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Fermentation of microbial lipid by Mortierella elongate with starch

长孢被孢霉利用淀粉质原料发酵产微生物油脂



全 文 :第 12卷第 4期
2014年 7月
生  物  加  工  过  程
Chinese Journal of Bioprocess Engineering
Vol􀆰 12 No􀆰 4
Jul􀆰 2014
doi:10􀆰 3969 / j􀆰 issn􀆰 1672-3678􀆰 2014􀆰 04􀆰 004
收稿日期:2013-04-24
基金项目:国家高技术研究发展计划(863计划)(2014AA021902)
作者简介:赖  婧(1988—),女,江西赣州人,硕士研究生,研究方向:生物反应工程技术;姚日生(联系人),教授,E⁃mail:yaors@ hfut􀆰 edu􀆰 cn
长孢被孢霉利用淀粉质原料发酵产微生物油脂
赖  婧1,张  波2,姚日生1,3
(1􀆰 合肥工业大学 医学工程学院,合肥 230009; 2􀆰 合肥工业大学 化学工程学院,
合肥 230009; 3􀆰 农产品生物化工教育部工程研究中心,合肥 230009)
摘  要:通过研究长孢被孢霉(Mortierella elongate)的发酵过程,并采用摇瓶分批补料发酵模式考察了起始补料时间及补
料基质对长孢被孢霉合成微生物油脂的影响。 结果发现该菌株合成油脂主要在发酵 48~96 h进行,且N源对菌株的生长
有促进作用,采用限氮补料发酵可大幅度提高微生物油脂的产量。 最适培养条件:可溶性淀粉 20 g / L,玉米浆 3 g / L,补料
起始时间为发酵 48 h,单次补加可溶性淀粉 4 g。 在此条件下,油脂产量较不补料时增加了 521􀆰 74 mg,增长率为 237􀆰 1%。
关键词:分批补料;微生物油脂;长孢被孢霉;可溶性淀粉
中图分类号:Q939􀆰 97        文献标志码:A        文章编号:1672-3678(2014)04-0016-04
Fermentation of microbial lipid by Mortierella elongate with starch
LAI Jing1,ZHANG Bo2,YAO Risheng1,3
(1􀆰 School of Medical Engineering,Hefei University of Technology,Hefei 230009,China;
2􀆰 School of Chemical Engineering,Hefei University of Technology,Hefei 230009,China;
3􀆰 Engineering Research Center of Bioprocess of the Ministry of Education,Hefei 230009,China)
Abstract:The fermentation process of Mortierella elongate and a fed⁃batch strategy were investigated􀆰 The
results showed that the synthesis of lipid was conducted during 48 h to 96 h,and nitrogen sources could
promote the growth of the strains􀆰 Nitrogen⁃limited fed⁃batch process improved the production of lipid􀆰 The
optimum concentration of carbon and nitrogen sources was 20 g / L,and 3 g / L,respectively􀆰 Under these
conditions,feeding of 4 g soluble starch at the third day of the fermentation could increase the lipid by
521􀆰 74 mg with a growth rate of 237􀆰 1%􀆰
Key words:fed⁃batch;microbial lipid;Mortierella elongate;soluble starch
    脂肪酸是重要的有机化工和精细化工原料,以
脂肪酸为原料生产的下游衍生物广泛应用于纺织
印染、食品、医药、日用化工、石油化工和橡塑加工
等许多领域。 目前,世界脂肪酸的主要来源是从天
然动植物油脂经水解、精馏得到[1]。
微生物油脂,又称单细胞油脂( single cell oil,
SCO),是指由微生物在一定条件下将碳水化合物、
碳氢化合物等基质转化为菌体内大量贮存的油
脂[2-4]。 与生产动、植物油脂相比,微生物油脂的生
产有许多优点[5]:微生物细胞增殖快,生产周期短;
生长所需的原料丰富,价格便宜;所需劳动力少,不
受季节、气候变化的限制;能连续大规模生产,生产
成本低等。 因此,利用微生物发酵方法,把一些廉
价易得的农副产品及食品工业的废弃物转化为所
需油脂已日益成为许多研究者关注的热点[6-7]。
目前,微生物利用淀粉质原料产油脂的一般过
程为先将淀粉水解成糖再发酵产油脂,其中淀粉的
水解通常采用双酶法[8],在此期间需经过 2 次 pH
调节,过程复杂、繁琐;而本研究采用实验室自筛的
长孢被孢霉(M􀆰 elongate)可直接利用淀粉质原料。
针对 M􀆰 elongate的这一特性,对其发酵过程进行研
究可使微生物发酵产油脂这一过程大为简化。
笔者对长孢被孢霉利用淀粉质原料发酵过程
进行研究,并重点研究补料发酵方案,以期提高微
生物油脂的生产利用率。
1  材料与方法
1􀆰 1  实验材料
1􀆰 1􀆰 1  菌种
M􀆰 elongate PFY,合肥工业大学久易化工研究
所自筛;4 ℃保藏于斜面培养基。
1􀆰 1􀆰 2  培养基
菌种活化培养基:马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基。
种子培养基 ( g / L):葡萄糖 30、酵母膏 8、
K2HPO4 0􀆰 5、ZnSO4 0􀆰 5、MgSO4 0􀆰 5。
发酵培养基(g / L):可溶性淀粉(待考察)、玉米
浆(待考察)、K2HPO4 0􀆰 5、ZnSO40􀆰 5、MgSO4 0􀆰 5。
1􀆰 1􀆰 3  主要试剂
所用玉米浆为市售;酵母膏,北京奥博星生物
技术有限责任公司;其他试剂均为分析级。
1􀆰 2  实验方法
1􀆰 2􀆰 1  菌体培养
种子培养:将活化后的菌体挑取 2 环接种到
100 mL 灭菌种子培养基中,置 250 mL 摇瓶,于
28 ℃、150 r / min转速下培养 24 h。
发酵培养:取培养 24 h的种子,按 2%的接种量
接种到 100 mL灭菌发酵培养基中,置 250 mL摇瓶,
于 28 ℃、150 r / min 转速下,培养一定时间,定时取
样,测定其油脂含量。
1􀆰 2􀆰 2  菌体生物量的测定
采用细胞干质量[9](dry cell weight,DCW)法测
定菌体生物量。 发酵液过滤、洗涤,得到的细胞于
60 ℃下烘干至恒质量后称质量,以干菌体质量浓度
ρ(DCW)(g / L)表示。
1􀆰 2􀆰 3  残糖浓度的测定
发酵液过滤后,滤液进行适当稀释,采用蒽酮
比色法测定发酵液中总糖残余量[10]。
1􀆰 2􀆰 4  菌体内油脂含量的测定及成分分析
选用索氏提取法测定油脂含量[11]:采用沸程 30~
60 ℃的石油醚提取干菌体内的油脂,并于 90 ℃下烘干
残余的石油醚,测定油脂质量。 油脂含量以菌体内油
脂量占菌体干质量的百分数表示,按式(1)计算。
油脂含量 = 油脂质量
菌体干质量
× 100% (1)
    采用 GC MS法分析油脂成分[12]:将油脂进行
甲酯化后进行 GC MS 分析,测定其中饱和与不饱
和脂肪酸的比例。
2  结果与讨论
2􀆰 1  油脂成分分析
对发酵所得微生物油脂进行甲酯化处理后进
行 GC MS分析,结果显示该微生物油脂中含有多
种脂肪酸组分,其主要成分含量(质量分数):硬脂
酸 39􀆰 90%,油酸 31􀆰 70%和亚油酸 27􀆰 30%。
2􀆰 2  可溶性淀粉浓度对发酵产油脂的影响
在维持发酵培养基碳氮比不变的前提下,考察
可溶性淀粉质量浓度对发酵产油脂的影响,结果见
图 1。
图 1  C源对微生物油脂产量的影响
Fig􀆰 1  Effects of soluble starch concentration
on lipid production
由图 1可以看出,C 源的用量对菌体发酵产油
脂的影响较大。 随着可溶性淀粉浓度的增大,菌体
干质量不断增加;而油脂产量则出现先升高后降低
的趋势,并在可溶性淀粉质量浓度为 20 g / L 时达最
大,为 198􀆰 21 mg / L,且此时底物利用率最高,达
0􀆰 99%。 这是由于当底物浓度较低时,发酵过程中
供能不足,菌种长势不良,使油脂合成受影响;当底
物浓度过高时,菌株长势较旺,种群密度过大,造成
发酵后期体系溶氧不足,影响油脂合成。
2􀆰 3  玉米浆浓度对发酵产油脂的影响
固定可溶性淀粉质量浓度 20 g / L,考察不同玉
米浆质量浓度对发酵产油脂的影响,结果见图 2。
71  第 4期 赖  婧等:长孢被孢霉利用淀粉质原料发酵产微生物油脂
图 2  玉米浆对微生物油脂产量的影响
Fig􀆰 2  Effects of corn syrup concentration
on lipid production
由图 2可以看出:由于 N 源对菌体生长有促进
作用,随着玉米浆浓度的升高,生物量不断增加,但
油脂含量则呈现先升高后降低的趋势,并于玉米浆
质量浓度为 3 g / L 时达最大,为 278􀆰 39 mg / L,且此
时底物利用率最高,为 1􀆰 39%。 这是由于在碳氮比
低的情况下更有利于菌体的生长和生物量的提高。
随着碳氮比的增加,C 源和 N 源优先用于菌体生
长,当 N源耗尽后,N 源成为限制性营养素,细胞不
能再继续扩增,就把所吸收的 C 源物质转化成脂类
物质,作为能源物质储存起来[13-14]。 因此,当玉米
浆浓度过低时,N 源消耗过快,菌体长势不佳,影响
油脂合成;当玉米浆浓度过高时,C 源和 N 源被优
先用于菌体生长,油脂产量下降。
2􀆰 4  发酵特性曲线
在 20 g / L可溶性淀粉、3 g / L 玉米浆的条件下,
监测发酵 7 d内的菌体生物量(以菌体干质量表示)、
油脂含量、残糖浓度和 pH变化,结果见图 3~图 4。
图 3  发酵特性曲线
Fig􀆰 3  Biomass variation with fermentation process
由图 3可知:随着发酵的进行,菌体浓度和油脂
产量不断增加,糖浓度不断降低,至发酵第 5 天,菌
体生物量和油脂产量达最大,且培养基中的 C 源基
本耗尽,残糖质量浓度仅为 2 g / L;此后,菌体细胞进
入饥饿状态,制约生长甚至自溶,造成菌体干质量
和油脂产量下降,残糖浓度趋于不变。 因此,可确
定单批发酵的最适发酵时间为 120 h。
图 4  pH随发酵过程的变化
Fig􀆰 4  Effects of fermentation process on pH
由图 4可知:随着发酵的进行,体系 pH 呈现先
降低后升高的趋势,且在发酵 48 ~ 96 h 处有一平台
期,此平台期也是油脂产量升高和残糖浓度降低最
快的时期。 造成这一现象的原因可能是:随着菌体
细胞生长,发酵液中 N源物质逐渐消耗,体系 pH下
降;当 N源消耗殆尽时,菌体细胞开始油脂合成,体
系 pH基本维持不变;随着 C源物质的进一步消耗,
菌体细胞进入衰亡期,菌体自溶,一些胞内物质释
放到发酵液中,使 pH上升。 因此,可通过监测体系
pH变化,确定发酵结束时间。
2􀆰 5  补料发酵对发酵产油脂的影响
由菌体生物量和残糖浓度随发酵的变化曲线
可看出,菌体在发酵 48 ~ 96 h,底物利用速度较快,
故分别选择发酵 48、72 和 96 h 作为补料开始的时
间点,考察仅补 C源和同时补加 C源和 N源对油脂
产量的影响。 即每隔 24 h 补料,补料 3 次,单次补
料量为可溶性淀粉 2 g,玉米浆补加量随 C / N 比变
化,结果见图 5。
注:不补料组油脂产量为 220􀆰 01 mg / L
图 5  补料对微生物油脂产量的影响
Fig􀆰 5  Effects of fed⁃batch on lipid yield
81 生  物  加  工  过  程    第 12卷 
由图 5可知:各种补料方案对油脂产量均较不
补料组有大幅度提高,且以仅补 C 源组增幅最大。
这是由于补充 N源后,培养基中 N源增加,C源和 N
源被优先用于菌体生长,随着 N 源逐渐被利用,N
源成为限制性营养因素,这时,菌体才开始把所吸
收的 C 源物质大部分转化成油脂。 在发酵 48 h 和
发酵 72 h开始补料,油脂产量和底物利用率相差不
大。 发酵 48 h 开始补料,油脂产量最大为 598􀆰 96
mg / L,底物利用率为 2􀆰 3%;发酵 72 h 开始补料,油
脂产量最大, 为 611􀆰 63 mg / L, 底物利用率为
2􀆰 35%。 但结合发酵周期及经济效益,发酵 48 h 开
始补料发酵周期比发酵 72 h开始补料发酵周期短,
经济效益较大。 因此,选择发酵 48 h 作为补料开始
时间,且可监测发酵过程 pH 变化,在 pH 2􀆰 5 时开
始补料。
在确定补料成分后,考察单次补料量对油脂产
量的影响,结果见表 1。
由表 1可知:随着单次补料量的增加,油脂产量
逐渐增加,直至单次补料量为 4 g 时,油脂产量最高,
此后,随着单次补料量的进一步增加,油脂产量降低。
这是由于补料量过大时,体系黏度较大,溶氧不足,影
响油脂合成。 因此单次补加 4 g 可溶性淀粉为最适
补料量,此时底物利用率高,且油脂产量最大,油脂产
量较不补料时增加 521􀆰 74 mg,增长率为 237􀆰 1%。
表 1  补料浓度对微生物油脂产量的影响
Table 1  Effects of feeding culture concentration on lipid yield
m(单次补料量) /

m(共补加淀粉) /

ρ(残糖) /
(g·L-1)
ρ(DCW) /
(g·L-1)
ρ(油脂) /
(mg·L-1)
油脂含量 /

底物利用率 /

2 6 2􀆰 80 11􀆰 65 611􀆰 63 5􀆰 25 2􀆰 35
3 9 3􀆰 65 12􀆰 60 670􀆰 32 5􀆰 32 2􀆰 64
4 12 5􀆰 14 12􀆰 90 741􀆰 75 5􀆰 75 2􀆰 76
5 15 8􀆰 47 12􀆰 21 608􀆰 06 4􀆰 98 2􀆰 29
3  结  论
通过研究得出如下结论:
1)发酵所得微生物油脂,其主要成分含量为硬
脂酸 39􀆰 90%,油酸 31􀆰 70%和亚油酸 27􀆰 30%。
2)单批发酵的最适可溶性淀粉为 20 g / L,最适
玉米浆为 3 g / L;N源对菌体增长有促进作用。
3)油脂合成主要在发酵 48 ~ 96 h 进行,单批发
酵最佳时间为 5 d。
4)通过补料工艺研究可知,最适起始补料时间
点为发酵 48 h,最适单次补料量为 4 g,此时,油脂产
量可增加 521􀆰 74 mg,增长率为 237􀆰 1%。
通过研究表明,N源对菌株的生长有促进作用,
N源浓度较大时,培养基中 C 源和 N 源优先用于菌
体细胞生长,采用限氮补料工艺可大幅度提高微生
物油脂的产量。 发酵所得微生物油脂富含硬脂酸、
油酸和亚油酸,均是重要的化工原料,可广泛应用
于橡胶、医药和日用品等行业。
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(责任编辑  荀志金)
91  第 4期 赖  婧等:长孢被孢霉利用淀粉质原料发酵产微生物油脂