全 文 ：Nov．2007
·48·
生物加工过程
ChineseJoumalofBioprocessEngineering
第5卷第4期
2007年11月
代谢过程中相关氨基酸对高密度发酵
生产腺苷蛋氨酸的影响
刘沛溢，王杰鹏，谭天伟
(北京化工大学 生命科学与技术学院北京市生物加工过程重点实验室，北京100029)
摘要：对清酒酵母高密度发酵生产s一腺苷山蛋氨酸(SAM)代谢过程中的相关氨基酸进行了考察。分别考察了
十二种氨基酸时生物量和SAM产量的影响。实验发现厶胱氨酸、L半胱氨酸、厶赖氨酸、L组氨酸和L蛋氨酸对
SAM的积累有利，其中￡．赖氨酸和L组氨酸可以提高生物量，进而提高SAM的产量；L-胱氨酸、L半胱氨酸和工．蛋
氨酸可以提高SAM的含量，但是套抑制生物量的增长。通过3种补加方式的比较，得到最优的补加方式为：厶赖氨
酸和厶姐氨酸在培养基中加入．L胱氨酸，L半耽氨酸和￡-蛋氨酸采取在发酵过程前24h流加。通过正变实验确
定补加量为：L赖氨酸为1e／L，￡．组氧酸为1吕／L，L胱氨酸为1，5g／L，L-半胱氨酸为1吕／L，L-蛋氨酸为1g／L。将
此结果应用于5L发酵罐培养，SAM最高产量为553g／L．生特量为128s／L。
美键词：s一腺苷一￡．蛋氧酸；氨基酸；高密度发酵；清酒酵母
中圈分类号：Q815 文献标识码：A 文章编号：1672—3678(2007)04—0048—06
Influencesofaminoacidsonhigh-cell-density
fermentationforS-adenosyl-L-methionineproductio
LIUPei—yi，WANGJie-peng，TANTian—wei
(KeyLabofBiopreeessofBeijing，CollegeofLifeScienceandTechnology
BeijingU iversityofChemicalTe hnology，Beijing100029，China)
Abstract：TheinfluencesoftwelveaminoacidsonS-adenosyl-L．methionine(SAM)productionbyS*
charomycescer visiaewereinvestigated．neresultsshowedthatL-eystine，L-cysteine，L-lysine，￡_hiB—
tidineandL．metllioninee hancedthproductionofSAM．Among山em．L．1ysineandL．histidinein．
creasedthebiomass．thusinereastheproductionofSAM．Theothersthreepromotedthconcentrationof
SAMbuthadnegativeeff ctsoilbiomass．Thleediffel ntfeedingmethodswerestudied．Itwasfoandthat
L．1ysineandL．histidineshouldbeaddedintheculturalmedia．andtheothershouldbefed uringthe
first24．111eamountsof hefiveaminuavidsweie1 s／L，1g／L，1．5s／L，lg／Landl g／Lrespectively
accordingto hogonMoptimization．Experimenton5Lfer errevealedthattheaccumulationofSAM
reached5．53g／L．and128s／Lofbiomasswaobtained．
Keywords：S-adenesyl-L·methionine；aminoacids；h sh·cell-densityferm ntation：Saccharomycescerevi-
收稿日期：2006—124)4
基金项目：国家自揣科学基金奇助项目(20306002)；田家高技术研究发展计划(863)资助项目(2002Ah217022)
作者简介：刘沛温(1981一)，男，河北传定人，硕士研究生．研究方向：截生物发酵。
联系人：谭天伟．教授，博-i-：$-导师，E-mail：twtan@marl．buet．edu．cn
万方数据
2007年11月 刘沛溢等：代谢过程中相关氨基酸对高密度发酵生产腺苷蛋氨酸的影响 ·49
s．腺苷正．蛋氨酸(SAM)屉生物细胞内广泛存
在的重要小分子，在人体内发挥着重要的生理作
用”o。SAM在细胞内的合成是在SAM合成酶催化
下，ATP分子上腺苷部分结合到蛋氨酸分子中硫原
子上的等分子反应。
近年来国内外临床研究表明，SAM对多种关节
炎疾病治疗作用显著”o；同时具有明显的抗抑郁作
用”1；对多种慢性肝病所致肝功能异常，尤其是对
酒精引起的肝损伤有显著疗效”1。
SAM的生产制备方法主要有化学合成法、酶促
转化法”o和发酵法3种，其中发酵法是目前工业化的
主要方法。发酵法采用酵母或基因工程菌，通过在培
养基中加入前体￡-蛋氨酸发酵生产SAM。Schlenk
等”o用从富含￡-蛋氨酸的面包酵母中提取SAM，取
得一定进展，SAM的细胞千质量达到50Ⅱ∥g
(DCW)，但生物量很低，无法形成可行的生产工艺。
Marthews等”1利用基因工程手段，将SAM合成酶的
基因片段克隆到Ecoli中表达，再提取酶用于SAM
的合成．尽管产物纯度高，但成本非常昂贵，不适合工
业化生产。Shiozaki等”1对清酒酵母的发酵工艺进
行丁优化．SAM产量达到5．16s／L。国内学者近年来
也开展了有关SAM的研究，uu等”o利用啤酒厂废酵
母联产SAM和谷胱甘肽(GSH)，SAM和GSH的细胞
千质量分别达到45mg／s和18ms／g，生物量为”g／
L。王远山等”⋯从土壤中筛选的酵母菌株产量达到
861mg／L。陈小龙等””对培养基和发酵条件进行优
化，SAM积累量达到1946mg／L。李东阳等人“2o在
Pwhmpo。storis表达酿酒酵母sam2基因发酵7d后
SAM产量为1．72g／L。
目前发酵法生产SAM的研究主要集中于菌种
选育和发酵条件优化方面，在发酵过程中仅补加直
接前体￡一蛋氨酸，代谢途径中其他氨基酸对SAM产
量的影响报道很少“⋯。
文献[13]考察了￡一蛋氨酸流加方式对高密度
发酵法生产SAM影响。本文进一步研究了代谢途
径中相关氨基酸对SAM产量的影响，并最终确定了
对SAM合成有利的5种氨基酸的补加方式和补加
量：并将优化结果应用于分批补料发酵。
1材料和方法
1．1菌株
酿酒酵母SAM-01由本实验室保藏。
1．2培养基
1，2．1斜面培养基(∥L)
麦芽汁10，酵母粉3，蛋白胨5，葡萄糖lo，琼
脂加。
1．2．2摇瓶培养基(g／L)
葡萄糖30，酵母粉6，磷酸氢二铵3，硫酸镁
0．8，磷酸氢二钾1，磷酸二氢钾1。
1．2．3发酵培养基(g／L)
葡萄糖70，酵母粉15，麦汁60，磷酸氢二铵10．
硫酸镁5，玉米浆16，磷酸氢二钾1，磷酸二氢钾1，
Zn“0．1．Fe“0．1．Cu“0．1和Mn“0．1。
1．2，4流加培养基
用质量浓度为600s／L的葡萄糖。
1．3分析方法
1．3．1细胞千质量DEW的测量方法
取一定体积的发酵液经4000r／min离，L,10min
后收集菌体，用去离子水洗两次，在105℃下烘干后
称质量，计算出细胞的质量浓度。
1．3．2葡萄糖质量浓度的测定
采用酶膜法(生物传感分析仪，SBA-40C，山东
省农科院)测定。
1．3．3SAM含量的测定
发酵液离心(4000r／min)10rain，收集菌体，蒸
馏水洗后用1．5mol／L的高氯酸室温破碎1．5h。
离心(4000r／min)10min收集上清液，适当稀释后
采用高效液相色谱法定量分析。HPLC条件：A61-
lentSB-C18柱(250mm×4．6m，5¨m)；流动相：
0．01moL／L的甲酸铵，用甲酸将pH调至3．0；流速：
1．0mL／min；检测波长：254nm；柱温：25℃；进样
量：5止。标准品(购自SIGMA公司)峰面积与浓
度关系作出标准曲线，样品在254／1111的峰面积代入
标准曲线换算得到SAM的含量。
1．3．4s．腺苷一￡一高半胱氨酸(AdoHC)含量的测定
与SAM条件和方法一致。标准品购自SIGMA
公司。
1．4摇瓶培养
斜面种子活化1h后接人种子培养基，250mL
摇瓶装液量25mL，28屯。180r／rain下培养24h，再
补加2s／LL一蛋氨酸转化24h。
1．5发酵罐培养 。
全自动发酵罐5L(Biotech-2002，上海保兴)中
装液量2L，接种量体积分数10％，前1h搅拌转速
为100r／min，之后按每小时提高100r／rain逐步提
万方数据
万方数据
2007年11月刘沛溢等：代谢过程中相关氨基酸对高密度发酵生产腺苷蛋氨酸的影响
原因是在转化阶段，￡-半胱氨酸、￡一胱氢酸会和￡一蛋
氨酸竞争与ATP结合，进而形成大量的岳腺苷一￡一高
半胱氨酸(AdoHC)¨5]。从图3中看到，由于AdoHC
的大量积累，阻碍了SAM的合成。而￡·组氨酸和L-
赖氨酸由于加入时间晚，对生物量的提升也非常
有限。
0
800
600S
枷薹
矗
咖
2(xl_cL
0
叻biomass目productionfAdoHC
r-1production0fSAMleoneemralionofSAM
加八方式：5种氨基酸在发酵24h时与L-蛋氪醴同时加人
图3在转化时加入5种氨基酸对SAM的影响
Fig．3Effeetsof5kindsofaminoacids(alladded
duringeonvelSioit)OFtSAM
2，4 L一组氨酸和L一赖氨酸在培养基中加入．其他3
种采用流加的单因素实验
从前两种补加方式得出：￡-组氨酸和￡-赖氨酸
适合在培养基中加入；其他3种氨基酸对生物量有
抑制作用，不适合培养基中加入，在转化阶段加入
会竞争性结合ATP，对SAM合成不利。因此选择以
下补加方式：
1 g／L的L．赖氨酸和L一组氨酸在培养基中加
入；L-胱氨酸、￡-半胱氨酸和L．蛋氨酸采用流加方
式，从0—24h共流加1g／L；24h时一次性补加葡
萄糖使质量浓度达到30吕／L，并补加L-蛋氨酸2吕／
L，转化24h后测定生物量、SAM的产量和质量分
数。空白同2．2，结果见图4。
如图4所示，采用此种补加方式，SAM质量浓
度分别比空白提高了27．63％，22．28％，24．96％，
34．76％和28．52％。与前两种补加方式相比，效果
更为明显。
2．5对￡一蛋氨酸等5种氨基酸进行正交实验
在上述单因素实验的基础上，考察这5种氨基
酸共同作用时对SAM的影响。选择0．5g／L，1
g／L，1．5g／L，2g／L4水平的5因素正交实验。厶组
氨酸和L-赖氨酸培养基中加入，其他3种氨基酸采
囫bionmss口productionfSAM_coneentrmionofSAM／％
加人方式：￡_组氨酸和L赖氨酸培养基中加入；￡一胱氨醴。L-半肮
氨酸和L蛋氨酸在前24h采用流加；24h时朴加工一蛋氨酸
围4 5种氨基酸采用不同加入方式对SAM的影响
Fig．4Effectsof5kindsofaminoacids
(addedindependently)onSAM
用流加方式，24h时1次性补加葡萄糖使质量浓度
达到30∥L，同时补加2g／LL-蛋氨酸。
从上面的正交实验表中可以得出，最佳的组合
为培养基中加入1g／L￡·赖氨酸和1g／LL-组氨酸；
在0—24h流加1．5g／L￡．胱氨酸，1g／LL一半胱氨
酸和lg／LL．蛋氨酸进入摇瓶。各因素中影响最大
的是￡．蛋氨酸，依次为L-半胱氢酸，L．组氨酸，L．赖
氨酸．￡一胱氨酸。
2．6 5L发酵罐生物转化过程考察
在培养基中加入￡一赖氨酸l∥L和￡一组氨酸1
∥L同时流加￡一胱氨酸1_5g／L，L-半胱氨酸1g／L
和L-蛋氨酸1g／L。当生物量达到100g／L时，加入
￡．蛋氨酸5g／L。发酵结果见图5。
0 10 20 30 40 50 60 70
+sAM．o_M。o+d。。。。∞trad。
—．-ethanolc ncentration
圈5优化后的发酵过程
Fig．5Thefermentationafteroptimization
o￡一=《啡Y；
j．})／一=《∞一岫k
啪
咖
枷
瑚
o●●■■■■■■■■■■■■■■■■I
H，●●口H日日H日日日M日日日M日日日阻M，●●●l●■■■■■■■■■■■■■I，日m日日HH日日M日日HM日日MH日日H副blllllL■■■■■■■■■■■■■■●B翻艮嗣豳M喇朋能曙明日朔饿船吼阴辫翰组H1-------___lp一●l■■■■■■■■■■■■■■■■■■p，●—明翻圆圈园日嘲阴啪圆圈园田嘲∞嘲皿一一正、L_________■照曰瞎圈吼目目日园园阴目M日H且对．-．．1．．．r．．L．．．-．．L．．．P．．L．．．r．．．，．．-．．．．．．L．．L
¨
n
m
8
6
4
2
O
一一■．∞羔目日g邑q
％，一=《∞i
一．-1．¨EXu=。唧《百
伽
枷
啪
。11．_-___________目n目阶阿豳H圜日明日日日日豳圜阻M111．．____-__-__--电”目盯日H日用日H翻酎研日H研嘲阻L．1L_-_--_-_--且B日盱日目嘲园日明日园曰明日园日H日H日目H日日日H日日计日日日H阻白目目目目目目目目培目目且抽B日日B目日目艮日剧“、--------量照。．¨㈨MMM㈨咀对
“
坨
m
8
6
4
2
0
一__1．∞X∞l。鼍
一j．∞)／(苫叫们一删钆
r斗乳引帮弛瓠
枣，(目。一筝暑l
109lIIu】_’I
∞如加m∞∞舯∞砷如柏∞∞m
一_-1．粤鲁≈g。兽q
万方数据
·52· 生物加工过程 第5卷第4期
在文献[13]的实验中，发酵40h生物量达到
100g／L，此时加人工一蛋氨酸；发酵58hSAM达到最
高产量4．31∥L，生物量为119．6g／L，质量分数为
3．60％，此后SAM分解趋势明显，至70h时分解了
18．1％。优化后的发酵过程，生物量在32h时达到
100g／L，此时加入L-蛋氨酸，发酵44h即可达到最
高产量5．53g／L，生物量为128g／L，质量分数为
4．32％；此后至56h只分解了7．4l％。优化后，
SAM稳定性提高，最大质量浓度提高了28．3％，生
物量提高7．1％，含量提高了20％。
表1 5种氨基酸的正交实验结果表
Table1 HeBuhsofonhogomaltestoffivemminoBcid8
3结论
通过考查代谢途径中相关的12种氨基酸对SAM
影响的单因素实验，确定了￡-赖氨酸、L-组氨酸、￡-胱
氨酸、L一半胱氨酸和￡-蛋氨酸这5种氨基酸可以提高
SAM的产量。通过3种补加方式的比较，确定最优的
补加方式：￡噬l氨酸和L．赖氨酸培养基中加入，其他3
种在发酵0—24h流加。通过正交实验确定最佳的
组合为厶赖氨酸为1g／L，L一组氨酸1g／L，L一胱氨酸
为1．5g／LL·半胱氨酸为1g／L，￡一蛋氨酸为1r,／L。
在5L发酵罐中采用优化后的补加方式，SAM最高产
量为5．53g／L，此时生物量为128g／L，质量分数为
4．32％，与文献[13]相比有明显提高。
参考文献：
【I]LuSc Reviewarticle：S-Adeno*ylmethionine[J]．InterJB e-
chemCellBio．2000(32)：391-395．
【2]BmdoHA，WiemeyerJC．S％aaaCL．eIal Experimental*
teoarthritism,ditsoollll*whentreaedwithS-adenog订·Lqn如j0_
nine[J]RevClinEsp。1990．187：74a8
万方数据
2007年11月刘沛溢等：代谢过程中相关氨基酸对高密度发酵生产腺苷蛋氨酸的影响 ·53
中德年产10万t生物能源项目在贵州启动
中德可再生能源合作框架重要项目之一的年产6—10万t生物柴油生产项目，将于2007年内在贵州正
式开工建设，贵州丰富的生物能源开发将取得重大突破。截至目前，省内已建成小油桐育苗基地约6．7km2。
种植面积超过1．3万km2。
目前贵州省自有生产工艺已建成了一套年产300t生物柴油的中试生产线，生产出的样品经广东石油
产品质量监督检验中心、北京理工大学汽车排放质量监督检验中心和德国博世、壳牌、大众公司等著名实验
室检测，结果显示其燃烧值略高于国产O#柴油，可生产出达到欧Ⅳ排放标准的生物柴油。
目前贵州采用自主研发技术建设的年产1万t和2万t生物柴油的示范装置均已试产，另外一套利用国
内技术年产5000t生物柴油的示范装置和利用德国鲁奇公司技术年产6万一10万t生物柴油的生产装置
也将于年内开工建设。
新型乳酸丙交酯成为生物塑料原料
荷兰一家为食品行业生产乳酸的Purac公司日前投资生产含有酒石酸和酒石酸钾钠的乳酸丙交酯，该
投资有望为食品、医药和日化工业更廉价有效的生物塑料包装的生产提供原料。新型的丙交酯可以承受
175。C的高温，新材料可应用于热罐装瓶，微波加热托盘，耐高温纤维和电子工业等领域。
(张春鹏)
万方数据