全 文 ：!"#$%&#’(法测定发酵液中 !%精氨酸含量
姜 岷!，王倩楠，苏 溧，孙娜亚，陈可泉
（南京工业大学 制药与生命科学学院，南京 )*+++,）
摘 要：建立了一种快速、准确的高效液相色谱%蒸发光散射检测法（!"#$%&#’(）测定发酵液中 !%精氨酸含量。采
用 "-./012 $*3 色谱柱（$*3 4!5，)4+ 6"7 89 55，:22;.<=），以 4 55>2·#
? *七氟丁酸（三氟乙酸调 @!至 * 8+）和乙腈为流
动相，采用梯度洗脱，总流速为 * 8+ 5# A 51B。&#’(参数：漂移管温度为 **C 8+ D，载气流速为 E 8) # A 51B。 !%精氨酸
等氨基酸的回收率为 ,9F G *+7F。能够快速、精确测定发酵样品中目的产物 !%精氨酸与其它氨基酸含量。
关键词：!"#$%&#’(；发酵液；!%精氨酸
中图分类号：H94C 8C 文献标识码：: 文章编号：*9C) ? E9C3（)++9）+7 ? ++9* ? +7
!"#"$%&’(#&)’ )* !+($,&’&’" &’ *"$%"’#(#&)’ -$)#. -/ 0123+425!
IJ:KL M1B，N:KL O10B%B0B，’P #1，’PK K0%Q0，$!&K R.%ST0B
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9"/ :)$;7：!"#$%&#’(；V.-5.B;0;1>B \->;=；!%0-U1B1B.
!%精氨酸（!%:-U1B1B.）是一种含有胍基的人体半
必需的碱性氨基酸［*%E］，主要用于氨基酸输液及病毒
性肝炎的治疗。用于发酵产 !%精氨酸的菌种主要有
枯草芽孢杆菌、大肠杆菌，其中大肠杆菌产 !%精氨酸
的代谢途径如图 *所示。
!%精氨酸的检测方法主要有阪口试剂法、层析
法、氨 基 酸 分 析 仪 测 定 法 和 高 效 液 相 色 谱 法
（!"#$）［7%9］。阪口试剂法误差较大，!"#$ 和氨基酸
分析仪测定法是目前氨基酸分析方法中最为有效的
手段［C%3］。但 !%精氨酸是一种不含紫外吸收的物质，
在用 !"#$进行分析时不能利用紫外检测法进行检
测。蒸发光散射检测器（&/0@>-0;1/. #1U=;%’<0;;.-1BU
(.;.<;>- ，&#’(）是一种质量型检测器，可以检测任何
挥发性低于流动相的化合物，是紫外检测器的有效补
充，适合于无紫外吸收的有效成分的分析［,%**］。采用
成本低廉的 $*3色谱柱，使用 &#’( 检测器检测发酵
液中各种氨基酸的含量，从而对大肠杆菌发酵产 !%
精氨酸代谢途径的研究打下了基础。
< 试验部分
* 8* 仪器与试剂
* 8* 8* 仪 器
! 收稿日期：)++9%+4%)+
基金项目：国家自然科学基金重点项目（)+EE9+*+）；江苏省高校自然科学研究计划一般项目（+4RI^*3++7E）
作者简介：姜 岷（*,C)%），男，江苏南京人，博士，副研究员，研究方向：生物化工，&%502：X10BU51B_ BXT; ] .WT ]
)++9 年 ** 月
生 物 加 工 过 程
$=1B.Y. I>T-B02 >V ^1>@-><.YY &BU1B..-1BU
K>/ ] )++9
·9*·
万方数据
高效液相色谱仪（!"# $%&’ ()*( +,,-./0；1&23
"444 3.-./-56，+,,-./0；%6.789, ’:;，+,,-./0；<8-.6= $%&’
"4:4工作站）；>2?$2 冷冻离心机（@1’AB+C）；%$2?
D’，精密 ($计（上海雷磁仪器厂）。
86E+：乙酰谷氨酸合成酶
图 : 重组大肠杆菌代谢途径
F9E G: H0. *.-8I5,9/ (8-0J8K 5L 6./5*I9M8M- ! G "#$%
: G: G" 试 剂
乙腈，色谱纯（上海陆都）；&?精氨酸，分析纯（国
药集团化学试剂有限公司）、&?谷氨酸，分析纯（中国
惠兴生化试剂有限公司）、&?苏氨酸，分析纯（国药集
团化学试剂有限公司）、&?天冬氨酸，分析纯（国药集
团化学试剂有限公司）、&?蛋氨酸，分析纯（上海丽珠
东风生物技术有限公司）、&?鸟氨酸，分析纯（国药集
团化学试剂有限公司）；七氟丁酸，分析纯（F&NA+），
三氟乙酸，（国药集团化学试剂有限公司）。
: G" 色谱条件
色谱柱：无机色谱柱 %6.789, ’:;（O!*，"O4 **
P ! G# **，+,,-./0）；流动相：+：O **5,·& Q :七氟丁酸
（三氟乙酸调 ($至 : G4），@：乙腈，采用梯度洗脱（ ’ R
*9M，@S），（4，4），（#，4），（;，:O），（"O，DO），总流速为
: G4 *&·*9M Q :。1&23参数：漂移管温度 ::T G4 U；载
气（氮气）流速为 D G" &·*9M Q :。
: GD 各种氨基酸混合标准液的分离
精确称取一定量的 &?精氨酸、&?鸟氨酸、&?谷
氨酸、&?天冬氨酸、&?蛋氨酸、&?苏氨酸，用超纯水配
制成氨基酸标准混合液，其质量浓度均为 : G4 E·
& Q :。
: G! 氨基酸标准曲线的绘制
用超纯水分别精确配制不同浓度的标准 &?精
氨酸溶液、标准 &?天冬氨酸溶液、标准 &?谷氨酸溶
液、标准 &?蛋氨酸溶液、标准 &?苏氨酸溶液、标准
&?鸟氨酸溶液，经 4 G""!*微孔滤膜过滤后，进样 "4
!&，检测得到各种氨基酸的色谱图，测定峰面积，以
峰面积（ (）为纵坐标，样品质量浓度（ )）为横坐标，
分别绘制标准曲线，得到各种氨基酸的线性参数。
: GO 发酵液样品的预处理
分别取不同发酵时间的发酵液，冷冻离心机离心
条件：:" 444 6·*9M Q :、D4 *9M。离心后取上清液经 4G""
!*微孔滤膜过滤，滤液稀释为不同的浓度进样。
: G# 发酵液中氨基酸的定性定量分析
在相同色谱条件下，将发酵液试样色谱图与各
种氨基酸标准溶液色谱图对照，依据保留时间确定
发酵液试样中所含各种氨基酸出峰位置。
! 结果与讨论
" G: 氨基酸标准曲线的绘制
按照 : G! 标准曲线绘制方法，绘制出 &?天冬氨
酸、&?苏氨酸、&?鸟氨酸、&?谷氨酸、&?精氨酸、&?蛋
氨酸出峰色谱图，得到 &?天冬氨酸、&?苏氨酸、&?鸟
氨酸、&?谷氨酸、&?精氨酸、&?蛋氨酸的保留时间分
别为 ! G";4，! GTD"，! G;TD，O GD4!，:D G4V;，:# G;": *9M，
各种氨基酸的标准曲线线性参数见表 :。
表 : 标准曲线的线性参数
H8I,. : H0. ,9M.86 .W)8-95M= 5L =-8MX86X /)67.=
氨基酸 回归方程 相关系数
线性范围 R
E·& Q :
检出限 R
E
&?精氨酸 ( Y O GD4V!#) Q O"; ;O" G# 4 GVVT 4V : Z O : GOOT TT. Q T
&?谷氨酸 ( Y D GTV# O!#) Q DT! !:O G! 4 GVVT :! : Z O D G::O OO. Q ;
&?鸟氨酸 ( Y ! GV"# T!#) Q :!! V!; G" 4 GVV# O; : Z O " G#OV ";. Q ;
&?天冬氨酸 ( Y ! G4TO; "!#) Q D:V #:! GO 4 GVV; VT : Z O " GD:; O#. Q T
&?蛋氨酸 ( Y O G"T: #;!#) Q :OO DO# G4 4 GVVV VV : Z O : GOT# :D. Q V
&?苏氨酸 ( Y ! G!;D VO!#) Q "V; "T# GT 4 GVVV O: : Z O D GT!V :D. Q ;
·#"· 生物加工过程 第 ! 卷第 ! 期
万方数据
! "! 各种氨基酸混合标准溶液的色谱分离图
按照 # "$ 所示对各种氨基酸混合标准液进行分
离，色谱图如图 ! 所示。
! "% 精密度试验
取同一发酵液试样经过处理后，在相同色谱条
件下，重复测定 $ 次，结果如表 ! 所示。
! "& !’精氨酸回收率试验
同一发酵液样品分为两份，其中一份加入不同
量的各种氨基酸标量进行测定。结果如表 % 所示。
! "$ 重复性试验
取 % 个不同 !’精氨酸浓度的发酵液，分别取样
% 次，重复测定 % 次。结果见表 &。
其他 $ 种氨基酸测定的重复性实验采取同样方
法测定，其相对标准偏差范围为 # "($) * ! "%&)，符
合试验要求。
#：!’天冬氨酸（ !’+,-）；!：!’苏氨酸（ !’./0）；%：!’鸟氨酸（ !’102）；
&：!’谷氨酸（ !’345）；$：!’精氨酸（ !’+06）；7：!’蛋氨酸（ !’89:）
图 ! 氨基酸混合标准液的色谱分离图
;<6 "! =/0>?@:>60@? >A ,:@2B@0B @?<2> @C表 ! 精密度实验结果
.@D49 ! E9,54:, >A -09C<,<>2
分析次数 !
（ !’精氨酸）F
6·G H #
!（ !’谷氨酸）F
6·G H #
!（ !’鸟氨酸）F
6·G H #
!（ !’天冬氨酸）F
6·G H #
!（ !’蛋氨酸）F
6·G H #
!（ !’苏氨酸）F
6·G H #
# & "#II I ! "I%$ I ( "I#J 7 7 "I!! $ ( "K$# $7I # "K$$ &
! & "%7& 7 ! "I$# 7 ( "I#J I K "%&& $ ( "K$J K$I # "K$$ 7
% & "#%& K ! "I#$ 7 ( "I!! ( K "(#& K ( "K$$ J(! # "K$I #
& & "#I7 & ! "I7( ( ( "I## 7 K "#!! # ( "K$! &$$ # "K&7 7
$ & "!#( I ! "I%! J ( "I(( I 7 "J$& J ( "K$K K!I # "K%& K
相对标准偏差 F ) ! "(7 # "K% ( "II # "J7 ( "%$ ( "J7
表 % 回收率实验结果
.@D49 % E9,54:, >A 09C>L90M
样品组分 样品质量浓度 F 6·G H # 加标量 F 6·G H # 加标实测值 F 6·G H # 回收率 F ) 相对标准偏差 F )
# "((( ( ! "#K$ & JJ "$! ( "IK
!’精氨酸 # "#I$ J ! "((( ( % "#IJ K #(( "#! # "#I
% "((( ( & "#7I K JJ "$J # "$J
# "((( ( ! "(7I J #(# "!$ ! "%$
!’谷氨酸 # "(&% & ! "((( ( % "(!& $ JJ "%I # "7#
% "((( ( % "J$( # JK "7J % "!7
# "((( ( # "!$I & JI "$! # "K%
!’鸟氨酸 ( "!KK % ! "((( ( ! "!JJ # #(( "J7 # "($
% "((( ( % "#$I % J7 "%K ! "IK
# "((( ( # "$&I ! #(! "%& ! "K%
!’天冬氨酸 ( "$#! I ! "((( ( ! "$7& ( #(! "(& # "JK
% "((( ( % "&K& 7 JI "J# # "KK
# "((( ( # "&&7 7 #(# "%J ( "J7
!’蛋氨酸 ( "&!7 I ! "((( ( ! "%KK ! JK "J7 ! "#!
% "((( ( % "&#% 7 JJ "7# # "$#
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!’苏氨酸 ( "&II I ! "((( ( ! "$## % #(( "J( # "!J
% "((( ( % "%K& I J7 "K% ! "I%
!((7 年 ## 月 姜 岷等：NOG=’PGQR法测定发酵液中 !’精氨酸含量 ·7%·
万方数据
表 ! 重复性试验结果
"#$%& ! ’&()%*( +, -&.&#*#$/%/*0
样品 !
（ !1精氨酸平均值）2
3·4 5 6
相对标准偏差 2
7
6 6 896: ; 6 8<=
9 9 8<;: > 9 8?=
; ! 8>=! = 9 8>:
9 8= 稳定性试验
取同一批次发酵液 = 份，按照 6 8; 项的方法制
备成待测试样，每间隔 ! @ 测定一次，计算出 !1精氨
酸的平均含量为 ! 8>= 3·4 5 6，相对标准偏差为
6 8=;7；其他 > 种氨基酸的相对标准偏差范围为
? 8>;7 A ; 89=7，达到试验的要求。
9 8: 发酵样品分析
由 6 8; 分析方法，取发酵液在上述分离条件下
进行色谱分离得到色谱图，结果如图 ;。
6：!1天冬氨酸；9：!1苏氨酸；;：!1鸟氨酸；
!：!1谷氨酸；>：!1精氨酸；=：!1蛋氨酸
图 ; 发酵液色谱图
B/3 8; C@-+D#*+3-#D +, ,&-D&E*#*/+E $-+*@
! 结 论
采用成本低廉的 C6F 色谱柱，结合 G4HI 检测
器，以 > DD+%·4 5 6七氟丁酸（三氟乙酸调 .J至 6 8?）
与乙腈为流动相，采用梯度洗脱，可以定性定量地检
测出发酵液中所含各种氨基酸。该方法测定发酵液
中 !1精氨酸等氨基酸的回收率为 <=7 A 6?!7。实
验证明该检测方法能够快速、精确的测定发酵样品
中主产物 !1精氨酸与其它氨基酸的含量，对于指导
生物法代谢调控生产 !1精氨酸具有重要意义。
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［66］J&/U&%$&-3 K W E&Q /D/U#X+%/E+E& -&()%*/E3 ,-+D *@& -&#T*/+E +, .&.*/U&1
$+)EU #-3/E/E& #EU +%/3+(#TTT@#-/U&( Q/*@ 6，!13%0T+(/U/T %/EY#3&(［M］K
G)-+.&#E B++U ’&(&#-T@ #EU "&T@E+%+30，9??!（9）：96;196F 8
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万方数据