶中，加入正己
烷稀释至刻度，摇匀。 连同 ＡＲＡ 甲酯储备液，可得
到 ５种浓度的 ＡＲＡ甲酯溶液。
将上述溶液分装于 ２ ｍＬ气相进样瓶中，封口胶
密封，做好标记，备用。
表 １　 标准工作液中 ＡＲＡ甲酯的含量
Ｔａｂｌｅ １　 Ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ＡＲＡ ｍｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒｓ ｉｎ ｓｔａｎｄａｒｄ ｓｏｌｕｔｉｏｎ
编号
Ｖ（加入的 ＡＲＡ
甲酯储备液） ／
ｍＬ
ρ（标准工作液中
ＡＲＡ甲酯） ／
（ｍｇ·ｍＬ－１）
１ ０􀆰 ２５ ０􀆰 ２４
２ ０􀆰 ５０ ０􀆰 ４８
３ １􀆰 ２５ １􀆰 ２０
４ ２􀆰 ５０ ２􀆰 ３９
１􀆰 ２􀆰 ２　 试样的制备
准确称取油脂试样 ０􀆰 ４５ ～ ０􀆰 ５５ ｇ，添加正己烷
定容至 １０ ｍＬ，振荡使其完全溶解后，取 １ ｍＬ 溶液
于 １０ ｍＬ容量瓶中，加 ０􀆰 ５ ｍｏｌ ／ Ｌ 的 ＫＯＨ ＣＨ３ＯＨ
溶液 ３ ｍＬ，振荡，６５ ℃水浴 １５ ｍｉｎ，冷却至室温后加
入 ＢＦ３ 乙醚 甲醇溶液 ３ ｍＬ，振荡，６５ ℃水浴 ５
ｍｉｎ。 再次冷却至室温，加饱和 ＮａＣｌ溶液 ２ ｍＬ及正
己烷 １ ｍＬ，多次萃取上清，正己烷定容至 １０ ｍＬ 容
量瓶中，用于气相色谱分析。
１􀆰 ３　 测定方法
采用内标法进行定量测定，内标物为 Ｃ１３ ∶０甲
酯，２００ μＬ待测试样和 ２００ μＬ内标品充分混合，用
于气相色谱分析。
微生物油脂中脂肪酸含量可换算为该脂肪酸
占总油质量的百分比，计算见式（１）。
某脂肪酸含量 ＝
Ａｉ
Ａｓ
×
ｍｓ
ｍ
× ｆ Ａｉ，ｓ ×
ｍｉ
ｍｉ甲酯
×５００ ×１００％ （１）
式中：Ａｉ为某脂肪酸甲酯峰面积，ｍ２；Ａｓ为标准物
Ｃ１３ ∶０甲酯峰面积，ｍ２； ｆＡｉ，ｓ为脂肪酸甲酯 ｉ 相对于
Ｃ１３ ∶０甲酯的相对校正因子；ｍｉ为脂肪酸 ｉ的相对分
子质量；ｍｉ甲酯为脂肪酸甲酯 ｉ的相对分子质量；ｍ为
待测试样质量，ｍｇ；ｍｓ为 Ｃ１３ ∶０甲酯质量，ｍｇ。
２　 结果与讨论
２􀆰 １　 内标物与待测物的定性分析
将 Ｃ１３ ∶０甲酯和 ＡＲＡ 甲酯分别进行 ＧＣ 分析，
得到二者的气相色谱图如图 １和图 ２所示。
由以上 ２ 种纯物质的气相色谱图，可分别得到
Ｃ１３ ∶０甲酯和 ＡＲＡ 甲酯的保留时间，其中内标物
Ｃ１３ ∶０甲酯的保留时间为 ７􀆰 ５５５ ｍｉｎ，ＡＲＡ 甲酯的保
留时间为 １７􀆰 ７６８ ｍｉｎ。
２􀆰 ２　 ＡＲＡ的定量分析
添加内标物的气相色谱分离检测图如图 ３ 所
示。 由图 ３可知：２种脂肪酸分离效果良好，其他组
７６　 第 ２期 颜佳铖等：微生物油脂中花生四烯酸含量的准确快速测定
图 １　 内标物 Ｃ１３ ∶０甲酯的气相色谱图
Ｆｉｇ􀆰 １　 Ｇａｓ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ ｏｆ Ｃ１３ ∶０ ｍｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ
图 ２　 ＡＲＡ甲酯的气相色谱图
Ｆｉｇ􀆰 ２　 Ｇａｓ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ ｏｆ ＡＲＡ ｍｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ
分不干扰测定。
图 ３　 添加内标物的气相色谱图
Ｆｉｇ􀆰 ３　 Ｇａｓ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ ｏｆ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ ｉｎ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ
ｏｉｌｓ ｗｉｔｈ ｉｎｔｅｒｎａｌ⁃ｓｔａｎｄａｒｄ
２􀆰 ２􀆰 １　 相对校正因子的测定
分别取相同浓度的内标物 Ｃ１３ ∶ ０甲酯和不同
质量浓度的 ＡＲＡ甲酯各 ２００ μＬ，其中 Ｃ１３ ∶０甲酯
的质量浓度为 ２􀆰 １８ ｍｇ ／ ｍＬ，ＡＲＡ 甲酯的质量浓度
分别为 ４􀆰 ７８、２􀆰 ３９、１􀆰 ２０、０􀆰 ４８ 和 ０􀆰 ２４ ｍｇ ／ ｍＬ，混
合均匀，每个试样进样 ２ 次，取平均值，测定结果
见表 ２。
表 ２　 测定 ＡＲＡ甲酯相对 Ｃ１３ ∶０甲酯的相对校正因子
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ ｏｆ
ＡＲＡ ｍｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ ｔｏ Ｃ１３ ∶０ ｍｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ
试样号 ｍ（ＡＲＡ甲酯） ／ｍ（Ｃ１３ ∶０甲酯）
Ａ（ＡＲＡ甲酯） ／
Ａ（Ｃ１３ ∶０甲酯） 相对校正因子
１ ２􀆰 １９２ １ ２􀆰 ００９ ６ １􀆰 ０９０ ８
２ １􀆰 ０９６ ０ ０􀆰 ９１５ ２ １􀆰 １９７ ６
３ ０􀆰 ５４８ ０ ０􀆰 ４６２ ６ １􀆰 １８４ ６
４ ０􀆰 ２１９ ２ ０􀆰 １８０ ７ １􀆰 ２１３ ０
５ ０􀆰 １０９ ６ ０􀆰 ０９０ ５ １􀆰 ２１０ ８
　 注：该组数据的相对标准偏差是 ４􀆰 ３０６ ６％。
２􀆰 ２􀆰 ２　 方法精确度的测定
取同一批油脂，精确称取 ５份试样，按 １􀆰 ２􀆰 ２ 方
法进行试样预处理后，按 １􀆰 ３方法进行定量分析，进
样 ２次，取平均值，精确度分析结果见表 ３。
表 ３　 微生物油脂试样中 ＡＲＡ的精确度分析
Ｔａｂｌｅ ３　 Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ｏｆ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ
ｏｆ ＡＲＡ ｉｎ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ ｏｉｌ
试样号 测定值 ／ （ｍｇ·ｇ－１）
１ ２８４􀆰 ５８０
２ ２８４􀆰 ５７２
３ ２５６􀆰 ８１７
４ ２７１􀆰 ６９３
５ ２７２􀆰 ４７１
平均值 ２７４􀆰 ０２６
　 　 　 　 注：该组数据的相对标准偏差为 ４􀆰 １８０％。
由表 ３可知：微生物油脂中 ＡＲＡ的平均质量分
数为 ２７４􀆰 ０２６ ｍｇ ／ ｇ，相对标准偏差为 ４􀆰 １８０％。 实
验中由于试样处理过程较复杂、采用手动进样、仪
器自身也存在误差，导致数据存在误差，但 ＲＳＤ 值
小于 ５％，表明此方法精确度较高，重现性好［１３］。
２􀆰 ２􀆰 ３　 回收率的测定
采用加标回收法，准确称取已知 ＡＲＡ 含量的油
脂试样 ５份，分别添加 ＡＲＡ 甘油三酯标准品进行回
收率实验。 按 １􀆰 ２􀆰 ２方法进行试样预处理后，按 １􀆰 ３
定量分析方法进行测定，回收率分析结果见表 ４。
由表 ４ 可知： ＡＲＡ 的回收率为 ９０􀆰 １４６％ ～
１００􀆰 ６３４％，相对标准偏差为 ４􀆰 １７５％，由于本方法前
期处理过程相对比较复杂，回收率需要满足 ９０％ ～
１１０％范围，由此可见本组数据满足该方法的要求。
８６ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １２卷　
表 ４　 微生物油脂中 ＡＲＡ的回收率
Ｔａｂｌｅ ４　 Ｒｅｃｏｖｅｒｉｅｓ ｏｆ ＡＲＡ ｉｎ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ ｏｉｌ
试样号 加入量 ／（ｍｇ·ｇ－１）
实测值 ／
（ｍｇ·ｇ－１）
回收率 ／
％
１ １３５􀆰 ４９６ １２９􀆰 ２５９ ９５􀆰 ３９４
２ １３５􀆰 ４９６ １３０􀆰 ５４０ ９６􀆰 ３４０
３ １３５􀆰 ４９６ １３６􀆰 ３５９ １００􀆰 ６３４
４ １３５􀆰 ４９６ １２２􀆰 １４８ ９０􀆰 １４６
５ １３５􀆰 ４９６ １３４􀆰 １２１ ９８􀆰 ９８２
　 注：该组数据的相对标准偏差是 ４􀆰 １７５％。
３　 结　 论
本 实 验 ＡＲＡ 的 回 收 率 为 ９０􀆰 １４６％ ～
１００􀆰 ６３４％，相对标准偏差为 ４􀆰 １７５％，微生物发酵中
期油脂中 ＡＲＡ的含量为 ２７４􀆰 ０２６ ｍｇ ／ ｇ，相对标准偏
差为 ４􀆰 １８０％，表明此方法的精确度高，可快速、准
确地检测微生物油脂中 ＡＲＡ 含量，具有检测时间
短、精确度高、可靠性好的优点。 因此为微生物油
脂中脂肪酸的检测提供了一个较为可行的分析方
法，具有较高的实用性，并为发酵过程监测和菌种
诱变筛选提供了参考标准。
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（责任编辑　 周晓薇）
９６　 第 ２期 颜佳铖等：微生物油脂中花生四烯酸含量的准确快速测定