全 文 ：第 １３卷第 ４期
２０１５年 ７月
生　 物　 加　 工　 过　 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ􀆰 １３ Ｎｏ􀆰 ４
Ｊｕｌ􀆰 ２０１５
ｄｏｉ：１０􀆰 ３９６９ ／ ｊ􀆰 ｉｓｓｎ􀆰 １６７２－３６７８􀆰 ２０１５􀆰 ０４􀆰 ００１
收稿日期：２０１４－０１－２０
基金项目：国家自然科学基金（２１３７６００２，２１４７６１１１）；江苏省自然科学基金（ＢＫ２０１３１４０５）；国家科技支撑计划（２０１１ＢＡＤ２３Ｂ０３）；江苏高校优势学
科建设工程
作者简介：聂志奎（１９８５—），男， 江西吉安人，博士研究生，研究方向：生物化工；纪晓俊（联系人），副教授，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｘｉａｏｊｕｎｊｉ＠ ｎｊｔｅｃｈ．ｅｄｕ．ｃｎ
高山被孢霉发酵产花生四烯酸油脂的补料工艺
聂志奎，纪晓俊，商静生，颜佳铖，张瑷珲，黄　 和
（南京工业大学 生物与制药工程学院 材料化学工程国家重点实验室，江苏 南京 ２１０００９）
摘　 要：为了缩短高山被孢霉（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）产花生四烯酸（ＡＲＡ）油脂发酵周期，以提高 ＡＲＡ 油脂生产强度，
主要研究了不同底物流加方式对 Ｍ􀆰 ａｌｐｉｎａ产 ＡＲＡ油脂的影响。 考察分批发酵、残糖反馈补料分批发酵对 ＡＲＡ油
脂发酵的影响，并进一步在残糖反馈补料发酵的基础上建立了一种反复补料分批发酵工艺。 结果表明：与分批发
酵相比，虽然细胞干质量和油脂浓度变化不显著，但是残糖反馈补料方式 ＡＲＡ 生产强度从 ０􀆰 ９３ 提高至 １􀆰 ３３
ｇ ／ （Ｌ·ｄ）。 在残糖反馈补料基础上反复补料分批发酵一共进行了 ４ 批，细胞干质量稳定在 ３０ ｇ ／ Ｌ 左右，油脂含量
稳定在 ５０％左右，ＡＲＡ含量分别达到 ４２􀆰 ８１％、４３􀆰 １７％、４２􀆰 ３０％和 ３９􀆰 ７１％。
关键词：高山被孢霉；花生四烯酸油脂；补料分批发酵；反复补料分批发酵
中图分类号：Ｑ８１５　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２－３６７８（２０１５）０４－０００１－０６
Ａｒａｃｈｉｄｏｎｉｃ ａｃｉｄ⁃ｒｉｃｈ ｏｉｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ ｕｓｉｎｇ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｆｅｅｄｉｎｇ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ
ＮＩＥ Ｚｈｉｋｕｉ，ＪＩ Ｘｉａｏｊｕｎ，ＳＨＡＮＧ Ｊｉｎｇｓｈｅｎｇ，ＹＡＮ Ｊｉａｃｈｅｎｇ，ＺＨＡＮＧ Ａｉｈｕｉ，ＨＵＡＮＧ Ｈｅ
（Ｓｔａｔｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ⁃Ｏｒｉｅｎｔｅｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ
Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｎａｎｊｉｎｇ Ｔｅｃｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ ２１０００９，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｏ ｓｈｏｒｔｅｎ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｃｙｃｌｅ ｏｆ ａｒａｃｈｉｄｏｎｉｃ ａｃｉｄ （ ＡＲＡ）⁃ｒｉｃｈ ｏｉｌ ａｎｄ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｔｈｅ
ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ，ｗｅ ｓｔｕｄｉｅｄ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｆｅｅｄｉｎｇ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ （ＡＲＡ）⁃
ｒｉｃｈ ｏｉｌ ｂｙ Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ． Ｂａｔｃｈ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｓｉｄｕａｌ ｇｌｕｃｏｓｅ ｆｅｅｄｂａｃｋ ｆｅｄ⁃ｂａｔｃｈ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ
ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ，ａｓ ｗｅｌｌ ａｓ ａ ｒｅｐｅａｔｅｄ ｆｅｄ⁃ｂａｔｃｈ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｔｈａｔ ｗａｓ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｂａｓｉｓ ｏｆ ｒｅｓｉｄｕａｌ
ｇｌｕｃｏｓｅ ｆｅｅｄｂａｃｋ ｆｅｄ⁃ｂａｔｃｈ． Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｂａｔｃｈ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ， ＡＲＡ ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｒｅｓｉｄｕａｌ ｇｌｕｃｏｓｅ
ｆｅｅｄｂａｃｋ ｆｅｄ⁃ｂａｔｃｈ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｆｒｏｍ ０􀆰 ９３ ｔｏ １􀆰 ３３ ｇ ／ （Ｌ·ｄ）． Ｆｏｕｒ ｂａｔｃｈｅｓ ｗｅｒｅ ｃａｒｒｉｅｄ ｏｕｔ ｆｏｒ
ｒｅｐｅａｔｅｄ ｆｅｄ⁃ｂａｔｃｈ ｃｕｌｔｕｒｅ， ｉｎ ｗｈｉｃｈ ｔｈｅ ｂｉｏｍａｓｓ ｒｅｍａｉｎｅｄ ｓｔａｂｌｅ ａｒｏｕｎｄ ３０ ｇ ／ Ｌ ａｎｄ ｌｉｐｉｄ ｃｏｎｔｅｎｔｓ
ｒｅｍａｉｎｅｄ ｓｔａｂｌｅ ａｒｏｕｎｄ ５０％． ＡＲＡ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｉｎ ｔｏｔａｌ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｗｅｒｅ ４２􀆰 ８１％，４３􀆰 １７％，４２􀆰 ３０％，ａｎｄ
３９􀆰 ７１％，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ；ａｒａｃｈｉｄｏｎｉｃ ａｃｉｄ⁃ｒｉｃｈ ｏｉｌ；ｆｅｄ⁃ｂａｔｃｈ；ｒｅｐｅａｔｅｄ ｆｅｄ⁃ｂａｔｃｈ
　 　 花生四烯酸（ａｒａｃｈｉｄｏｎｉｃ ａｃｉｄ，ＡＲＡ，即 ５，８，１１，
１４ 二十碳四烯酸）是一种在人类健康生活中扮演
着重要角色的营养物质，属于 ω ６ 系列长链多不
饱和脂肪酸，是人体中含量最高、分布最广和活跃
度最高的一种必需脂肪酸［１－２］。 ＡＲＡ是许多生理活
性物质，比如前列腺素、环前列腺素和白三烯等类
二十烷酸衍生物的直接前体［３－４］，ＡＲＡ 具有多种生
物活性，在促进智力发育、提高人体视力、增强免疫
力和抗癌等方面具有重要作用，在生物医药、化妆
品、功能性食品和保健品等领域都有着广泛的应用
前景［５－６］。
在过去的二十多年里，利用高山被孢霉发酵生
产 ＡＲＡ油脂已经取得很大成功。 丛蕾蕾等［７］选用
抗氧化剂———没食子酸辛酯为筛选剂，经过紫外
ＬｉＣｌ 复合诱变，筛选出抗脂肪酸脱氢酶抑制剂的
ＡＲＡ高产菌株，ＡＲＡ 占总油脂含量达到 ４１􀆰 ７２％。
Ｐｅｎｇ等［８］采用双阶段的发酵过程取代恒温发酵过
程，提高了总油脂和 ＡＲＡ含量，并添加 ４％的正己烷
作为氧载体［９］能有效地增大溶氧和氧传质系数，最
终增加生物量、总油脂量和 ＡＲＡ 的浓度。 邓中涛
等［１０］在此基础上进一步提出三阶段发酵的方法，更
加精细地调控发酵过程，从而提高 ＡＲＡ 油脂产量。
但在 ＡＲＡ油脂的工业化发酵过程中仍存在着菌体
形态难以控制、发酵周期长等问题。 因此，如何进
一步提高发酵法生产 ＡＲＡ油脂的细胞干质量、油脂
含量、ＡＲＡ 占总脂肪酸的百分比以及缩短发酵周
期、提高 ＡＲＡ油脂生产强度成为了推动发酵法生产
ＡＲＡ油脂持续研究的关键。 高山被孢霉产 ＡＲＡ 油
脂的发酵周期一般在 ７～１２ ｄ。 发酵周期较长，致使
工业生产效率低，成本较高。 邓开野等［１１］和潘丽军
等［１２］利用分批补料工艺来缩短菌种发酵周期，提高
ＡＲＡ油脂生产强度。
培养方式的优化是实现发酵过程优化控制的
关键步骤。 近年来，补料培养技术不断发展，在大
规模工业化生产上越来越被关注［１３－１４］。 补料培养
技术不但可以消除高浓度葡萄糖的阻遏效应，还可
以避免微生物在代谢过程中积累的代谢产物所产
生的毒害作用。 补料培养技术适合于不断改变底
物浓度而提高目标代谢产物产量的研究［１５］。
笔者主要从缩短 ＡＲＡ 油脂发酵周期以提高
ＡＲＡ油脂的生产强度出发，通过研究不同的底物流
加方式，在保证油脂产量不降低的情况下，对比优
化不同的补料流加策略，缩短高山被孢霉产 ＡＲＡ油
脂的发酵周期，以获得一种适合 ＡＲＡ油脂工业化生
产工艺。
１　 材料与方法
１􀆰 １　 菌种
高山被孢霉 Ｒ８０７（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ Ｒ８０７） ［７］，已
在中国典型培养物保藏中心（ＣＣＴＣＣ）保藏，保藏日期
２０１２年 ４月 ２３日，保藏编号为 ＣＣＴＣＣ Ｍ ２０１２１１８。
１􀆰 ２　 培养基
１􀆰 ２􀆰 １　 固体培养基
新鲜去皮马铃薯 ２００ ｇ，煮沸后计时 ３０ ｍｉｎ，４
层纱布过滤去渣，加葡萄糖 ２０ ｇ，琼脂 ２５ ｇ，加水定
容至 １ Ｌ；ｐＨ自然，１２１ ℃下灭菌 ３０ ｍｉｎ。
１􀆰 ２􀆰 ２　 种子液体培养基
种子液体培养基（ｇ ／ Ｌ）：葡萄糖 ３０， 酵母膏 ６，
ＫＨ２ＰＯ４ ３， ＮａＮＯ３ ３，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２ Ｏ ０􀆰 ５； ｐＨ 自然。
１１５ ℃下灭菌 ３０ ｍｉｎ。
１􀆰 ２􀆰 ３　 发酵液体培养基
分批发酵液体培养基（ｇ ／ Ｌ）：葡萄糖 ８０，酵母膏
１０，ＫＨ２ＰＯ４ ４，ＮａＮＯ３ ３，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０􀆰 ６；流加 ２５０
ｇ ／ Ｌ葡萄糖。
补料分批发酵培养基（ｇ ／ Ｌ）：初始葡萄糖 ４０ 或
者 ２０，酵母膏 １０，ＫＨ２ＰＯ４ ４，ＮａＮＯ３ ３，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ
０􀆰 ６；流加 ２５０ ｇ ／ Ｌ葡萄糖。
反复分批补料发酵（ｇ ／ Ｌ）：初始葡萄糖 ２０，酵母
膏 １０，ＫＨ２ＰＯ４ ４，ＮａＮＯ３ ３，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０􀆰 ６；流加
２５０ ｇ ／ Ｌ葡萄糖。
以上培养基调 ｐＨ为 ６􀆰 ０，１１５ ℃下灭菌 ３０ ｍｉｎ。
１􀆰 ３　 培养方法
１􀆰 ３􀆰 １　 斜面和平板培养
将 Ｍ􀆰 ａｌｐｉｎａ Ｒ８０７ 接种于 ＰＤＡ 试管斜面或茄
子瓶，２５～２８ ℃培养 ５～７ ｄ，待固体培养基表面长满
菌丝体即可制备种子培养液。
１􀆰 ３􀆰 ２　 种子培养
取已培养好的新鲜斜面菌种，用无菌生理盐水
洗下菌丝，接种于新鲜种子培养基中，在 １２０ ｒ ／ ｍｉｎ、
２５～２８ ℃下培养 ２４～４８ ｈ。
１􀆰 ３􀆰 ３　 发酵培养
利用 ７􀆰 ５ Ｌ ＮＢＳ １１０ 型机械搅拌发酵罐培养。
将 ５００ ｍＬ摇瓶中活化好的种子液按 １０％的接种量
接入发酵罐中培养，装液量为 ５ Ｌ，初始 ｐＨ ６􀆰 ０。 培
养条件：０～８ ｈ ０ ｒ ／ ｍｉｎ；８～２４ ｈ １００ ｒ ／ ｍｉｎ；２４ ｈ至发
酵结束 １８０ ｒ ／ ｍｉｎ，２５ ℃，５ Ｌ ／ ｍｉｎ（转速采取分阶段
调控，主要考虑到高山被孢霉是一种对剪切敏感的
丝状真菌，如果前期转速高菌丝体容易受到破坏，
最后导致发酵失败）。
１􀆰 ４　 分析方法
１􀆰 ４􀆰 １　 葡萄糖浓度的测定
利用 ＳＢＡ ４０Ｃ 型生物传感仪（山东省科学院
２ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷　
生物研究所）测定葡萄糖浓度。
１􀆰 ４􀆰 ２　 干菌体的收集与测定
利用菌丝体干质量法测定干菌体，将培养物抽
滤，并用蒸馏水洗涤 ３ 次。 抽干后，６０ ℃烘干至恒
质量（含水量在 ４％以下），称质量。
１􀆰 ４􀆰 ３　 总油脂的提取
将烘干的菌体在研钵中破碎，研磨成粉末。 然
后准确称 １ ｇ，用滤纸包裹好之后，利用索氏提取仪
（ＳＺＦ ０６ＧＩ型粗脂肪测定仪） 加入 ５０ ｍＬ 石油醚，
抽提 ３ ｈ。 此方法用于提取高山被孢霉菌丝体内油
脂，质量浓度计算见式（１）。
ρ ＝ ｍ ／ Ｖ （１）
式中：ρ为油脂质量浓度（ｇ ／ Ｌ），ｍ 为总胞内油脂质
量（ｇ），Ｖ为发酵液体积（Ｌ）。
１􀆰 ４􀆰 ４　 ＡＲＡ含量测定
混合脂肪酸甲酯的制备：取油脂 ０􀆰 １ ｇ（或干菌
体 ０􀆰 ２ ｇ）于 １０ ｍＬ 容量瓶中，加入 ５％ ＫＯＨ 甲醇
溶液（质量体积比）１ ｍＬ，６０ ℃水浴 １０ ｍｉｎ。 取出容
量瓶，室温冷却 ５ ｍｉｎ，加入甲醇 ２ ｍＬ，三氟化硼 乙
醚溶液 １􀆰 ５ ｍＬ，充分振荡混匀，６０ ℃水浴 １０ ｍｉｎ。
取出容量瓶，室温冷却 ５ ｍｉｎ，加入正己烷 ２ ｍＬ，充
分振荡混匀，静置 １０ ｍｉｎ。 取上层清液 ０􀆰 １ ｍＬ 于
１􀆰 ５ ｍＬ离心管中，加入 ０􀆰 ９ ｍＬ正己烷，再加入少许
无水 Ｎａ２ＳＯ４（用于吸水），取 １􀆰 ０ μＬ进样。
气相色谱 质谱 （ ＧＣ ＭＳ）条件：用 Ｔｈｅｒｍｏ
ｆｉｎｎｉｇａｎ ｔｒａｃｅ ＧＣ２０００ ＤＳＱ 型气相色谱质谱联用仪
测定菌油脂肪酸组成。 ＤＢ ５ＭＳ 型石英毛细管柱
（３０ ｍ×０􀆰 ２５ ｍｍ×０􀆰 ２５ μｍ）。 进样室温度 ２５０ ℃，
载气为 Ｈｅ，载气流速 １ ｍＬ ／ ｍｉｎ。 程序升温：初温
８０ ℃，以 ４０ ℃ ／ ｍｉｎ 升温至 ２００ ℃，然后 １０ ℃ ／ ｍｉｎ
升温至 ３００ ℃。 传输线温度 ２５０ ℃，电离方式 ＥＩ，
７０ ｅＶ，扫描范围 ５０～６００ ａｕｍ［１０］。
２　 结果与讨论
２􀆰 １　 ＡＲＡ油脂分批发酵过程的特点
ＡＲＡ油脂分批发酵进程如图 １所示。
由图 １可知：在整个分批发酵过程中，随着葡萄
糖的消耗，细胞干质量（ＤＣＷ）逐渐增加，前期葡萄
糖浓度较高，因为菌体在前 １２ ｈ 处于适应阶段，１２
ｈ后菌体在营养充足的条件下迅速增长。 培养 ６０ ｈ
后，菌体内的油脂开始大量积累，此时细胞干质量
还在进一步增加。 油脂浓度随细胞干质量增加而
不断增加，尤其在对数生长期后期和稳定期，油脂
图 １　 ＡＲＡ油脂分批发酵进程
Ｆｉｇ􀆰 １　 Ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ ＡＲＡ⁃ｒｉｃｈ ｏｉｌ ｂａｔｃｈ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ
大量积累，此阶段是油脂积累的关键阶段。 发酵中
后期，细胞干质量随时间变化趋势与油脂含量随时
间变化趋势类似。 从葡萄糖消耗曲线可以发现，在
发酵起始阶段，葡萄糖消耗较慢，这是因为菌体细
胞主要利用培养基中丰富的氮源进行快速增殖。
而在发酵培养 ６０ ｈ 后，氮源基本耗尽，葡萄糖消耗
速度加快主要用于油脂的合成，胞内油脂浓度逐渐
增加。 整个发酵持续 １６８ ｈ，发酵周期较长，ＡＲＡ 生
产强度仅为 ０􀆰 ９３ ｇ ／ （Ｌ·ｄ）。 分批发酵前期，葡萄糖
浓度高，耗糖速度慢，发酵结束后发现菌丝体呈丝
状，未能呈球形，这与 Ｔｏｔａｎｉ 等［１６］研究发现的高糖
会诱发菌丝体呈丝状，导致发酵液黏度增加，传质
和溶氧都将会受到限制的结果一致。
２􀆰 ２　 ＡＲＡ油脂残糖反馈补料发酵
２􀆰 ２􀆰 １　 初糖 ４０ ｇ ／ Ｌ、残糖控制在 ２０～４０ ｇ ／ Ｌ
在初始葡萄糖质量浓度为 ４０ ｇ ／ Ｌ 的补料分批
发酵过程中，当葡萄糖质量浓度降至 ２０ ｇ ／ Ｌ 左右
时，流加葡萄糖溶液维持其在 ２０～４０ ｇ ／ Ｌ，发酵进程
如图 ２所示。
图 ２　 初糖 ４０ ｇ ／ Ｌ、残糖控制在 ２０～ ４０ ｇ ／ Ｌ发酵进程
Ｆｉｇ􀆰 ２　 Ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ ＡＲＡ⁃ｒｉｃｈ ｏｉｌ ｆｅｄ⁃ｂａｔｃｈ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ
ｉｎｉｔｉａｌ ｇｌｕｃｏｓｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ４０ ｇ ／ Ｌ ｗｉｔｈ ｒｅｓｉｄｕａｌ
ｇｌｕｃｏｓｅ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ａｔ ２０⁃４０ ｇ ／ Ｌ
由图 ２可知：１２０ ｈ 第 ４ 次补糖后，细胞干质量
３　 第 ４期 聂志奎等：高山被孢霉发酵产花生四烯酸油脂的补料工艺
达到 ２５􀆰 ４２ ｇ ／ Ｌ，残糖 １４ ｇ ／ Ｌ，发现糖耗速度变慢，如
果进一步流加葡萄糖，最后糖难以耗尽，会导致
ＡＲＡ含量变低。 因此，第 ４ 次流加葡萄糖后，待糖
耗尽，发酵结束。 细胞干质量在 ２４ ｈ 时达到 ７􀆰 １２
ｇ ／ Ｌ，此时菌体利用培养基中的丰富氮源大量增殖
菌体，２４ ｈ后耗糖速度明显加快，到 ４８ ｈ 后，葡萄糖
质量浓度降至 ２０ ｇ ／ Ｌ 开始补料。 整个发酵期间延
滞期较短，菌体从 １２ ｈ 后结束延滞期，１２ ～ ９６ ｈ 菌
体快速生长，去油生物量增长较快（从 ３􀆰 ２７ 增至
１２􀆰 ９６ ｇ ／ Ｌ），９６ ｈ后菌体进入稳定期，去油生物量增
长缓慢，细胞干质量进一步的增加主要是油脂的快
速积累。 整个发酵持续 １５６ ｈ，比分批发酵缩短 １２
ｈ，最终细胞干质量达到 ２９􀆰 ０６ ｇ ／ Ｌ，油脂质量浓度
１４􀆰 ５５ ｇ ／ Ｌ，ＡＲＡ 含量和质量浓度分别为 ４１􀆰 ３％和
６􀆰 ０１ ｇ ／ Ｌ。 与分批发酵相比，细胞干质量、油脂浓度
及 ＡＲＡ浓度都有所下降，但 ＡＲＡ 含量和生产强度
变化不显著。
２􀆰 ２􀆰 ２　 初糖 ２０ ｇ ／ Ｌ、残糖控制在 １０～２０ ｇ ／ Ｌ
在初始葡萄糖质量浓度为 ２０ ｇ ／ Ｌ的补料分批发
酵过程中，当葡萄糖质量浓度降至 １０ ｇ ／ Ｌ 左右时流
加葡萄糖溶液，发酵进程如图 ３ 所示。 由图 ３ 可知：
整个发酵期间葡萄糖浓度维持在 １０ ～ ２０ ｇ ／ Ｌ，１２０ ｈ
时残糖为 ７ ｇ ／ Ｌ，此时耗糖速度在 ０􀆰 ５ ｇ ／ （Ｌ·ｈ）左右，
比发酵中期要慢，细胞干质量达到 ２９􀆰 ４ ｇ ／ Ｌ，与前面
的补料方式相比有显著提高，１２０ ｈ最后 １次补糖，待
糖耗完发酵结束，整个发酵持续 １４４ ｈ。 最终细胞干
质量达到 ３１􀆰 ７９ ｇ ／ Ｌ，与分批发酵以及“２􀆰 ２􀆰 １”补料方
式相比，虽然细胞干质量变化不显著，但是发酵周期
进一步缩短至 １４４ ｈ。 发酵结束时油脂质量浓度和
ＡＲＡ含量分别为 １５􀆰 ７４ ｇ ／ Ｌ、４２􀆰 ５５％，油脂浓度及
ＡＲＡ含量与分批发酵相比变化不显著。
图 ３　 初糖 ２０ ｇ ／ Ｌ、残糖控制在 １０～ ２０ ｇ ／ Ｌ发酵进程
Ｆｉｇ􀆰 ３　 Ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ ＡＲＡ⁃ｒｉｃｈ ｏｉｌ ｆｅｄ⁃ｂａｔｃｈ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ
ｉｎｉｔｉａｌ ｇｌｕｃｏｓｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ２０ ｇ ／ Ｌ ｗｉｔｈ ｒｅｓｉｄｕａｌ
ｇｌｕｃｏｓｅ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ａｔ １０⁃２０ ｇ ／ Ｌ
２􀆰 ２􀆰 ３　 初糖 ２０ ｇ ／ Ｌ、残糖控制在 ５～１０ ｇ ／ Ｌ
在前两次补料分批发酵研究中分别将糖质量
浓控制在 ２０ ～ ４０ ｇ ／ Ｌ 以及 １０ ～ ２０ ｇ ／ Ｌ，已经取得一
些效果。 进一步降低残糖浓度，当葡萄糖质量浓度
降至 ５ ｇ ／ Ｌ 左右时补 １００ ～ ２００ ｍＬ ２５０ ｇ ／ Ｌ 葡萄糖
溶液，将发酵液中葡萄糖维持在 ５～１０ ｇ ／ Ｌ。 如果糖
质量浓度低于 ５ ｇ ／ Ｌ时油脂会被降解用于维持细胞
的基本生长，发酵进程如图 ４所示。 由图 ４可知：整
个发酵持续 １２０ ｈ，发酵周期由最初分批发酵的 ７ ｄ
降至 ５ ｄ，与前两种补料方式相比也明显缩短，生产
强度显著提高。 最终，细胞干质量、油脂质量浓度
和 ＡＲＡ 含量分别达到 ２９􀆰 ７３ ｇ ／ Ｌ、 １５􀆰 ５４ ｇ ／ Ｌ 和
４２􀆰 ８１％。 ＡＲＡ生产强度达到 １􀆰 ３３ ｇ ／ （Ｌ·ｄ），比分
批发酵的结果提高近 ４５％。 菌丝的形态都是呈大
小均一的小颗粒状，菌球边缘呈绒毛状有利于 ＡＲＡ
的合成［１７］。
图 ４　 初糖 ２０ ｇ ／ Ｌ、残糖控制在 ５～ １０ ｇ ／ Ｌ发酵进程
Ｆｉｇ􀆰 ４　 Ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ ＡＲＡ⁃ｒｉｃｈ ｏｉｌ ｆｅｄ⁃ｂａｔｃｈ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ
ｉｎｉｔｉａｌ ｇｌｕｃｏｓｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ２０ ｇ ／ Ｌ ｗｉｔｈ ｒｅｓｉｄｕａｌ
ｇｌｕｃｏｓｅ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ａｔ ５⁃１０ ｇ ／ Ｌ
２􀆰 ３　 ＡＲＡ油脂反复补料分批发酵
由于高山被孢霉种子培养非常关键并且耗时
长，通常从斜面活化一批种子要 ３􀆰 ５ ｄ，一级种子活
化要 １􀆰 ５ ｄ，二级种子活化要 １ ｄ，一批种子培养需要
６ ｄ，接近发酵周期，种子形态控制不好还会直接影
响发酵结果。 虽然种子的培养和发酵过程可以独
立，不直接影响发酵周期，但是会直接增加人力物
力成本，进而提高 ＡＲＡ油脂的生产成本。 在微生物
培养过程中，采用反复补料分批发酵工艺，由于只
需 １次菌种活化及种子培养，就可以进行多个批次
的发酵，将显著缩短发酵时间，可以有效地提高设
备利用率以及生产效率［１８－２０］，该工艺在许多工业发
酵过程中都得到了广泛的应用。
在控制残糖 ５ ～ １０ ｇ ／ Ｌ 的补料策略基础上进一
４ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷　
步进行反复补料分批发酵，即将上一次发酵结束的
发酵液留下 １０％体积作为种子加入新鲜培养基继
续进行补料发酵或者取出 １０％体积发酵液至另一
个发酵罐中继续进行补料发酵。 反复分批发酵进
行了 ４个批次，发酵过程曲线如图 ５ 所示。 由图 ５
可知：整个发酵持续了 ２０ ｄ，４ 批发酵细胞干质量分
别是 ２９􀆰 ７３、３１􀆰 ４２、３０􀆰 ５４ 和 ３２􀆰 ７２ ｇ ／ Ｌ。 油脂含量
稳定在 ５０％左右，与前面的补料分批发酵以及分批
发酵相比没有明显的变化，每一批发酵周期都是
５ ｄ，葡萄糖刚耗完时继续下一批发酵，ＡＲＡ 含量分
别是 ４２􀆰 ８１％、４３􀆰 １７％、４２􀆰 ３０％和 ３９􀆰 ７１％，到第 ４
批时 ＡＲＡ含量略微下降，第 ４批结束后没有进一步
发酵，可能发酵培养液活力已经不够，菌种性能降
低。 因此，考察此过程中的菌丝形态变化情况，结
果见图 ６。 由图 ６ 可知：越到后期菌球形成的颗粒
越大，菌球内部呈空状，表面呈致密结构，这可能造
成传质和传氧受限制，导致 ＡＲＡ含量降低。 同时还
发现以上一批发酵液作为种子，种子抗剪切能力增
强，搅拌转速前期就可以设定在 １８０ ｒ ／ ｍｉｎ，菌丝体
　 　 　 　
不会打碎。 因此，不需要在发酵过程中改变转速，
操作更简单。
图 ５　 ＡＲＡ油脂反复补料分批发酵进程
Ｆｉｇ􀆰 ５　 Ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ ＡＲＡ⁃ｒｉｃｈ ｏｉｌ ｒｅｐｅａｔｅｄ
ｆｅｄ⁃ｂａｔｃｈ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ
（ａ） ～ （ｄ）分别是补料批次 １～４的菌体形态
图 ６　 ＡＲＡ油脂反复补料分批发酵各批次形态
Ｆｉｇ􀆰 ６　 Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ｏｆ ｅｖｅｒｙ ｂａｔｃｈ ｉｎ ｒｅｐｅａｔｅｄ ｆｅｄ⁃ｂａｔｃｈ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ
２􀆰 ４　 不同补料方式对 ＡＲＡ油脂生产的对比
表 １为不同补料培养方式下 ＡＲＡ 发酵结束后
各项发酵指标的对比结果。 由表 １ 可知：细胞干质
量、油脂质量浓度及 ＡＲＡ含量下，差别不显著，细胞
干质量基本稳定在 ３０ ｇ ／ Ｌ左右，油脂含量和油脂质
量浓度也基本维持在 ５０％和 １５ ｇ ／ Ｌ 左右，ＡＲＡ 含
量除了反复补料分批发酵的第 ４ 批（由于种子活力
下降）在 ４０％以下外，其余均在 ４０％以上。 从表 １
５　 第 ４期 聂志奎等：高山被孢霉发酵产花生四烯酸油脂的补料工艺
中还可以看到，变化最明显的是发酵周期和生产强
度，发酵周期由最初的分批发酵 ７ ｄ降至 ５ ｄ，生产强
度由最初的 ０􀆰 ９３ ｇ ／ （Ｌ·ｄ），提高到 １􀆰 ３３ ｇ ／ （Ｌ·ｄ），提
高近 ４５％。 综合考虑细胞干质量、油脂含量、ＡＲＡ
产量和 ＡＲＡ生产强度等方面的因素，最终确定初糖
质量浓度在 ２０ ｇ ／ Ｌ，发酵过程糖质量浓度控制在 ５～
１０ ｇ ／ Ｌ是 Ｍ􀆰 ａｌｐｉｎａ Ｒ８０７ 发酵生产 ＡＲＡ 最佳的补
料培养方式。
表 １　 不同补料方式下 ＡＲＡ油脂发酵过程参数比较
Ｔａｂｌｅ １　 Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｒｅｓｕｌｔｓ ｆｏｒ ＡＲＡ⁃ｒｉｃｈ ｏｉｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｕｎｄｅｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ
培养方式 ρ（ＤＣＷ） ／（ｇ·Ｌ－１）
ρ（油脂） ／
（ｇ·Ｌ－１）
ｍ（ＡＲＡ）
ｍ（总脂肪酸）
／ ％ ρ（ＡＲＡ） ／（ｇ·Ｌ－１） 发酵周期 ／ ｄ
ＡＲＡ生产强度 ／
（ｇ·Ｌ－１·ｄ－１）
ａ ３０􀆰 ２１ １５􀆰 ７１ ４１􀆰 ３０ ６􀆰 ４９ ７ ０􀆰 ９３
ｂ ２９􀆰 ０６ １４􀆰 ５５ ４１􀆰 ３０ ６􀆰 ０１ ６􀆰 ５ ０􀆰 ９２
ｃ ３１􀆰 ７９ １５􀆰 ７４ ４２􀆰 ６０ ６􀆰 ７０ ６ １􀆰 １７
ｄ ２９􀆰 ７３ １５􀆰 ５４ ４２􀆰 ８１ ６􀆰 ６５ ５ １􀆰 ３３
ｅ ３１􀆰 ４２ １５􀆰 ７５ ４３􀆰 １７ ６􀆰 ８０ ５ １􀆰 ３６
ｆ ３０􀆰 ５４ １５􀆰 ９１ ４２􀆰 ３０ ６􀆰 ５７ ５ １􀆰 ３１
ｇ ３２􀆰 ７２ １６􀆰 ７２ ３９􀆰 ７１ ６􀆰 ６３ ５ １􀆰 ３３
　 注：ａ～ ｇ分别是分批发酵、初糖 ４０ ｇ ／ Ｌ残糖控制在 ２０～４０ ｇ ／ Ｌ补料分批发酵、初糖 ２０ ｇ ／ Ｌ残糖控制在 １０～２０ ｇ ／ Ｌ补料分批发酵、初糖 ２０ ｇ ／ Ｌ
残糖控制在 ５～１０ ｇ ／ Ｌ补料分批发酵（反复补料分批发酵第 １批）、反复补料分批发酵第 ２批、反复补料分批发酵第 ３批、反复补料分批发
酵第 ４批。
３　 结论
根据 ＡＲＡ油脂工业化生产的可操作性，考察了
不同残糖反馈流加工艺对高山被孢霉产 ＡＲＡ 油脂
的影响。 对比不同的残糖反馈流加工艺，发现初糖
质量浓度为 ２０ ｇ ／ Ｌ，发酵过程糖质量浓度控制在 ５～
１０ ｇ ／ Ｌ是 Ｍ􀆰 ａｌｐｉｎａ Ｒ８０７ 发酵生产 ＡＲＡ 油脂最佳
的补料方式。 与分批发酵相比，虽然细胞干质量、
油浓度、ＡＲＡ含量及 ＡＲＡ 浓度变化不显著，但是发
酵周期缩短 ２ ｄ，ＡＲＡ生产强度提高近 ４５％，这是目
前 ＡＲＡ油脂发酵报道的最短发酵周期。 在补料分
批发酵工艺的基础上，建立了一种反复分批补料发
酵工艺，培养 １次，种子可以反复进行 ４ 次发酵，最
终 ＡＲＡ含量都超过 ３８％。 由于只需 １ 次菌种活化
及种子培养，就可以进行多个批次的发酵，显著缩
短发酵时间，可以有效地提高设备利用率以及生产
效率。
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（下转第 ２２页）
６ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷