全 文 ：第6卷第3期
2008年5月
生物加工过程
ChineseJournalofBioprocessEngineering
May2008
· 1 ·
生物催化与生物转化研究进展
欧阳立明，许建和
(华东理工大学 生物反应器工程国家重点实验室，上海200237)
摘要：由于生物催化过程具有高效、高选择性、条件温和、环境友好等优点，因此成为可持续发展过程中替代和拓
展传统有机化学合成的重要方法。近两年的进展集中于新生物催化荆的发现和改造，以及将生物催化和生物转化
应用于工业过程的探索，包括开发新的反应体系，新的固定化方法等。可以预见，在医药中间体等高附加值化工产
品的生产过程中，生物催化和生物转化的应用将呈现加速增长趋势。
关键词：生物催化；生物转化；工业过程
中图分类号：Q814．9 文献标识码：A 文章编号：1672—3678(2008)03—0001—09
Progressinbiocatalysisndb otransformation
OUYANGLi-ming，XUJian—he
(StateK yLabofBioreactorEngineering，EastChinaUniversityofScienceandTechnology，Shanghai200237，China)
Abstract：Biocatalysisis nimportantw ytoreplacendxpandtraditionalorganicsynthesisforitssig-
nificantadvantagesa8highefficiency，highselectivity，moderatereactionc ditionandenvironmental
benign．Progressofrecenttwoyearsfocusedonthediscoveryandimprovementofbiocatalysts，exploring
ontheapplicationofbi eatalysisandb otransformationtoindustrialsc ewhichincludesdevelopingnew
reactionsystemsandnewimmobilizingmethods．Itisforecastedtheapplicationofbiocatalysisandbio·
transformationwilldevelopra idlyintheproductionofhighvalue-addedchemicalssuchasmedicalinter-‘
mediates．
Keywords：biocatalysis；biotransformation；industrialprocess
众所周知，自然界天然产物分子结构与功能的
多样性源自酶催化及多酶合成途径的强大威力。
人类虽然只学会了大自然生物催化技能的很小一
部分，就已经合成出大量丰富的天然化合物并用于
医药、农药、化工中间体和生物材料⋯。
由于生物催化过程具有高效、高选择性、条件
温和、环境友好等优点，因此成为可持续发展过程
中替代和拓展传统有机化学合成的重要方法。在
重要化工中间体的制备中，生物转化具有重要应用
价值：已经应用于常规工业化过程的反应包括酯
酶／脂肪酶和蛋白酶对底物的手性拆分和水解，酮
的不对称还原等；正在扩大应用的反应有腈水解酶
催化的腈水解反应和醇腈酶催化的氰醇合成反应；
已取得较大进展而且有较高工业化应用价值的反
应有转氨基反应、烯酸还原反应、羟基化、单加氧酶
催化的BaeyerVilliger反应、环氧化物水解、环氧化、
收稿日期：2008-01-07
基金项目：科技部863资助项目(2006AA022205，2007AA022225)；国家自然科学基金资助项目(20576037。20672037)；上海市自然科
学基金资助项目(07ZRl4030)
作者简介：欧阳立明(1974一)，女，湖北宜昌人，博士，副教授．研究方向：生物催化。
联系人：许建和，教授，E·mail：Jianhexu@eeust．edu．cn
万方数据
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卤代反应等，图1对这些反应类型进行了总结‘21。
除此以外，生物催化在新药发现过程中也开始显示
出巨大潜力。高通量合成先导化合物的衍生分子
库是新药发现中至关重要的环节，而生物催化正在
攻克其中大量的合成难题。比如选择性加氧反应，
Expandingchemistries
Nitrilereduction Cyanohydrinsynthesis
(nitrilase)[59—62】(0。ynitrilases)[63，64】
。人CN，一r渊且旦量NR～，一≯R， ≯R，兰当#oN
㈣
难以用传统化学合成方法完成，可以通过加氧酶实
现。生物催化所胜任的过程，从小分子化合物的手
性拆分到复杂结构如大环内酯和可生物降解多聚
体的合成，有了很大扩展，因此在组合合成化学中
占有越来越重要的地位‘”。 ．
(a)已建立的反应是指用商品酶(>50种)建立的常规工业化反应；(b)正在扩大应用的反应是指一小部分用商品酶建立的工业化反应；
(c)新兴的化学反应是指那些一旦催化剂库完善就会对制药企业形成实质性作用的新反应类型。缩写：R，R0，一般烷基。
图1 生物催化合成反应类型示例‘2】
Fig．1Biocatalyticchemistriesforsynthesis
然而，酶的筛选过程、稳定性、表达和分泌水
平、在非水相反应体系中的性能、对底物的专一性
和兼容性等问题限制着它的大规模应用。近年来，
随着对生物代谢途径和多样性、结构生物学认识的
深入以及多学科前沿的交叉渗透，酶的发现、改造、
固定化和反应体系优化、组合生物催化等研究过程
大大加速，研究成果El新月异。实际上，生物催化
和生物转化由于其巨大的应用价值，激发了化学、
生物学和工程学多种学科背景科学家的极大热情；
而这一领域内迅速积累的研究成果也即将使其成
为新一代工业生物技术产业的主力板块和新药发
现的平台技术H1。
本文精选了近两年来在生物催化和生物转化
领域内大量论文中最为引人注目的部分成果，分为
催化剂、反应系统、应用领域和典型案例几部分进
行了综述。
1生物催化剂
当前工业生物催化发展的制约因素之一就是
商品化的生物催化剂种类不够多、适用的反应类型
有限、底物耐受浓度、反应速度、转化率、手性拆分
效率、对有机溶剂耐受性等性质难以十全十美，这
就需要更大规模地从自然界(包括微生物、植物、动
物和宏基因组文库等)筛选具有特定功能的新催化
剂，并加以改造。
万方数据
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1．1新生物催化剂的发现
不论是从自然界筛选或是用定向进化等手段
对天然酶进行改造，都需要有效的筛选(screening)
或选择(selection)方法。而克服“筛选瓶颈”的关键
在于微量化、高通量、自动化的操作与检测平台。
克隆自动挑取仪、移液工作站、样品管理系统等自
动化设备大大提高了操作效率；相比之下，高通量
的检测方法则依不同反应的特性而各不相同，更加
考验研究者的智慧。Pohn等∞1报道了一种高密度
微克隆点阵(highdensitymicro·colonyarrays)结合光
学传感和自动图像分析的筛选平台技术(图2)。通
过将适当稀释后的菌体混合培养物点样到膜上，然
后在固体培养基上培养，可形成高密度的单克隆点
阵；点阵可复制到含诱导物的固体培养基上诱导培
养，再通过pH变化导致的荧光强度改变进行自动
图像分析，可以同时对7000个微克隆中的酶活力
(差异度10％一20％)进行快速检测。
图2微克隆点阵筛选装置和原理‘51
Fig．2Thexperimentalsetupandetectionprinciple
近年来在生物催化剂筛选方面的不断努力，使
人们得以发现其越来越广泛的应用价值。比如从
多细胞担子菌灰盖鬼伞中克隆得到去饱和酶，在酵
母中表达后，可以积累生成4种新的不饱和脂肪
酸哺1；应用真菌来源的内酯水解酶生产手性羟基
酸"1；应用细菌来源的腈水解酶水解氰基化合物等
获得手性羧酸和胺等¨J。
1．2对天然酶的改造
定向进化是对酶进行分子改造的常用方法。
图3示意了建立定向进化突变体库的3种策略：随
机突变，靶向突变和大片段重组。1)随机突变：可
以对蛋白质的全序列内任意位点引入替代氨基酸，
有可能发现远离活性位点的突变带来的功能改进。
图3上方所示结构中的4个突变位点就是对哺乳动
物细胞色素P450281进行随机突变后发现的，突变
体使酶对几种底物的活性有所增强；下方的条形图
显示出几个突变位点在一级序列中的位置；2)靶向
突变：根据蛋白质结构信息选择出少量氨基酸位点
进行随机化突变，这个方法可以有效针对活性位点
产生多样化突变体。图中残基就是为了提高荧光
假单胞菌酯酶手性选择性而进行靶向突变的位点；
3)重组：对同一家族的多个蛋白序列进行重组可以
同时产生大量的序列变化。图3中所示为对细菌
P450重组后生成的嵌合突变体，深色和浅色区域来
自不同亲本‘91。
定向进化在改造酶的性质方面已经取得了很
多成功。定向进化技术的知名学者——ReetzMT
组在2007年报道了对手性选择性杂合催化剂进行
定向进化的实验结果。对酶的突变体用与过渡金
属结合的非手性配体进行化学修饰，形成杂合催化
剂；以过渡金属催化的反应来筛选这些突变体，可
得到催化性能改善的催化剂，相应的基因则可作为
下一轮随机突变进化的起点。整个过程重复几轮，
可以得到手性选择性大大提高的突变体¨引。
万方数据
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2反应系统
图3定向进化的常用策略‘9】
Fig．3Threestrategiesforproducingsequencelibrariesfordirectedevolution
过去几十年里，学术界和工业界都非常关注开
发新的溶剂。氟两相体系、离子液体、超l临界流体
和固一气界面相等新的介质体系已经打开了新的应
用前景。氟两相对于方便地控制反应体系的相变
而使产物和催化剂的接触与分离变得容易。离子
液体引入有机合成，以适合工业过程13益增长的洁
净技术要求。然而，离子液体的毒性情况仍然不太
明确，还需要进一步研究来评价其可持续性。超临
界流体已经成为一种成熟的技术，其潜力不在于流
体种类的数量，而在于一种超临界流体在不同压力
下所体现性质的多样性。酶催化的气一固相界面反
应目前发展很快，也将为生产高附加值的化合物
(如香料)提供新的方法¨1‘12]。
2．1 氟两相系统和超临界CO：中的均相生物催化[13】
酶常常被用于在非水相条件下催化酰胺和酯
的形成，以及处理那些工业上重要的严格水溶性底
物。将酶以在氟溶剂和超临界流体中可溶的活性
形式来进行反应是对反应设计的重要创新，可实现
减少反应污迹，将蛋白质嵌合到材料中等多种可能
性。为了形成均相反应体系以利于有效的传质，多
种非水相介质中增溶酶的方法已被报道，包括疏水
离子对(hydrophobicionpa ring，HIP)。疏水离子对
一般产生于阴离子表面活性剂(如sodiumbis(2．
ethylhexyl)sulfosuccinate，AOT)和溶解于缓冲液
(pH低于等电点)的蛋白质表面阳离子残基(如
Lys，Arg和His)之间。这样，蛋白质会沉淀或者被
直接萃取到非水的另一相中。溶于有机溶剂的
HIP一酶复合体被报道具有比悬浮或固定化酶更高的
催化活性。文献[13]首次报道了将蛋白质通过与
全氟聚醚羧酸盐表面活性剂(perfluoropolyethercar-
boxylatesurfactants)KrytoxFSL157andKDP4606形
成离子对，而从水溶液萃取到氟溶剂——全氟甲基
环己烷(perfluoromethylcyclohexane，PFMC)的方法
(图4)。
细胞色素c与高度氟化的阴离子表面活性剂在
PFMC中基于疏水离子对形成的蛋白质一表面活性剂
复合体，溶解度可高达每mL20mg蛋白。经动态光
散射和圆二色谱检测发现，蛋白质的二级结构在离子
对复合体中仍然维持活性形式。由Ot．胰凝乳蛋白酶
(Ot-chymotrypsin，CMT)与阴离子表面活性剂(AOT，
KDP)形成复合体，在PFMC溶剂中酶活提高了数万
倍。同时，氟两相体系中的CMT—KDP复合体回收也
非常方便，仅通过温度控制就可实现两相的混合和分
离，经过4轮反应和回收仍具有酶活。作为对比，文
章还考察了复合体在超临界CO：流体中的溶解度和
酶活力。结果表明，蛋白质．阴离子表面活性剂疏水
离子对复合体在氟两相体系和超l临界CO：中都可形
成均相溶液，并且具有很高催化活性。实现了氟两相
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A．一红色的血红素蛋白一细胞色紊c水溶液；B一溶解在PFMC的Krytox；C一两相系统最初体现为细胞色素c在上层水相；D一随着搅拌，
细胞色素e与Krylm分子形成离子对而被萃取到下层氟相，无色水相含有的细胞色素C质量分数低于起始量的l％。多达20mg／mL的细
胞色素c可被转移到氟相；E一如果使用grytox醇而不是酸，则不能形成离子对，细胞色素c也就仍然留在水相。(细胞色素c和Zrytox分
子并非按比例绘制。为清楚以见，HIP复合体只示意了多个Kryl“分子包围单个细胞色素c分子的情况。)
图4细胞色素C与Krytox形成的疏水离子对¨驯
Fig．4Hydrophobici npmfing(HIP)ofcytoehromec(Cc)withKrytox
体系中的均相生物催化，提供了一种新的途径来实现
高效催化，并使催化剂和产物的分离回收非常简便
易行。
2．2应用热稳定性过氧化物酶．多聚赖氨酸膜进行
90℃高温生物催化¨4o
将酶与多聚赖氨酸(poly(L-lysine)，PLL)共价
连接形成交联膜可以大大提高酶的热稳定性，实现
90℃下的高温生物催化。Soret光谱、圆二色谱和伏
安法显示，含有过氧化物酶或肌球蛋白的PLL膜可
在90℃下稳定存在9h，而同样的酶在溶液中20
rain内就完全变性。用酶一PLL膜生物催化叔丁基过
氧化氢(t-BuOOH)的还原，用旋转圆盘伏安法检测，
获得了kcat／Km值。结果显示，辣根过氧化物酶
(horseradishperoxidase，HRP)-PLL的酶活力在25
℃下是大豆过氧化物酶(soybeanperoxidase，SBP)-
PLL的3倍，但在90℃下两者相比，SBP-PLL活力
略高。SBP．PLL在90℃的kcat／Km值是25℃下的
8倍。用过氧化物酶．PLL包被的硅胶氧化邻甲氧基
苯酚(D．methoxyphen01)生成3，3谚·dimethoxy-4，4谚-
biphenoquinone，在90℃下的产率高于25℃，暗示
酶的催化效率和选择性在高温下更高。这些生物
胶体可重复使用，在90℃下酶活力损失很小。
3生物催化应用领域
3．1手性药物中间体
手性是影响许多药物产品安全性和有效性的
关键因素，所以药物中间体单一对映体的生产对于
制药工业日益重要。当前医药和农药行业非常需
要大量制备手性药物中间体和精细化工产品。微
生物和微生物产生的酶应用于生物转化合成化学
产品，具有高度的化学选择性、区域选择性和手性
选择性，因此有巨大的开发价值¨引。
3．2香精香料
香精香料在食品、饲料、化妆品、化学和医药领
域有广泛的应用，在世界范围内的工业规模估计达
160亿美元。市场上的许多香料化合物仍然是通过
化学合成或从植物和动物来源中萃取生产的；到目
前为止，某些植物和动物仍然是生物香料的一个重
要来源，但这些生物活性物质存在的量往往较少，
它们只能在一些珍奇(植物)品种中找到，使得分离
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· 6 · 生物加工过程 第6卷第3期
十分困难。随着合成有机化学的发展，香精香料行
业也有了快速的进步。近年来，香精香料正迅速向
生物制备和使用(微)生物源的香料化合物——生
物香料方向转变【16|。
3．3新药开发中的组合生物催化
新药发现是一项高风险、高收益的研发工作，
在我国知识经济战略中具有重要地位。其核心为
从存在于植物、动物、微生物等各种资源的天然化
学结构库中筛选获得有希望的先导化合物，然后对
其进行结构修饰以提高生理活性、生物利用率和降
低毒性。因此，建立高通量的合成和筛选平台对于
新药发现是至关重要的。组合化学(Combinatorial
Chemistry)是上世纪末新药发现的强有力技术平
台。组合化学采用自动合成技术集结某一特定化
学砌块(如氨基酸、核苷、糖和简单的有机环类等)
的所有可能组合，然后对组合库(Combinatorial)进
行筛选和归类，以便能够分离鉴定出所有有活性的
产物。一般来说，产物越多样，库中就越有可能存
在新的和有用的东西。
组合生物催化(CombinatorialBiocatalysis)是组
4典型案例
合技术最新的生长点，它利用两种及以上的生物催
化剂来对先导化合物进行高效的、连续的结构修
饰，可快速产生大量的衍生物分子库以供进一步高
通量筛选。组合生物催化也不同于组合生物合成。
后者是对生物体内存在的一个复杂代谢途径的基
因簇进行遗传修饰以改变其产物的结构，常用于对
抗生素如聚酮大环内酯的结构多样化。前者则利
用催化不同反应类型的酶(可以并不属于同一个代
谢途径)，对任意先导化合物进行多步生物催化反
应，形成多维的产物结构阵列。组合生物催化技术
用于新药发现目前在国际正在兴起，意义重大。国
际上近年来已发表数篇综述和研究论文，一些大型
跨国制药集团正投入巨资研发。国内目前仅少数
实验室开始涉足这一领域。例如生物反应器工程
国家重点实验室生物催化与生物加工研究室近年
尝试用自主筛选的糖苷酶和脂肪酶以葡萄糖为出
发底物建立了三维阵列的组合合成分子库，证明了
这一路线的可行性和巨大潜力Ⅲ】。图5所示为非
水介质系统中用糖苷酶与脂肪酶组合催化构建三
维糖基缀合物阵列的过程。
图5 非水介质系统中糖苷酶与脂肪酶组合催化构建三维的糖基缀合物阵列(Q耻)‘171
Fig．5Materialsusedforassemblingademonstrationglyc conjugatearray
4．1 用整细胞生物催化有效合成辛伐他汀(Simvas
tatin)
辛伐他汀是真菌聚酮化合物洛伐他汀的半合
成衍生物，是重要的成人降胆固醇药物。开发一种
由莫纳可林J(MonacolinJ)利用整细胞生物催化一
步反应合成辛伐他汀的过程。利用过表达酰基转
移酶LovD(已被发现的洛伐他汀生物合成基因簇成
员之一)的大肠杆菌，可使莫纳可林J生成辛伐他汀
的转化率高于99％，并且不需要任何化学保护的步
骤(图6)。关键发现在于一种膜渗透性的底物——
Ot一二甲基丁酰S一甲基一巯基丙酸酯(Ot—dimethylbutyr-
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(CHz)3CH3
CNHMel
?a)n-butylalIli。e
i砷-+{icl
Hydrolysis
珊。丫、oNH(cH溉a)NaoH
O＼／OTBS
叫⋯⋯
JL— j ”HCl
Lovastatin MonaeolinJ
OH州
L占
，
，
，
，
Lactonize，，7
，
，
，
，
，
，
4sIi—cl_+{卜oD。
·-一一一一一一一一—-
c)NH。OH
0H[匀
I些：里∥
Cellpermeable
Ot--dimethylbutyrylthioester
0
o—c·
0
佣丫＼c00_NH4+
O ～OH
Deproteetion
；RingOpening
。。H拶
生物催化实现的是从莫纳克林J到辛伐他汀的转化过程(粗黑箭头所示)；I_mD可以区域选择性酰化c8羟基；两种常规的半合成路线如虚线箭头所示
图6洛伐他汀、莫纳克林J和辛伐他汀的化学结构‘博1
Fig．6ChemicalstructuresofLovastatinc d-MonacolinJacid，andSimvastatinacid
yl—S．methyl．mercaPtopmpionate)，能够被LovD作为
酰基供体有效利用。这个过程被放大到辛伐他汀
的克级合成，而且可以从发酵液中方便地回收产
物，回收率大于90％，纯度大于98％。这种生物转
化还可应用高密度，流加培养发酵实现。整细胞生
物催化可以成为当前多步骤半合成辛伐他汀反应
的良好替代方法¨8|。
4．2有前途的不对称氢转移生物还原方法¨州
在填料床反应器中用固定化生物催化剂连续
生产手性1，3．丁二醇(1，3-butanedi01)，该方法是有
前途的。由突变的红球菌(Rhodococcus)苯乙醛还
原酶(phenylacetaldehydereductase，PAR)或赖氏菌
(Leifsonia)醇脱氢酶(alcoholdehydrogenase，
LSADH)组成的不对称氢转移生物催化剂被用于还
原一些水溶性的酮底物。其中，4一羟基．2一丁酮被还
原为S／R一1．3．丁二醇，一种有用的医药中间体，反应
具有高产率和高立体选择性。过量表达PAR突变
体(Ser268)或者LSADH的大肠杆菌整细胞用聚乙
烯亚胺或1，6一己二胺与戊二醛直接固定化，被应用
于批次反应。该系统可以分别生产S-1，3-丁二醇
(e．e．值87％，时空产率12．5ms／(h·mL)催化剂)
或者R-1，3一丁二醇(e．e．值99％，时空产率60．3
ms／(h·mL)催化剂)。填料床反应器中的固定化
细胞可连续500h以上，转化5％4一羟基-2一丁酸酯
(4-hydroxy-2-butanoate)生产R一1，3一丁二醇，产率达
到99％，产物质量浓度约49．5g／L。
4．3 胺的生物催化动态动力学拆分和原位自由基
介导的外消旋化Ⅲ’
脂肪酶拆分和硫自由基介导的原位外消旋化
联合应用可实现非苯甲基胺的动态动力学拆分，高
对映选择性生成尺构型的胺。此方法可应用于外
消旋混合物的转化或|s构型对映体的转换。
4．4红景天苷的酶法合成
红景天苷是一种具有抗缺氧、抗辐射和抗疲劳
活性的天然糖苷，可以增进机体的抗缺氧能力，延
缓衰老。采用苹果加工过程中的废弃物——苹果
籽粉作为天然酶原，可以有效合成红景天苷等一系
列天然糖苷。而且，所有的催化剂、溶剂和过量的
影
万方数据
生物加工过程 第6卷第3期
底物都可以重复使用或者回收利用。反应在清洁
低毒的介质叔丁醇中进行，生成的葡萄糖苷可以用
氧化铝柱吸附法从反应体系中分离，而过量的底物
则可回收再利用。苹果籽粉用戊二醛交联，形成多
图7
Fig．7
孔网状结构的固定化酶，可以显著改善生物催化剂
的稳定性，半衰期从29d提高到51d。生物反应器
(图7)的产率可以达到1．9g／(L·d)，产品纯化后
纯度达到99．3％‘2¨。
螭HOH⋯肿飞芋矗瓠qH20OH
以交联苹果籽粉为催化剂。在与氧化铝吸附柱偶联的固定床酶反应器中高效生产珍稀天然产物红景天苷Ⅲ1
Enzymaticsynthesisofsalidrosidecatalyzedbycross．1inkedappleseedmealintegratedwithaluminaadsorption【21】
由于生物催化的巨大应用价值，已涌现了一批
专门从事新型生物催化剂筛选和开发的生物技术
公司如Genencor，Diversa，Bioverdant等，许多大型制
药企业如美国拜尔先灵制药公司，德国BASF公司，
德国Merk公司，荷兰DSM公司，加拿大BioCatalyt-
ics公司，美国Dupont公司，日本Kaneka公司等都
正在积极进行工业化开发，将有价值的实验室成果
应用到工业规模。在生物技术公司、大型制药企业
和众多科研机构的推动下，生物催化和生物转化领
域的基础研究和应用研究成果正在迅速增长，可以
预见，在医药中间体等高价值化工产品的生产过程
中，生物催化和生物转化的应用将呈现跳跃式增长。
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昆明理工大学研发出生物柴油制备新技术
昆明理工大学能源工程实验室以王华教授为首的科研团队，围绕“生物柴油超临界流体制备技术”、“生
物质及可燃固体废物超临界流体液化转化制备液体燃料”等课题，已初步建成了生物液体燃料产品性能检
测分析试验、内燃机台架验证等研发平台，并成功自主研发生物柴油制备生产技术。利用一台小型移动式
通用生物柴油制备装置，就能将小桐籽油、橡胶籽油、棉籽油和餐饮业废油等加工成纯度达99％以上的生物
柴油。
(张春鹏)
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Ⅲ
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