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Determination of L-arginine in fermentation broth by HPLC-ELSD

HPLC-ELSD法测定发酵液中L-精氨酸含量



全 文 :!"#%&#’()测定发酵液中 !%精氨酸含量。采
用 "-./012 3*3 4!5,)4+ 6"7 89 55,:22;.<=),以 4 55>2·#
? *七氟丁酸(三氟乙酸调 @!至 * 8+)和乙腈为流
动相,采用梯度洗脱,总流速为 * 8+ 5# A 51B。&#’(参数:漂移管温度为 **C 8+ D,载气流速为 E 8) # A 51B。 !%精氨酸
等氨基酸的回收率为 ,9F G *+7F。能够快速、精确测定发酵样品中目的产物 !%精氨酸与其它氨基酸含量。
关键词:!"#%&’(#&)’ )* !+(,&’&’" &’ *"%"’#(#&)’ -)#. -/ 0123+425! IJ:KL M1B,N:KL O10B%B0B,’P #1,’PK K0%Q0,!&K R.%ST0B
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/012 3<>2T5B*3 4!5,)4+ 55 6"7 89 55,:22;.<=)[0Y TY.W 0BW =.@;0V2T>->\T;Q-1< 0<1W(@! * 8+ 0W%
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9"/ :);7:!"#%&#’(;V.-5.B;0;1>B \->;=;!%0-U1B1B.
!%精氨酸(!%:-U1B1B.)是一种含有胍基的人体半
必需的碱性氨基酸[*%E],主要用于氨基酸输液及病毒
性肝炎的治疗。用于发酵产 !%精氨酸的菌种主要有
枯草芽孢杆菌、大肠杆菌,其中大肠杆菌产 !%精氨酸
的代谢途径如图 *所示。
!%精氨酸的检测方法主要有阪口试剂法、层析
法、氨 基 酸 分 析 仪 测 定 法 和 高 效 液 相 色 谱 法
(!"#)[7%9]。阪口试剂法误差较大,!"# 和氨基酸
分析仪测定法是目前氨基酸分析方法中最为有效的
手段[C%3]。但 !%精氨酸是一种不含紫外吸收的物质,
在用 !"#进行分析时不能利用紫外检测法进行检 测。蒸发光散射检测器(&/0@>-0;1/. #1U=;%’<0;;.-1BU (.;.<;>- ,&#’()是一种质量型检测器,可以检测任何 挥发性低于流动相的化合物,是紫外检测器的有效补 充,适合于无紫外吸收的有效成分的分析[,%**]。采用 成本低廉的 *3色谱柱,使用 &#’( 检测器检测发酵
液中各种氨基酸的含量,从而对大肠杆菌发酵产 !%
精氨酸代谢途径的研究打下了基础。
< 试验部分
* 8* 仪器与试剂
* 8* 8* 仪 器
! 收稿日期:)++9%+4%)+
基金项目:国家自然科学基金重点项目()+EE9+*+);江苏省高校自然科学研究计划一般项目(+4RI^*3++7E)
作者简介:姜 岷(*,C)%),男,江苏南京人,博士,副研究员,研究方向:生物化工,&%502:X10BU51B_ BXT; ] .WT ] 第 7 卷第 7 期
)++9 年 ** 月
生 物 加 工 过 程
=1B.Y. I>T-B02 >V ^1>@-><.YY &BU1B..-1BU K>/ ] )++9 ·9*· 万方数据 高效液相色谱仪(!"# %&’ ()*( +,,-./0;1&23
"444 3.-./-56,+,,-./0;%6.789, ’:;,+,,-./0;<8-.6= %&’ "4:4工作站);>2?2 冷冻离心机(@1’AB+C);%2? D’,精密 (计(上海雷磁仪器厂)。
86E+:乙酰谷氨酸合成酶
图 : 重组大肠杆菌代谢途径
F9E G: H0. *.-8I5,9/ (8-0J8K 5L 6./5*I9M8M- ! G "#% : G: G" 试 剂 乙腈,色谱纯(上海陆都);&?精氨酸,分析纯(国 药集团化学试剂有限公司)、&?谷氨酸,分析纯(中国 惠兴生化试剂有限公司)、&?苏氨酸,分析纯(国药集 团化学试剂有限公司)、&?天冬氨酸,分析纯(国药集 团化学试剂有限公司)、&?蛋氨酸,分析纯(上海丽珠 东风生物技术有限公司)、&?鸟氨酸,分析纯(国药集 团化学试剂有限公司);七氟丁酸,分析纯(F&NA+), 三氟乙酸,(国药集团化学试剂有限公司)。 : G" 色谱条件 色谱柱:无机色谱柱 %6.789, ’:;(O!*,"O4 ** P ! G# **,+,,-./0);流动相:+:O **5,·& Q :七氟丁酸 (三氟乙酸调 (至 : G4),@:乙腈,采用梯度洗脱( ’ R
*9M,@S),(4,4),(#,4),(;,:O),("O,DO),总流速为
: G4 *&·*9M Q :。1&23参数:漂移管温度 ::T G4 U;载
气(氮气)流速为 D G" &·*9M Q :。
: GD 各种氨基酸混合标准液的分离
精确称取一定量的 &?精氨酸、&?鸟氨酸、&?谷
氨酸、&?天冬氨酸、&?蛋氨酸、&?苏氨酸,用超纯水配
制成氨基酸标准混合液,其质量浓度均为 : G4 E·
& Q :。
: G! 氨基酸标准曲线的绘制
用超纯水分别精确配制不同浓度的标准 &?精
氨酸溶液、标准 &?天冬氨酸溶液、标准 &?谷氨酸溶
液、标准 &?蛋氨酸溶液、标准 &?苏氨酸溶液、标准
&?鸟氨酸溶液,经 4 G""!*微孔滤膜过滤后,进样 "4
!&,检测得到各种氨基酸的色谱图,测定峰面积,以
峰面积( ()为纵坐标,样品质量浓度( ))为横坐标,
分别绘制标准曲线,得到各种氨基酸的线性参数。
: GO 发酵液样品的预处理
分别取不同发酵时间的发酵液,冷冻离心机离心
条件::" 444 6·*9M Q :、D4 *9M。离心后取上清液经 4G""
!*微孔滤膜过滤,滤液稀释为不同的浓度进样。
: G# 发酵液中氨基酸的定性定量分析
在相同色谱条件下,将发酵液试样色谱图与各
种氨基酸标准溶液色谱图对照,依据保留时间确定
发酵液试样中所含各种氨基酸出峰位置。
! 结果与讨论
" G: 氨基酸标准曲线的绘制
按照 : G! 标准曲线绘制方法,绘制出 &?天冬氨
酸、&?苏氨酸、&?鸟氨酸、&?谷氨酸、&?精氨酸、&?蛋
氨酸出峰色谱图,得到 &?天冬氨酸、&?苏氨酸、&?鸟
氨酸、&?谷氨酸、&?精氨酸、&?蛋氨酸的保留时间分
别为 ! G";4,! GTD",! G;TD,O GD4!,:D G4V;,:# G;": *9M,
各种氨基酸的标准曲线线性参数见表 :。
表 : 标准曲线的线性参数
H8I,. : H0. ,9M.86 .W)8-95M= 5L =-8MX86X /)67.=
氨基酸 回归方程 相关系数
线性范围 R
E·& Q :
检出限 R
E
&?精氨酸 ( Y O GD4V!#) Q O"; ;O" G# 4 GVVT 4V : Z O : GOOT TT. Q T
&?谷氨酸 ( Y D GTV# O!#) Q DT! !:O G! 4 GVVT :! : Z O D G::O OO. Q ;
&?鸟氨酸 ( Y ! GV"# T!#) Q :!! V!; G" 4 GVV# O; : Z O " G#OV ";. Q ;
&?天冬氨酸 ( Y ! G4TO; "!#) Q D:V #:! GO 4 GVV; VT : Z O " GD:; O#. Q T
&?蛋氨酸 ( Y O G"T: #;!#) Q :OO DO# G4 4 GVVV VV : Z O : GOT# :D. Q V
&?苏氨酸 ( Y ! G!;D VO!#) Q "V; "T# GT 4 GVVV O: : Z O D GT!V :D. Q ;
·#"· 生物加工过程 第 ! 卷第 ! 期
万方数据
! "! 各种氨基酸混合标准溶液的色谱分离图
按照 # " 所示对各种氨基酸混合标准液进行分 离,色谱图如图 ! 所示。 ! "% 精密度试验 取同一发酵液试样经过处理后,在相同色谱条 件下,重复测定 次,结果如表 ! 所示。
! "& !’精氨酸回收率试验
同一发酵液样品分为两份,其中一份加入不同
量的各种氨基酸标量进行测定。结果如表 % 所示。
! " 重复性试验 取 % 个不同 !’精氨酸浓度的发酵液,分别取样 % 次,重复测定 % 次。结果见表 &。 其他 种氨基酸测定的重复性实验采取同样方
法测定,其相对标准偏差范围为 # "() * ! "%&),符 合试验要求。 #:!’天冬氨酸( !’+,-);!:!’苏氨酸( !’./0);%:!’鸟氨酸( !’102); &:!’谷氨酸( !’345);:!’精氨酸( !’+06);7:!’蛋氨酸( !’89:)
图 ! 氨基酸混合标准液的色谱分离图
;<6 "! =/0>?@:>60@? >A ,:@2B@0B @?<2> @C表 ! 精密度实验结果
.@D49 ! E9,54:, >A -09C<,<>2
分析次数 !
( !’精氨酸)F
6·G H #
!( !’谷氨酸)F
6·G H #
!( !’鸟氨酸)F
6·G H #
!( !’天冬氨酸)F
6·G H #
!( !’蛋氨酸)F
6·G H #
!( !’苏氨酸)F
6·G H #
# & "#II I ! "I% I ( "I#J 7 7 "I!! ( "K# 7I # "K & ! & "%7& 7 ! "I$# 7 ( "I#J I K "%&& $ ( "K$J K$I # "K 7
% & "#%& K ! "I# 7 ( "I!! ( K "(#& K ( "K J(! # "KI #
& & "#I7 & ! "I7( ( ( "I## 7 K "#!! # ( "K! & # "K&7 7 & "!#( I ! "I%! J ( "I(( I 7 "J& J ( "KK K!I # "K%& K
相对标准偏差 F ) ! "(7 # "K% ( "II # "J7 ( "% ( "J7 表 % 回收率实验结果 .@D49 % E9,54:, >A 09C>L90M 样品组分 样品质量浓度 F 6·G H # 加标量 F 6·G H # 加标实测值 F 6·G H # 回收率 F ) 相对标准偏差 F ) # "((( ( ! "#K & JJ "! ( "IK !’精氨酸 # "#I J ! "((( ( % "#IJ K #(( "#! # "#I
% "((( ( & "#7I K JJ "J # "J
# "((( ( ! "(7I J #(# "! ! "%
!’谷氨酸 # "(&% & ! "((( ( % "(!& JJ "%I # "7# % "((( ( % "J( # JK "7J % "!7
# "((( ( # "!I & JI "! # "K%
!’鸟氨酸 ( "!KK % ! "((( ( ! "!JJ # #(( "J7 # "( % "((( ( % "#I % J7 "%K ! "IK
# "((( ( # "&I ! #(! "%& ! "K% !’天冬氨酸 ( "#! I ! "((( ( ! "7& ( #(! "(& # "JK % "((( ( % "&K& 7 JI "J# # "KK # "((( ( # "&&7 7 #(# "%J ( "J7 !’蛋氨酸 ( "&!7 I ! "((( ( ! "%KK ! JK "J7 ! "#! % "((( ( % "&#% 7 JJ "7# # "#
# "((( ( # "&J K #(( "&7 ( "%
!’苏氨酸 ( "&II I ! "((( ( ! "## % #(( "J( # "!J % "((( ( % "%K& I J7 "K% ! "I% !((7 年 ## 月 姜 岷等:NOG=’PGQR法测定发酵液中 !’精氨酸含量 ·7%· 万方数据 表 ! 重复性试验结果 "#%& ! ’&()%*( +, -&.&#*#/%/*0 样品 ! ( !1精氨酸平均值)2 3·4 5 6 相对标准偏差 2 7 6 6 896: ; 6 8<= 9 9 8<;: > 9 8?= ; ! 8>=! = 9 8>: 9 8= 稳定性试验 取同一批次发酵液 = 份,按照 6 8; 项的方法制 备成待测试样,每间隔 ! @ 测定一次,计算出 !1精氨 酸的平均含量为 ! 8>= 3·4 5 6,相对标准偏差为 6 8=;7;其他 > 种氨基酸的相对标准偏差范围为 ? 8>;7 A ; 89=7,达到试验的要求。 9 8: 发酵样品分析 由 6 8; 分析方法,取发酵液在上述分离条件下 进行色谱分离得到色谱图,结果如图 ;。 6:!1天冬氨酸;9:!1苏氨酸;;:!1鸟氨酸; !:!1谷氨酸;>:!1精氨酸;=:!1蛋氨酸 图 ; 发酵液色谱图 B/3 8; C@-+D#*+3-#D +, ,&-D&E*#*/+E -+*@
! 结 论
采用成本低廉的 C6F 色谱柱,结合 G4HI 检测
器,以 > DD+%·4 5 6七氟丁酸(三氟乙酸调 .J至 6 8?)
与乙腈为流动相,采用梯度洗脱,可以定性定量地检
测出发酵液中所含各种氨基酸。该方法测定发酵液
中 !1精氨酸等氨基酸的回收率为 <=7 A 6?!7。实
验证明该检测方法能够快速、精确的测定发酵样品
中主产物 !1精氨酸与其它氨基酸的含量,对于指导
生物法代谢调控生产 !1精氨酸具有重要意义。
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G)-+.&#E B++U ’&(&#-T@ #EU "&T@E+%+30,9??!(9):96;196F 8
·=!· 生物加工过程 第 ! 卷第 ! 期
万方数据

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