全 文 ：第 ! 卷第 # 期
$%&& 年 && 月
生"物"加"工"过"程
)8DEAJA+B=@EG>BC-DBU@BXAJJ0EFDEAA@DEF
fB>;! ,B;#
,Ba;$%&&
IBD%&%;!#!2P;DJJE;$ <#43;$%&&;%#;%%(
收稿日期%$%&& <%$ <&3
基金项目%国家自然科学基金资助项目"$%34#%&&#&北京市自然科学基金资助项目"$%4&%%$#&国家重点基础研究发展计划"!4 计划#资助项
目"$%%4)-4%43%1#&国家高技术研究发展计划"3# 计划#资助项目"$%%#LL%$%&%$$%%#LL%$%&%$$$%%#LL%$%$%&$$%%4LL&%%1%1$
$%%4)-4&1%1#
作者简介%李"倩"&!3##$女$湖北咸宁人$硕士研究生$研究方向%基因工程&谭天伟"联系人#$教授$0*HGD>%?\?GEgHGD>;6=X?;AI=;XE
5 乳酸脱氢酶在大肠杆菌 8[HBD"U#Q#中的表达
李"倩$王"梦$刘"珞$谭天伟
"北京化工大学 生命科学与技术学院 北京市生物加工过程重点实验室$北京 &%%%$!#
摘"要%为了在大肠杆菌中构建利用葡萄糖生产 - 乳酸的途径$以鼠李糖乳杆菌"-07$60+#),%"85$,),#.L %1
%& 基因组为模板$设计引物扩增 - 乳酸脱氢酶基因 -*#/"( 将该基因连接到表达载体 U0b*$3G"j#上$并转化大肠
杆菌bBU&%( 通过卡那霉素抗性平板筛选$提取重组质粒 U0b$3G*-A#/"并测序$结果正确( 将 U0b$3G*-A#/"转化大
肠杆菌-.*$&"/0#$通过卡那霉素抗性平板筛选$得到产乳酸的大肠杆菌基因工程菌( 经 O9bM诱导后$Y/Y*
9LM0电泳$检测到目的蛋白条带$- 乳酸脱氢酶比酶活力达到 !c11 R2H.( 该基因工程菌通过摇瓶发酵$- 乳酸
产量达到 F2.$成功构建出一条在大肠杆菌中生产 - 乳酸的新途径(
关键词%大肠杆菌&- 乳酸脱氢酶基因&鼠李糖乳杆菌
中图分类号%b5%$3c3""""文献标志码%L""""文章编号%$ <#43"$%&&#%# <%%$& <%(
#Z94011.2/275H65:F5F0G0-LG42;0/510./6,2"&%+2"+ 2$#+8[HBD"U#Q#
.O5DGE$SL,MTAEF$.OR.=B$bL,bDGE\AD
"-ADPDEF^ AV.G6B@G?B@VBC-DBU@BXAJJ$ )B>AFABC.DCAYXDAEXAGEI bAX8EB>BFV$
-ADPDEFREDaA@JD?VBC)8AHDXG>bAX8EB>BFV$ -ADPDEF&%%%$!$ )8DEG#
*J1F45:F%OE B@IA@?BXBEJ?@=X?GEA\HA?G6B>DXUG?8\GVBC>GX?DXGXDI DE 2,0"&%+0"+ 0$#+$ ?8A-07$60+#A
#),%"85$,),FAEBHA\GJ=JAI GJ?8A?AHU>G?A?BGHU>DCV?8A-*>GX?G?AIA8VI@BFAEGJAFAEA"-A#/"#;
b8AFAEA\GJDEJA@?AI DE?BaAX?B@BCU0b*$3G"j#$ ?8AE ?@GEJCB@HAI DE?B230$#+bBU&% GEI JX@AAEAI \D?8
A@V?8@BHVXDE;b8A@AJ=>?JJ8B\AI ?8G??8AJA_=AEXABC?8A@AXBH6DEGE?aAX?B@\GJXB@AX?;O?\GJ?@GEJ*
CB@HAI DE?B230$#+-.*$&"/0# \8DX8 DJIACDXDAE?BC-*>GX?G?AIA8VI@BFAEGJA;LC?A@DEI=X?DBE \D?8 O9bM$
?8A@AXBH6DEGE?U@B?ADE \GJGEG>V7AI GEI ?8AAE7VHAGX?DaD?V\GJHAGJ=@AI GJ!c11 R2H.;-B?8 @AJ=>?J
DEIDXG?AI ?8A-A#/" \GJA`U@AJJAI DE ?8A230$#+-.*$&"/0#;-V?8AC>GJW CA@HAE?G?DBE$ F2.-*>GX?G?A
GXDI \GJGX8DAaAI;
K0L M24G1%2,0"&%+0"+ 0$#+& -*>GX?G?AIA8VI@BFAEGJA& -07$60+#),%"85$,),
""人体内只有代谢 - 乳酸的 - 乳酸脱氢酶$所
以只有- 乳酸能被完全代谢$且不产生任何有毒副
作用的代谢产物( 同时$- 乳酸及其衍生物在医
药)食品)化工)酿造)香料)皮革)卷烟和印染等工
业领域都得到广泛的应用$所以 - 乳酸的生产和应
用研究备受重视*&+ ( 近年来$生物可降解材料
聚乳酸的广泛研究使得 - 乳酸的研究生产成为
热点*$+ (
能生产 - 乳酸的微生物很多$主要有乳酸菌*+ )
根霉菌*1+以及酵母菌*(+ ( 目前$人们主要研究利用乳
酸菌或者根霉菌生产 - 乳酸$致力于提高其纯度和
产量$以降低生产成本$但是由于菌株自身生长要求
的限制$无法实现进一步的突破( 而大肠杆菌作为模
式菌株$较其他微生物有着生长快)培养时间短)易于
控制)研究背景清晰)易于改造等优点*#+ $可探索利用
大肠杆菌生产 - 乳酸( 同时$大肠杆菌营养要求粗
放$不仅能利用葡萄糖$还能利用戊糖等五碳糖$易于
工业化放大生产( 但是$大肠杆菌本身不含有 - 乳
酸合成代谢途径中起着决定性作用的关键酶
- 乳酸脱氢酶*4+ ( 因此$本文以鼠李糖乳杆菌"-0A
7$60+#),%"85$,),#基因组为模板$以 ,)-O数据库
中的 - 乳 酸 脱 氢 酶 "MAE-GEW 基 因 序 列 号
]T&4!$# 基因序列设计引物扩增出 - 乳酸脱氢酶
基因 -A#/"( 将该基因连接到表达载体 U0b*$3G" j#
上$转化不含 - 乳酸脱氢酶的大肠杆菌-.*$&"/0#
中$以构建一条新的能够在大肠杆菌中利用葡萄糖生
产 - 乳酸的途径$并为继续优化代谢途径和共同利
用葡萄糖和木糖生产 - 乳酸提供平台(
D? 材料和方法
DND?菌株和载体
菌株%-07$60+#),%"85$,), %1 %&"利用葡
萄糖的乳酸生产菌#$230$#+*bBU&%$230$#+*-.$&
"/0#$笔者所在实验室保藏(
质粒%UT/&3*b*YDHU>A"氨苄青霉素"LHU#抗
性$$c4 W6#购于bG^GeG公司$U0b*$3G"j#"卡那霉
素" G^EG#抗性$(c W6#$笔者所在实验室保藏(
DNB?酶和试剂
b@GEJbG_ 酶$0`bG_ 酶$/,L限制性内切酶$
& W6 TG@WA@$/. $%%% TG@WA@$O9bM$=*FG>$丙酮酸
钠$,L/N等购于 bG^GeG公司&/,L*b1 连接酶购
于]A@HAE?GJ公司&凝胶回收试剂盒和质粒提取试剂
盒以及9)e产物回收试剂盒均购于博迈德"北京#
有限公司( 氨苄青霉素和卡那霉素购自欣京科"北
京#生物有限公司(
设计的引物由三博引物合成公司合成$基因测序
由奥科生物技术有限公司以及博迈德有限公司完成(
DNQ?培养基
鼠李糖乳杆菌采用 .L培养基"F2.#%葡萄糖
(%$酵母粉 &%$大豆蛋白胨 &%$,G)>%c%&$无水乙酸
钠 %c($柠檬酸铵 %c$$ N^
$
9[
1
%c$$TFY[
1
%c%!4 4$
TEY[
1
%c%% ((
大肠杆菌采用 .-培养基"F2.#%酵母粉 ($胰
蛋白胨 &%$,G)>&%(
DNV?扩增目的基因
设计 - 乳酸脱氢酶基因的引物$上游引物序列
为 XG?FFG?XXG?FFXGGF?G?GXFFG?GGFF$下游引物序列为
FXGX?XFGF?GX?FGXF?F??XFG?F?X$分别在上下游引物的
(0端引入了<8N
"
和="$
"
酶切位点( 9)e的反
应条件%!1 l HDE)!1 l % J)(4 l % J)4$ l
& HDE$% 个循环$4$ l &% HDE$1 l保藏( 用试剂
盒纯化回收9)e产物$将电泳验证后的回收产物与
UT/&3*b*YDHU>A载体连接$连接产物转化大肠杆菌
bBU&%$经过 =*FG>板子蓝白筛选$挑取白色菌落
9)e验证$试管培养提质粒进一步酶切验证$将验
证正确的重组质粒 b*-A#/"$送奥科生物技术公司
"北京#进行测序(
DNW?重组质粒的构建
将测序所得到验证的 b*-A#/"$用限制性内切酶
<8N
"
和="$
"
进行双酶切$同时$双酶切表达质粒
U0b*$3G"j#$凝胶回收双酶切产物$利用 /,L*b
1
连
接酶将双酶切后回收得到的目的基因片段 -A#/"和表
达载体 U0b*$3G"j#在 &# l下过夜连接$将连接产物
转化到大肠杆菌bBU&% 中$挑取菌落进9)e验证$试
管培养提质粒进一步酶切验证$将验证正确的重组质
粒送奥科生物技术公司"北京#进行测序( 提取得到
连接正确且测序结果正确的重组质粒 U0b$3G*-A#/"$
转化大肠杆菌-.*$&"/0#(
DN@?重组质粒的鉴定
挑取重组菌-.$&*U0b$3G*-A#/"的单菌落$菌落
9)e$并接种于 1 H.的 .-培养基"卡那霉素终质
量浓度为 (%
$
F2H.#中$4 l过夜培养$提取重组
质粒$电泳$酶切鉴定(
DN\?诱导表达
挑取重组菌-.$&*U0b$3G*-A#/"的单菌落$接种
于 1 H.的 .-培养基"(%
$
F2H.卡那霉素#中$
4 l过夜培养$以 &h的接种量从 .-试管中转接
至.-摇瓶培养基中"(%
$
F2H.卡那霉素#$4 l条
件下$$$% @2HDE 转速下培养$当 [/达到 %c3 时$加
入O9bM诱导 # 8$收集菌液$进行 Y/Y*9LM0鉴定(
DN^?乳酸脱氢酶酶活的测定
在 UN4c( 的条件下$-A.I8 在催化丙酮酸转化
为 - 乳酸的同时$不断将 ,L/N氧化成 ,L/$
,L/N在 1% EH处有吸收峰$而,L/无此吸收峰$
$$ 生"物"加"工"过"程"" 第 ! 卷"
使得,L/N在 1% EH处的吸光度"C
1%
#不断降低$
每分钟 1% EH波长吸光度减少的速度与 -*.I8 含
量成正比( 因此$连续测定酶反应过程中 1% EH处
吸光度的变化即可算出酶活*3+ ( 其活力单位定义%
在$( l$UN4c( 条件下C
1%
2HDE下降 &c% 与消光系
数
&
"#c$$ HHB>2".!XH##的比值为 & 个酶量单
位*!+ ( 可定量测定每毫升菌液中 -*.I8酶活( 收集
的菌体利用超声破碎$然后稀释制备酶液( 取 $ 只
石英比色皿$在 & 只比色杯中加入 %c& HHB>2.UN
4c( ^
$
N9[
1
*^N
$
9[
1
缓冲液 H.$再加入经稀释的
对照组菌液 $%
$
.$置于紫外分光光度计中$在
1% EH处将光吸收调节至零&另一只比色皿依次加
入丙酮酸钠溶液 $c! H.$ 再加入经稀释的酶液
$%
$
.$置于紫外分光光度计中$最后在比色皿中加
入,L[N溶液 %c& H.$混匀后立即计时$测 C
1%
$连
续测定 HDE$以 C
1%
对时间作图$取反应最初线性
部分$计算C
1%
2HDE减少值(
图 B?9RUERD^HEH!.I960载体"消除了多克隆酶切位点#
O.;=B?9RU
ER
D^HEH!.I960A0:F24
DN>?测量乳酸产量并验证其旋光性
将重组菌-.$&*U0b$3G*-A#/" 的单菌落$接种于
1 H.的.-培养基中$ 4 l过夜培养$以 &h的接种
量转接至.-摇瓶培养基中$4 l培养至[/值达到
%c3 时$加O9bM诱导# 8$分别每隔$ 8取& H.发酵液
离心$吸取 &%%
$
.上清液稀释 &%% 倍通过配置有乳
酸反应酶膜的生物传感分析仪测量数值并对最终的
发酵液进行试样处理$液相色谱仪分析其产物 - 乳
酸的旋光性( 色谱条件%检出波长为 $(1 EH$采用
LJ?AX*).)*.手性分离柱"&( XHo1c# HH$(
$
H#$流
动 相 为 %c%%$ HB>2.的 )=Y[
1
!(N
$
[$ 流 速 为
& H.2HDE$进样量为 $%
$
.(
B?结果与讨论
BND?目的基因的克隆和测序
以鼠李糖乳杆菌 .L %1 %& 的基因组为模板
扩增目的基因$将得到 9)e产物在 %c3h琼脂糖凝
胶进行电泳分析$结果见图 &( 图 & 结果表明%在
&c% W6 大小处有目的条带$与报道的 -A#/" 基因的
大小一致( 将9)e产物纯化回收后$连接 UT/&3b*
JDHU>A载体"见图 $ 载体特点%消除了多克隆酶切位
点#$转化克隆载体$筛选得到b*-A#/"$经测序分析$
与MAE-GEW 所报道的 -A#/" 基因序列完全一致$而
且基因序列表达的 $# 个氨基酸序列也完全一致$
表明扩增得到正确的 - 乳酸脱氢酶基因(
T为/.$%%% /,LTG@WA@& .& k.# 为 -A#/"的9)e产物
图 D?5 乳酸脱氢酶基因"5=#1"#X,_产物凝胶电泳分析
O.;=D?*/56L1.127X,_JL 5;54210;06060:F429-2401.1
BNB?构建并鉴定重组质粒
扩增出的 -A#/"基因产物纯化回收后用<8N
"
和="$
"
双酶切$与经<8N
"
和="$
"
双酶切后的表达
载体 U0b*$3G"j#连接( 将纯化后的连接产物转化到
$"第 # 期 李"倩等%- 乳酸脱氢酶在大肠杆菌-.*$&"/0#中的表达
大肠杆菌bBU&%感受态细胞中( 培养转化后的菌株$
提取质粒 U0b$3G*-A#/"$经 <8N
"
)="$
"
酶切鉴定$
结果见图 ( 由图 可知%-A#/"基因已经连接到表达
载体 U0b*$3G"j# 上( 将构建好的重组质粒为
U0b$3G*-A#/""图 1#的阳性克隆$送奥科生物技术有
限公司测序$序列完全正确(
T为 & 6^ U>=J/,LTG@WA@&
.& k.$ 为 U0b$3"G#*-A#/" IB=6>AIDFAJ?DBE \D?8 <8N
"
GEI ="$
"
图 Q?双酶切后的质粒9#EB^5H5=#1"
O.;=Q?_0:2IJ./5/F9651I.G19#EB^5H5=#1"G23J60
G.;01F.2/M.F->:"
"
5/G?"$
"
BNQ?9#EB^5H5=#1"重组质粒的进一步转化和表达
将重组的表达质粒 U0b$3G*-A#/"$进一步转化
到表达菌株大肠杆菌 -.*$& "/0#的感受态细胞
中$获得重组菌株$在 .-试管培养基中过夜培养$
再转接到摇瓶培养基$4 l培养$[/达到 %c3 时$
加入O9bM进行诱导$诱导 # 8$收集菌体$处理后进
行 Y/Y*9LM0鉴定$结果见图 (( 由图 ( 可见%在重
组菌株中检测到相对分子质量约 1c& o&%1的目的
蛋白条带$与预测相对分子质量大小一致$结果表
明鼠李糖乳杆菌的 -A#/" 基因在大肠杆菌 -.*$&
"/0#中表达(
BNV?乳酸脱氢酶活性的测定
将原始-.*$&"/0#大肠杆菌作为空白对照$
测量重组菌中的 - 乳酸脱氢酶酶活$计算出改造后
菌株的每毫升提取液中 - 乳酸脱氢比酶活力提取
液为 !c11 R2H.$而空白对照菌液中- 乳酸脱氢酶
的酶活为 %( 因为原始大肠杆菌基因组中没有 -
乳酸脱氢酶基因$所以酶活为 %&重组菌中的 - 乳
酸脱氢酶基因得到了表达$因此能测到酶活力(
图 V?构建好的质粒9#EB^5H5=#1"的示意
O.;=V?U.5;45I279#EB^5H5=#1"
T为9@B?ADE TG@WA@&
& k1 为重组菌株230$#+-.$&*U0b$3G*-A#/"&
( k# 为 -.$&*U0b$3G&4 k3 为-.$& 对照
图 W?表达产物的!U!HX*%#电泳
O.;=W?!U!HX*%#5/56L1.1270Z94011.2/942G3:F1
BNW?5 乳酸的测定
重组大肠杆菌-.$&*U0b$3G*-A#/"在 $(% H.摇
瓶 4 l的条件下发酵培养$将发酵液离心得到上清
液$用生物传感器测上清液的乳酸值$重组菌产
- 乳酸为 F2.$而对照组的 - 乳酸为 %( 重组菌
株与原始对照菌株的生长曲线见图 #( 由图 # 可
知%$ 株菌的生长曲线生长趋势基本一致$在 4 8 左
右进入生长稳定期( 重组菌株在产乳酸的同时生
长效率不变$分析其原因%一方面$可能由于乳酸产
量不高$对菌株的生长并无明显抑制&另一方面$大
肠杆菌的生长周期短$而且营养要求粗放$乳酸的
生成对其生长无影响( 虽然$目前利用大肠杆菌生
产 - 乳酸的产量较低$可能是由于 !(h的丙酮酸
生成有机酸混合物 "甲酸)乙酸)丁二酸# 和乙
醇*&%+ $而由丙酮酸生成 - 乳酸并非主流代谢途径(
因此$将以构建出的这株能生产 - 乳酸的大肠杆菌
为研究对象$利用e0/系统敲除旁路代谢途径的关
键酶基因$使丙酮酸转化为 - 乳酸的代谢流成为主
导途径(
1$ 生"物"加"工"过"程"" 第 ! 卷"
图 @?重组菌株和对照菌株的生长曲线
O.;=@?%42MF-:34A0278[BDH9#EB^5H5=#1"1F45./
5/G:2/F451F
同时将重组菌株与对照菌株的发酵液经过液
相色谱仪分析$结果见图 4( 图 4G为 D$- 乳酸标
准品$D 乳酸在 1c% HDE 出峰$- 乳酸在 3c% HDE
出峰&图 46为重组菌株发酵液在 - 乳酸出峰处有
明显峰值( 由图 4 可知%重组菌株发酵液有明显的
- 乳酸峰值$而空白对照菌株无 - 乳酸峰值(
G为D$- 乳酸标准品&6为重组菌发酵液
图 \?乳酸标准品的液相色谱分析
O.;=\?"X[,2765:F.:5:.G
Q?结论
以鼠李糖乳杆菌"-3%"85$,),#基因组为模板$
设计引物扩增出 - 乳酸脱氢酶基因-A#/"$将其基
因连接到表达载体 U0b*$3G"j#上$转化到大肠杆菌
bBU&%$通过抗性平板筛选$提取阳性质粒并测序$结
果正确( 将重组质粒 U0b$3G*-A#/"$转化到大肠杆
""""
菌-.*$&"/0#$通过抗性平板筛选$得到了重组
菌$通过O9bM诱导表达$通过蛋白电泳$检测到目
的蛋白条带$同时测到 !c11 R2H.的比酶活( 通过
摇瓶发酵可生产 - 乳酸$产量达到 F2.( 成功构
建出了大肠杆菌利用葡萄糖生产 - 乳酸的一条新
的代谢途径$这为优化大肠杆菌利用葡萄糖高产 -
乳酸以及共同利用葡萄糖和木糖生产 - 乳酸奠定
基础(
参考文献%
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($"第 # 期 李"倩等%- 乳酸脱氢酶在大肠杆菌-.*$&"/0#中的表达