全 文 ：第 １３卷第 ６期
２０１５年 １１月
生　 物　 加　 工　 过　 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ􀆰 １３ Ｎｏ􀆰 ６
Ｎｏｖ􀆰 ２０１５
ｄｏｉ：１０􀆰 ３９６９ ／ ｊ􀆰 ｉｓｓｎ􀆰 １６７２－３６７８􀆰 ２０１５􀆰 ０６􀆰 ００６
收稿日期：２０１４－０４－０４
基金项目：高等学校博士学科点专项基金（２０１２３２２１１３０００１）；国家自然科学基金（２１３７６１１９）
作者简介：王　 欣（１９８８—），女，辽宁营口人，硕士研究生，研究方向：生物化工；何冰芳（联系人），教授，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｂｉｎｇｆａｎｇｈｅ＠ ｎｊｔｅｃｈ．ｅｄｕ．ｃｎ
β 半乳糖苷酶的筛选、克隆表达、酶学性质及其
酶法合成低聚半乳糖
王　 欣，吴　 斌，何冰芳
（南京工业大学 生物与制药工程学院，江苏 南京 ２１１８００）
摘　 要：采用人工底物邻硝基苯酚 β Ｄ 半乳糖苷（ｏＮＰＧ）为筛选标记，从耐有机溶剂微生物菌库中，筛选出具有
较高水解活性的 β 半乳糖苷酶产生菌，再以乳糖为底物考察菌株低聚半乳糖的合成性能，筛选得到 １ 株产 β 半
乳糖苷酶的 Ｅｒｗｉｎｉａ ｂｉｌｌｉｎｇｉａｅ ＷＸ１。 根据 ＧｅｎＢａｎｋ中相同属种的基因组序列推测 β 半乳糖苷酶基因，克隆得到
β 半乳糖苷酶基因 ｇａｌ，并在大肠杆菌中实现了来源于 Ｅｒｗｉｎｉａ ｂｉｌｌｉｎｇｉａｅ菌 β 半乳糖苷酶的克隆表达。 该基因的
开放阅读框（ＯＲＦ）为 １ ４２８ ｂｐ，编码 ４７５个氨基酸，理论相对分子质量为 ５􀆰 ２×１０４。 镍柱法分离纯化得到电泳纯的
β 半乳糖苷酶 ＧＡＬ，其酶学性质研究表明最适催化温度 ５５ ℃，最适 ｐＨ ７􀆰 ０；Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋对该酶起较强促进作用，
ＥＤＴＡ对该酶抑制作用较强。 利用 β 半乳糖苷酶 ＧＡＬ的转糖基作用，以乳糖为底物合成低聚半乳糖，初步优化的
反应条件：底物乳糖质量浓度 ４００ ｇ ／ Ｌ，每克乳糖添加酶量 １􀆰 ０ Ｕ，在 ４０ ℃反应 １６ ｈ 后，低聚半乳糖合成率达到
３４％（质量分数），显示了较好的开发前景。
关键词：Ｅｒｗｉｎｉａ ｂｉｌｌｉｎｇｉａｅ；β 半乳糖苷酶；克隆表达；酶法合成；低聚半乳糖
中图分类号：Ｑ９３　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２－３６７８（２０１５）０６－００３０－０６
Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，ｃｌｏｎｉｎｇ，ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ β⁃ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ ａｎｄ
ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｇａｌａｃｔｏ⁃ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ
ＷＡＮＧ Ｘｉｎ，ＷＵ Ｂｉｎ，ＨＥ Ｂｉｎｇｆａｎｇ
（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｎａｎｊｉｎｇ Ｔｅｃｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ ２１１８００，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｓｔｒａｉｎｓ ｗｅｒｅ ｓｃｒｅｅｎｅｄ ｆｒｏｍ ｏｒｇａｎｉｃ ｓｏｌｖｅｎｔ ｔｏｌｅｒａｎｔ ｂａｃｔｅｒｉａ， ｔｈｏｕｇｈ ｔｈｅ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｏｆ ｏ⁃
ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ⁃β⁃Ｄ⁃ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ （ｏＮＰＧ）．Ａｆｔｅｒ ｒｅｓｃｒｅｅｎｅｄ ｂｙ ｌａｃｔｏｓｅ ａｓ ｕｓｉｎｇ ｌａｃｔｏｓｅ ａｓ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ，ｓｔｒａｉｎ
Ｅｒｗｉｎｉａ ｂｉｌｌｉｎｇｉａｅ ＷＸ１ ｓｈｏｗｅｄ ｈｉｇｈ ｔｒａｎｓｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｔｉｏｎ． Ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ β⁃
ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ ｆｒｏｍ Ｅｒｗｉｎｉａ ｂｉｌｌｉｎｇｉａｅ，ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｔｈｅ β⁃ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ ＧＡＬ ｗａｓ ｃｌｏｎｅｄ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ
ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ． Ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｏｆ １ ４２８ ｂｐ，ａｎｄ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｎｃｏｄｅｓ ４７５ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ａｎｄ
ｉｔｓ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｓｓ ｉｓ ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ ５􀆰 ２×１０４ ． Ａｆｔｅｒ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｔｈｅ ｐｕｒｉｔｙ ｏｆ ｔｈｉｓ ｅｎｚｙｍｅ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ
ｏｐｔｉｍａｌ ｐＨ ａｎｄ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｗｅｒｅ ７􀆰 ０ ａｎｄ ５５ ℃，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｉｔｓ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗａｓ ｎｏｔａｂｌｙ ｐｒｏｍｏｔｅｄ ｂｙ Ｍｇ２＋，
Ｍｎ２＋，ｗｈｅｒｅａｓ ＥＤＴＡ ｈａｄ ｈｉｇｈ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ． Ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｇａｌａｃｔｏ⁃ｏｌｉｇｏｓａｃｈｏｒｉｄｅｓ
ｗａｓ ｓｔｕｄｉｅｄ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｉｔｓ ｔｒａｎｓｇａｌａｃｔｏｓｙｌａｔｉｏｎ． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ｇａｌａｃｔｏ⁃ｏｌｉｇｏｓａｃｈｏｒｉｄｅｓ ｗａｓ
ａｓ ｆｏｌｌｏｗｓ：４００ ｇ ／ Ｌ ｌａｃｔｏｓｅ，１􀆰 ０ Ｕ β⁃ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ ＧＡＬ，ｒｅａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ４０ ℃ ｆｏｒ １６ ｈ，ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ
ｃｏｎｄｉｔｏｎｓ，ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｏｆ ｇａｌａｃｔｏ⁃ｏｌｉｇｏｓａｃｈｏｒｉｄｅｓ ｗａｓ ３４％． Ｏｕｒ ｆｉｎｄｉｎｇｓ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅ ｔｈａｔ ｔｈｅ
ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ β⁃ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ ｈａｓ ｇｏｏｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｅｒｗｉｎｉａ ｂｉｌｌｉｎｇｉａｅ； β⁃ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ； ｃｌｏｎｉｎｇ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ； ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ； ｇａｌａｃｔｏ⁃ｏｌｉｇｏｓａｃｈｏｒｉｄｅｓ
　 　 低聚半乳糖（ ｇａｌａｃｔｏ⁃ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ，ＧＯＳ）是在
乳糖分子的半乳糖基一侧连接上 １ ～ ４ 个半乳糖基
生成的低聚糖类，属于葡萄糖和半乳糖组成的杂低
聚糖。 低聚半乳糖作为功能性低聚糖，具有促进肠
道内益生菌增殖、缓解乳糖不耐症等功效［１］。 目
前，市场上销售的乳制品中很多添加低聚半乳糖，
具有广阔的应用前景。 利用酶法合成低聚半乳糖，
是工业生产低聚半乳糖的主要方法［２］。
β 半乳糖苷酶（β⁃ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ，ＥＣ ３􀆰 ２􀆰 １􀆰 ２３），
又称乳糖酶（ＧＡＬ），能够水解乳糖生成半乳糖和葡
萄糖。 有些 β 半乳糖苷酶在水解乳糖分子中 β
１，４半乳糖苷键的同时，具有转糖基作用，通常以水
解产物半乳糖为供体，以底物乳糖为受体，生成低
聚半乳糖［３］。 该酶广泛存在于动物、植物及微生物
中，其中微生物是 β 半乳糖苷酶的主要来源［４］。
然而，国内用 β 半乳糖苷酶催化合成低聚半乳糖的
产率相对较低［５］，因此筛选具有高合成性能的 β
半乳糖苷酶产生菌株具有重要意义。
笔者筛得 １ 株产 β 半乳糖苷酶的 Ｅｒｗｉｎｉａ
ｂｉｌｌｉｎｇｉａｅ ＷＸ１，克隆该酶的基因，并在大肠杆菌中进
行异源表达，以实现来源于 Ｅｒｗｉｎｉａ ｂｉｌｌｉｎｇｉａｅ 菌 β
半乳糖苷酶的克隆表达，在此基础上纯化 β 半乳糖
苷酶，考察该酶的酶学性质，并利用该酶催化合成
低聚半乳糖。
１　 材料与方法
１􀆰 １　 主要试剂和材料
ｐＭＤ １８Ｔ Ｖｅｃｔｏｒ、限制性内切酶 Ｈｉｎｄ ＩＩＩ 和
Ｎｄｅ Ｉ、 Ｔ４ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ， ＴａＫａＲａ 公司； 大肠杆菌
（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｉｌ）ＤＨ５ａ 和 ＢＬ２１（ＤＥ３）、质粒 ｐＥＴ
２８ａ（＋）由笔者所在实验室提供，邻硝基苯酚 β
Ｄ 半乳糖苷 （ ｏＮＰＧ）， Ｓｉｇｍａ 公司；酶标仪 Ｐｏｗｅｒ
Ｗａｖｅ ＸＳ，美国 Ｂｉｏ⁃Ｔｅｃｈ 公司；ｕｌｔｉｍａｔｅ ３０００ 型戴安
高效液相色谱仪（ＨＰＬＣ），美国 Ｔｈｅｒｍｏ公司。
初筛培养基（ｇ ／ Ｌ）：酵母粉 ５、蛋白胨 １０、ＮａＣｌ
１０、琼脂 ２０。 ｐＨ ７􀆰 ０。 灭菌后冷却再加入 ｏＮＰＧ １
ｇ ／ Ｌ。
复筛培养基（发酵培养基 ｇ ／ Ｌ）：可溶性淀粉 １、乳
糖 １０、酵母粉 ２、胰蛋白胨 ６、ＣａＣｌ２ ０􀆰 ５、ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ
１􀆰 ５、ＫＨ２ＰＯ４ ２、脲 ０􀆰 ５、ＴＷ ８０ ０􀆰 ５×１０
－４。 ｐＨ ７􀆰 ５。
１􀆰 ２　 β 半乳糖苷酶产生菌株的筛选和鉴定
以笔者所在课题组自行筛选并保存的超过
１ ６００株耐有机溶剂微生物为筛选菌库，从冻存管接
种于 ＬＢ 固体培养基，于 ３０ ℃培养 ２４ ｈ，将菌株点
样转接到含人工底物 ｏＮＰＧ 的初筛培养基中，３０ ℃
培养 ２４ ｈ后，菌落边出现亮黄色圈的为有 β 半乳
糖苷酶水解活力的菌株。
将具有 β 半乳糖苷酶水解活力的菌株接种到复
筛培养基中培养，３０ ℃、１８０ ｒ ／ ｍｉｎ 培养 ２４ ｈ，再以乳
糖为底物，通过薄层层析分析，筛选出具有转糖基活
性的 β 半乳糖苷酶产生菌株。 运用 １６Ｓ ｒＤＮＡ序列
分析，对筛选的目的菌株进行菌种鉴定。
１􀆰 ３　 β 半乳糖苷酶的基因克隆、异源表达
１􀆰 ３􀆰 １　 β 半乳糖苷酶的基因克隆
参照 ＧｅｎＢａｎｋ 中典型菌株 Ｅｒｗｉｎｉａ ｂｉｌｌｉｎｇｉａｅ
Ｅｂ６６１基因组推测的 β 半乳糖苷酶基因序列和表
达载体 ｐＥＴ ２８ａ（ ＋）的多克隆位点设计正向引物
Ｐ１：（ＳＦ）５′ ＣＧＧＣＡＴＡＴＧＡＧＴＡＡＧＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡ⁃
ＡＣＡ ３′（下划线处为 Ｎｄｅ Ｉ 酶切位点）；反向引物
Ｐ２：（ＳＲ）５′ ＣＡＴＡＡＧＣＴＴＴＴＡＴＴＴＣＡＴＴＴＣＡＴＣＡＴ⁃
ＣＡＡＧＧＧＡ ３′（下划线处为 Ｈｉｎｄ ＩＩＩ 酶切位点）。
采用 ０􀆰 ８％琼脂糖凝胶电泳检测并回收 ＰＣＲ 产物。
将目的片段连接到 ｐＭＤ１８ Ｔ 载体，热激转化
Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ＤＨ５α。 筛选阳性菌落，提取重组质粒，经酶
切鉴定后进行测序。 将测序正确的重组质粒用
Ｈｉｎｄ ＩＩＩ和 Ｎｄｅ Ｉ 酶切后，回收目的片段，连接至用
相同双酶切后的 ｐＥＴ ２８ａ（ ＋）载体中，转化 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ
ＢＬ２１，在含卡那霉素（５０ μｇ ／ ｍＬ）的 ＬＢ 平板筛选阳
性转化子。
１􀆰 ３􀆰 ２　 β 半乳糖苷酶的异源表达
挑取阳性转化子于 ４ ｍＬ ＬＢ（含 ５０ μｇ ／ ｍＬ卡那霉
素）培养基中，３７ ℃振荡培养 １２ ｈ，以 ２％的接种量转接
到 ４０ ｍＬ 相同培养基中，３７ ℃振荡培养，当培养液
ＯＤ６００达到 ０􀆰 ５ ～ ０􀆰 ６ 时，加入 ＩＰＴＧ 至终浓度 ０􀆰 １
ｍｍｏｌ ／ Ｌ，３０ ℃诱导培养 ８ ｈ后，离心收集细胞。 用磷酸
缓冲溶液（５０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ，ｐＨ ７􀆰 ０）悬浮细胞，超声破碎细
胞，于 ４ ℃下，１２ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ离心 １５ ｍｉｎ，收集上清液作
为粗酶液，进行酶活测定及 ＳＤＳ ＰＡＧＥ分析［６］。
１􀆰 ３􀆰 ３　 β 半乳糖苷酶酶活力及蛋白含量的测定
参照文献［７－８］进行 β 半乳糖苷酶酶活力及
１３　 第 ６期 王　 欣等：β 半乳糖苷酶的筛选、克隆表达、酶学性质及其酶法合成低聚半乳糖
蛋白含量的测定。 人工底物的分光光度法检测灵
敏度高，不易受干扰，操作方便，本实验采用 ｏＮＰＧ
为底物的比色法进行 β 半乳糖苷酶酶活的测定。
蛋白质含量的测定参照 Ｂｒａｄｆｏｒｄ 法，以牛血清白蛋
白（ＢＳＡ）为标准蛋白。
１􀆰 ４　 β 半乳糖苷酶的分离纯化及酶学性质
１􀆰 ４􀆰 １　 β 半乳糖苷酶的分离纯化
利用 ｐＥＴ ２８ａ（＋）表达载体在 Ｎ端所带 Ｈｉｓ标
签，在 β 半乳糖苷酶的 Ｎ 端引入 Ｈｉｓ 标签，表达后
用亲和层析（镍柱）进行纯化，纯化方法见参照文献
［９－１０］，纯化后的酶进行酶活测定及 ＳＤＳ ＰＡＧＥ
分析。 用所获得纯酶进行酶学性质研究。
１􀆰 ４􀆰 ２　 β 半乳糖苷酶的酶学性质
１）反应温度、ｐＨ对 β 半乳糖苷酶活力的影响
　 将反应体系（纯酶置于 ｐＨ ６􀆰 ０ 缓冲溶液中）分别
在 ３０～７０ ℃的水浴锅中进行反应，检测不同温度对
β 半乳糖苷酶活力的影响。 在最佳反应温度下，将
反应体系分别置于 ｐＨ ５􀆰 ０ ～ ９􀆰 ０ 的缓冲液
（Ｎａ２ＨＰＯ４ ＫＨ２ＰＯ４ 缓冲液）中，检测反应 ｐＨ对β
半乳糖苷酶活力的影响
２） β 半乳糖苷酶的热稳定性及 ｐＨ 稳定性 　
酶热稳定性的测定是取同样浓度的 β 半乳糖苷酶，
分别置于 ３０～７０ ℃的水浴锅中，每隔 ５ ｈ 取样测定
残余酶活力。 酶 ｐＨ稳定性的测定是取同样浓度的
β 半乳糖苷酶，分别置于不同 ｐＨ 缓冲液中（由磷
酸缓冲配制），于 ４０ ℃保温放置，每隔 ５ ｈ取样测定
残余酶活力。
３）金属离子及 ＥＤＴＡ的影响　 为了考察金属离
子对 β 半乳糖苷酶的影响，在酶液中分别添加 Ｃｕ２＋
等金属离子（金属离子终浓度分别为 １０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ 和
１ ｍｍｏｌ ／ Ｌ），于 ３０ ℃下放置 １ ｈ后检测 β 半乳糖苷
酶活力。 以未添加离子的酶液作为对照，考察金属
离子对酶活力的影响。
４）有机溶剂的耐受性 　 将该酶放置在体积分
数为 ２０％的不同有机溶剂条件下，定时取样测定残
余酶活力，考察酶对不同溶剂的耐受性。
１􀆰 ５　 β 半乳糖苷酶催化合成低聚半乳糖
１􀆰 ５􀆰 １　 低聚半乳糖合成初始条件及产率计算
催化反应的初始体系（１ ｍＬ 反应体系）：３００
ｇ ／ Ｌ乳糖，加酶量 １􀆰 ０ Ｕ（以 １ ｇ 乳糖计），ｐＨ ６􀆰 ５ 的
磷酸缓冲液，温度 ３５ ℃、１８０ ｒ ／ ｍｉｎ 下反应，在 ２４ ｈ
内每隔 ４ ｈ取样检测低聚半乳糖的合成率。 以不加
酶的反应体系为对照。
低聚半乳糖合成产率的计算见式（１）。
合成率 Ｃ ＝ （１ Ａ
Ｂ
） × １００％ （１）
式中：Ａ为反应结束后测得的葡萄糖、半乳糖和乳糖
的总质量浓度（ ｇ ／ Ｌ），Ｂ 为初始反应时添加乳糖的
质量浓度（ｇ ／ Ｌ）。
１􀆰 ５􀆰 ２　 低聚半乳糖的检测
薄层层析（ＴＬＣ）检测条件：转糖基产物点样于
硅胶板，展开剂展开，雾喷显色剂，于 １２０ ℃显色。
展开剂为 Ｖ（正丁醇） ∶ Ｖ（乙酸） ∶ Ｖ（水）＝ ８ ∶ ４ ∶ １；显
色剂为 ２０％ Ｈ２ＳＯ４ 配制的 ０􀆰 ５％的 ３，５ 二羟基
甲苯。
ＨＰＬＣ 检测条件：色谱柱为 Ｋｒｏｍａｓｉｌ 氨基柱
（２５０ ｍｍ×４􀆰 ６ ｍｍ，５ μｍ），流动相为乙腈 水溶液
（两者体积比为 ７５ ∶ ２５），流速 １􀆰 ０ ｍＬ ／ ｍｉｎ，柱温 ３０
℃；进样量 １０ μＬ，检测器为示差折光检测器。 单糖
（葡萄糖和半乳糖）、乳糖、三糖和四糖的保留时间
分别为 １０􀆰 ３、１４􀆰 ８、１７􀆰 ３和 ２３􀆰 ７ ｍｉｎ。
２　 结果与讨论
２􀆰 １　 β 半乳糖苷酶产生菌株的筛选
对保存的耐有机溶剂微生物菌库中的 １ ６３２
株菌，采用人工底物 ｏＮＰＧ为筛选标记，产 β 半乳
糖苷酶的菌株能够水解 ｏＮＰＧ 产生黄色的邻硝基
苯酚（ｏＮＰ）。 根据显色反应筛选，获得产 β 半乳
糖苷酶的菌株 ２５８ 株，将初筛菌株进行发酵培养，
以乳糖为底物，进一步进行乳糖转糖基反应，利用
ＴＬＣ 进行筛选，结果见图 １。 由图 １ 可知：通过筛
选获得具有转糖基活性的 β 半乳糖苷酶的菌株 ６
株，其中第 ６ 号菌株为转糖基活性较好的菌株
ＷＸ１，可作为进一步研究的候选菌。 通过 ＨＰＬＣ
检测菌株 ＷＸ１ 转糖基活性 （图 ２），并通过 １６Ｓ
ｒＤＮＡ 序 列 分 析， 该 菌 株 被 鉴 定 为 Ｅｒｗｉｎｉａ
ｂｉｌｌｉｎｇｉａｅ，命名为 Ｅｒｗｉｎｉａ ｂｉｌｌｉｎｇｉａｅ ＷＸ１。
图 １　 转糖基反应产物 ＴＬＣ分析
Ｆｉｇ􀆰 １　 Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｇａｌａｃｔｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｂｙ ＴＬＣ
２３ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷　
１—单糖；２—乳糖；３～４—低聚半乳糖
图 ２　 转糖基反应产物 ＨＰＬＣ分析
Ｆｉｇ􀆰 ２　 Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｇａｌａｃｔｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｂｙ ＨＰＬＣ
２􀆰 ２　 β 半乳糖苷酶的基因克隆及异源表达结果
根据在 ＧｅｎＢａｎｋ中搜索 Ｅｒｗｉｎｉａ ｂｉｌｌｉｎｇｉａｅ Ｅｂ６６１
菌中推测的 β 半乳糖苷酶基因序列设计引物，扩增
到约 １ ４００ ｂｐ的 ＰＣＲ 产物，与预期大小一致。 经限
制性内切酶 Ｎｄｅ Ｉ 和 Ｈｉｎｄ ＩＩＩ双酶切后插入经相同酶
切的质粒 ｐＥＴ ２８ａ（＋）中得到重组质粒 ｐＥＴ ｇａｌ。
图 ３为 ｐＥＴ ｇａｌ双酶切验证图。 对 ｐＥＴ ｇａｌ插入部
分测序表明，Ｅｒｗｉｎｉａ ｂｉｌｌｉｎｇｉａｅＷＸ１的 β 半乳糖苷酶
基因的开放阅读框（ＯＲＦ）为１ ４２８ ｂｐ，编码 ４７５ 个氨
基酸，理论相对分子质量为 ５􀆰 ２ × １０４。 与 Ｅｒｗｉｎｉａ
ｂｉｌｌｉｎｇｉａｅ Ｅｂ６６１基因组推测的 β 半乳糖苷酶的同源
性达到 ９９％，氨基酸序列一致，但是 Ｅｒｗｉｎｉａ ｂｉｌｌｉｎｇｉａｅ
Ｅｂ６６１菌 β 半乳糖苷酶未曾报道。 将鉴定后的重组
质粒 ｐＥＴ ｇａｌ转化大肠杆菌 ＢＬ２１感受态细胞，得到
重组菌 ＢＬ２１ ／ ｐＥＴ ｇａｌ。 重组菌 ＢＬ２１ ／ ｐＥＴ ｇａｌ经过
诱导表达条件的初步优化，比酶活达到 ２􀆰 ８３ Ｕ ／ ｍＬ，
约为对照菌 ＢＬ２１ ／ ｐＥＴ酶活力的 ３０倍。 利用重组蛋
白的 Ｈｉｓ标签进行镍柱亲和层析纯化后，ＳＤＳ ＰＡＧＥ
分析显示纯化后的目的蛋白呈单一条带（图 ４），其表
观相对分子质量约为 ５􀆰 ２×１０４，与推测的理论相对分
子质量一致。 纯化后比酶活提高 ２０倍，β 半乳糖苷
酶回收率达到 １０􀆰 ３％ （表 １）。 首次实现来源于
Ｅｒｗｉｎｉａ ｂｉｌｌｉｎｇｉａｅ菌 β 半乳糖苷酶的克隆表达。
Ｍ—标准 ＤＮＡ；１—ＮｄｅＩ＋Ｈｉｎｄ ＩＩＩ双酶切 ｐＥＴ ｇａｌ结果；
２—β 半乳糖苷酶基因；３—ＮｄｅＩ＋Ｈｉｎｄ ＩＩＩ双酶切 ｐＥＴ ２８ａ结果
图 ３　 ｐＥＴ ｇａｌ双酶切验证图谱
Ｆｉｇ􀆰 ３　 Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＥＴ⁃ｇａｌ
Ｍ—标准蛋白；１—ＢＬ２１ ／ ｐＥＴ上清；
２—ＢＬ２１ ／ ｐＥＴ ｇａｌ上清液；３—纯化后的 β 半乳糖苷酶
图 ４　 重组蛋白的 ＳＤＳ ＰＡＧＥ电泳
Ｆｉｇ􀆰 ４　 ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ
ｐｌａｓｍｉｄ ｐＥＴ⁃ｇａｌ
表 １　 β 半乳糖苷酶 ＧＡＬ纯化参数
Ｔａｂｌｅ １　 Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ β⁃ｇａｌａｔｏｓｉｄａｓｅ
步骤 总酶活 ／ Ｕ ｍ（总蛋白） ／ ｍｇ 比酶活 ／ （Ｕ·ｍｇ－１） 回收率 ／ ％ 纯化倍数
初酶液 ２８３ ２１６􀆰 ２ １􀆰 ３０８ ９ １００ １
镍柱纯化 ２９􀆰 １５ １􀆰 ０７ ２７􀆰 ２７ １０􀆰 ３０ ２０􀆰 ８０
２􀆰 ３　 β 半乳糖苷酶的酶学性质
２􀆰 ３􀆰 １　 温度及 ｐＨ对 β 半乳糖苷酶的影响及其热
稳定性和 ｐＨ稳定性
图 ５为温度对 β 半乳糖苷酶活力的影响结果。
由图 ５可知，β 半乳糖苷酶最适反应温度为 ５５ ℃。
比嗜热脂肪芽胞杆菌 ＸＧ２４ 的 β 半乳糖苷酶的最
适温度 ６５ ℃稍低［１１］，与来自米曲霉的 β 半乳糖苷
酶的最适温度相似［１２］。
３３　 第 ６期 王　 欣等：β 半乳糖苷酶的筛选、克隆表达、酶学性质及其酶法合成低聚半乳糖
图 ５　 温度对 β 半乳糖苷酶活性的影响及其热稳定性
Ｆｉｇ􀆰 ５　 Ｏｐｔｉｍｕｍ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ａｎｄ ｔｈｅｒｍａｌ
ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ β⁃ｇａｌａｔｏｓｉｄａｓｅ
ｐＨ对 β 半乳糖苷酶活力影响结果见图 ６。 由
图 ６可知，ｐＨ对酶活力的影响显著。 由图 ６还可以
看出，β 半乳糖苷酶催化体系 ｐＨ 范围较窄，β 半
乳糖苷酶最适反应 ｐＨ 为 ７􀆰 ０。 与来自嗜热乳酸菌
的 β 半乳糖苷酶的最适 ｐＨ相似［１３］，乳球菌 Ｇ２００５
的 β 半乳糖苷酶的最适 ｐＨ为 ６􀆰 ５［１４］。
由图 ５还可知，在 ５０ ℃以下放置 ５０ ｈ 后，酶活
力残留 ９２％以上，该酶在 ５０ ℃以下有很好的热稳
定性，与已报道青霉 Ｌ７的 β 半乳糖苷酶在 ５０ ℃处
理 ５ ｈ酶活残留 ８０％［１３］相比，该酶 ＧＡＬ有很好的热
稳定性。 由图 ６ 还可知，该酶在 ｐＨ ５􀆰 ０ ～ ９􀆰 ０ 体系
中放置 ５０ ｈ后，在各 ｐＨ体系酶活均残留 ９０％以上，
　 　 　 　
表明该酶 ＧＡＬ有很好的 ｐＨ 稳定性，而嗜热脂肪芽
胞杆菌 ＸＧ２４的 β 半乳糖苷酶在 ｐＨ４􀆰 ０ ～ ７􀆰 ５ 处理
１ ｈ，其酶活残留 ９０％［１１］。
图 ６　 ｐＨ对 β 半乳糖苷酶活性的影响及其 ｐＨ稳定性
Ｆｉｇ􀆰 ６　 Ｏｐｔｉｍｕｍ ｐＨ ａｎｄ ｐＨ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ β⁃ｇａｌａｔｏｓｉｄａｓｅ
２􀆰 ３􀆰 ２　 金属离子及 ＥＤＴＡ对酶活的影响结果
表 ２为金属离子及 ＥＤＴＡ 对 ＧＡＬ 酶活的影响
结果。 由表 ２ 可知：在催化体系中若适当加入
Ｍｇ２＋、Ｂａ２＋、Ｍｎ２＋及 Ｆｅ３＋离子，可以提高 β 半乳糖苷
酶 ＧＡＬ的酶活，而 Ｃｄ３＋、Ｃｕ２＋对糖苷酶活有一定的
抑制作用。 与来源于短芽胞杆菌 Ｌ２００４ 的 β 半乳
糖苷酶相似［１５］。 通常，β 半乳糖苷酶的活性中心
由 ２ 个酸性氨基酸残基组成［２］。 由表 ２ 还可知，
ＥＤＴＡ显著抑制 ＧＡＬ的酶活，可推测金属离子对该
β 半乳糖苷酶维持活性结构具有关键作用。
表 ２　 金属离子及 ＥＤＴＡ对 β 半乳糖苷酶活性的影响
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｍｅｔａｌ ｉｏｎ ａｎｄ ＥＤＴＡ ｏｎ β⁃ｇａｌａｔｏｓｉｄａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ
ｃ ／ （ｍｍｏｌ·Ｌ－１）
相对酶活 ／ ％
Ｍｇ２＋ Ｂａ２＋ Ｍｎ２＋ Ｚｎ２＋ Ｐｂ２＋ Ｃａ２＋ Ｃｕ２＋ Ｃｄ３＋ Ｆｅ３＋ ＥＤＴＡ
１０ １２０ １１４ １３２ ８３ ９８ ９５ ３５ ３４ １１１ ９
１ １１５ １１１ １３０ ８５ ９９ ９８ ４０ ４１ １２２ ３３
２􀆰 ３􀆰 ３　 酶对有机溶剂的耐受性分析
有机溶剂对 β 半乳糖苷酶活性的影响结果见
图 ７。 由图 ７ 可知：在体积分数为 ２０％的甲醇、乙
醇、丙酮的体系中保温 ２００ ｈ，酶活无显著变化，体现
了很高的耐受性。 其他有机溶剂体系中保温 ２００ ｈ，
活力保持 ７２％以上，表明该酶对多种有机溶剂有很
好的耐受性。
２􀆰 ４　 β 半乳糖苷酶催化合成低聚半乳糖
通过对反应时间、反应温度、底物浓度、酶量等
条件进行优化，优化的反应条件如下：底物乳糖质
量浓度 ４００ ｇ ／ Ｌ，酶量 １􀆰 ０ Ｕ ／ ｇ（以 １ ｇ乳糖计），反应
温度 ４０ ℃，反应 １６ ｈ，低聚半乳糖产率达到 ３４％
图 ７　 有机溶剂对 β 半乳糖苷酶活性的影响
Ｆｉｇ􀆰 ７　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｏｒｇａｎｉｃ ｓｏｌｖｅｎｔｓ ｏｎ ｔｈｅ
ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ β⁃ｇａｌａｔｏｓｉｄａｓｅ
（质量分数），而后再延长反应时间，产物有少量水
４３ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷　
图 ８　 β 半乳糖苷酶催化乳糖反应进程曲线图
Ｆｉｇ􀆰 ８　 Ｔｉｍｅ ｃｏｕｒｓｅ ｏｆ ｌａｃｔｏｓｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｙ β⁃ｇａｌａｔｏｓｉｄａｓｅ
解。 与巨大芽胞杆菌 β 半乳糖苷酶合成低聚半乳
糖产率 ２５􀆰 ６８％（质量分数） ［１５］相比有所增高。 产
率与 Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ 的 β Ｄ 半乳糖苷酶合成低
聚半乳糖的产率［１６］相近。
３　 结论
以人工底物 ｏＮＰＧ 为筛选标记初筛，通过乳糖
转糖基反应复筛，成功筛选到 １株产 β 半乳糖苷酶
的菌株 Ｅｒｗｉｎｉａ ｂｉｌｌｉｎｇｉａｅＷＸ１。 该菌的 β 半乳糖苷
酶基因未曾被报道，实现了该菌株的 β 半乳糖苷酶
的克隆表达，并对酶学性质，催化合成低聚半乳糖
进行了研究。
酶学性质研究表明，β 半乳糖苷酶 ＧＡＬ 在温
度为 ５５ ℃、最适 ｐＨ为 ７􀆰 ０时对各种有机溶剂体现
了很好的耐受性，同时具有较好的温度稳定性。
该 β 半乳糖苷酶（ＧＡＬ）转糖基合成低聚半乳
糖，经过合成条件的初步优化，ＧＯＳ 产率达到 ３４％
（质量分数）。 同时转糖基这个特性不仅可以用于
低聚半乳糖的合成，还可应用于生产低乳糖高低聚
半乳糖乳制品，解除源于乳糖酶缺乏的乳糖不耐受
症，同时改善乳制品的风味和营养，具有进一步的
应用开发前景。
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（责任编辑　 荀志金）
５３　 第 ６期 王　 欣等：β 半乳糖苷酶的筛选、克隆表达、酶学性质及其酶法合成低聚半乳糖