全 文 ：第 １３卷第 ４期
２０１５年 ７月
生　 物　 加　 工　 过　 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ􀆰 １３ Ｎｏ􀆰 ４
Ｊｕｌ􀆰 ２０１５
ｄｏｉ：１０􀆰 ３９６９ ／ ｊ􀆰 ｉｓｓｎ􀆰 １６７２－３６７８􀆰 ２０１５􀆰 ０４􀆰 ００４
收稿日期：２０１４－０４－２３
基金项目：国家杰出青年基金（２１０２５６２５）；国家高技术研究发展计划（８６３ 计划） （２０１２ＡＡ０２１２０３）；国家支撑计划（２０１２ＢＡＩＧ４００１）；国家自然
科学基金青年基金 （ ２１１０６０７０）；长江学者和创新发展计划 （ ＰＣＳＩＲＴ）；江苏省高校优势学科建设工程；江苏自然科学基金
（ＳＢＫ２０１１５０２０７）
作者简介：费俊杰（１９８９—），男，江苏启东人，硕士研究生，研究方向：酶催化；应汉杰（联系人），教授，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｙｉｎｇｈａｎｊｉｅ＠ ｎｊｔｅｃｈ．ｅｄｕ．ｃｎ
树脂固定化 β 半乳糖苷酶制备低聚半乳糖
费俊杰，李冰冰，陈　 勇，应汉杰
（南京工业大学 生物与制药工程学院 国家生化工程技术研究中心，南京 ２１１８００）
摘　 要：以树脂为载体研究 β 半乳糖苷酶固定化条件，来改善酶性质。 以吸附率和回收率最高的离子交换树脂
Ｉ００２为载体，通过先吸附后交联的方法固定 β 半乳糖苷酶，优化固定化条件。 结果表明：加酶量为 ５１􀆰 ８ Ｕ（以 １ ｇ
树脂计），固定 ｐＨ为 ６􀆰 ５，温度是 ２５ ℃，吸附时间 １２ ｈ，戊二醛体积分数为 ４％，交联温度是 ４０ ℃，时间是 ６ ｈ时，固
定化效果最好。 获得的固定化酶活可达 １６􀆰 ２ Ｕ，固定酶回收率为 ３９􀆰 １％，得到低聚半乳糖（ＧＯＳ）的产率为 ２４􀆰 ２％。
该研究为工业化利用固定化乳糖酶连续生产低聚半乳糖提供了技术依据。
关键词：β 半乳糖苷酶；固定化；低聚半乳糖；树脂
中图分类号：Ｑ８１４　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２－３６７８（２０１５）０４－００１７－０６
Ｇａｌａｃｔｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ β⁃ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｏｎｔｏ ｒｅｓｉｎｓ
ＦＥＩ Ｊｕｎｊｉｅ，ＬＩ Ｂｉｎｇｂｉｎｇ，ＣＨＥＮ Ｙｏｎｇ，ＹＩＮＧ Ｈａｎｊｉｅ
（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｎａｎｊｉｎｇ Ｔｅｃｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ ２１１８００，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｗｅ ｕｓｅｄ ｒｅｓｉｎ ａｓ ａ ｃａｒｒｉｅｒ ｔｏ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅ β⁃ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ
ｇａｌａｃｔｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ． Ｃａｔｉｏｎ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｒｅｓｉｎ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ｒａｔｅ ａｎｄ ｒｅｃｏｖｅｒ ｒａｔｅ ｗａｓ
ｓｅｌｅｃｔｅｄ ａｓ ｔｈｅ ｃａｒｒｉｅｒ． Ｔｈｅ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｗａｓ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ｃｒｏｓｓ⁃ｌｉｎｋｉｎｇ ａｆｔｅｒ
ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ β⁃ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ．Ｔｈｅ ｂｅｓｔ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｗａｓ ｅｎｚｙｍｅ ｌｏａｄ ５１􀆰 ８ Ｕ ／ ｇ ｒｅｓｉｎ，ｐＨ ６􀆰 ５，２５ ℃，
ｔｉｍｅ １２ ｈ； ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ ｏｆ ４％（ｖ ／ ｖ）； ｔｈｅ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｉｎ ｃｒｏｓｓ⁃ｌｉｎｋｉｎｇ ａｃｔｉｏｎ
ｗａｓ ４０ ℃，ｔｈｅ ｔｉｍｅ ｗａｓ ６ ｈ． Ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ， ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｅｎｚｙｍｅ ｗａｓ １６􀆰 ２ Ｕ ／ ｇ
ｒｅｓｉｎ， ｔｈｅ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｅｎｚｙｍｅ ｆｉｘｅｄ ｗａｓ ３９􀆰 １％， ｔｈｅ ｇａｌａｃｔｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ （ ＧＯＳ） ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｗａｓ
２４􀆰 ２％． Ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ｔｅｃｈｎｉｃａｌ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＧＯＳ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：β⁃ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ；ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ；ｇａｌａｃｔｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ；ｒｅｓｉｎ
　 　 低聚半乳糖（ＧＯＳ）属于益生元，是近年来备受
关注的功能性低聚糖，并且是众多功能性低聚糖中
获得最广泛认可、最为安全的低聚糖之一［１］。 它不
仅可以促进人体肠道内益生菌增殖，调整肠道菌群
平衡，增强人体免疫机能和机体的非特异和特异性
免疫反应等功能，还有低甜度、低能量、非消化性、
安全性高等特点，是其他低聚糖无法相比的，可以
说是促进人体健康的重要功能性食品成分，可广泛
应用于食品加工中。
目前，低聚半乳糖的制备主要有 ５ 种方法［２－３］：
＼ ＼ＤＺ１９ ＼Ｄ ＼孙桂云 ＼生物加工 ２０１５ ＼第 ４期 ＼第 ４期．ＰＳ　 ４校样　 排版：孙桂云　 修改日期：２０１５ ／ ０７ ／ ０８
①天然提取法。 在自然界中，低聚半乳糖含量较
少，并且不带电荷，分离提取较为困难；②酸水解多
糖法。 酸水解多糖转化率低，产品成分复杂，难以
得到含量较高的低聚半乳糖；③化学合成法。 化学
合成法试剂毒性大，易残留，不适用食品级低聚半
乳糖生产；④发酵法。 直接用微生物发酵制备低聚
半乳糖目前研究较少，该方法需要从发酵液中分离
提取低聚半乳糖，发酵液成分复杂，分离较为困难。
以上 ４种方法由于产物成分复杂，分离成本高，目前
不适合工业化生产；⑤酶法合成。 酶法合成低聚半
乳糖主要以牛乳来源的乳糖为底物，利用微生物 β
Ｄ 半乳糖苷酶催化合成，乳糖来源充足，而β Ｄ
半乳糖苷酶主要由微生物发酵制得，生产成本较
低，是目前工业化生产低聚半乳糖的主要方法。 酶
法合成 ＧＯＳ 分为游离酶和固定化酶两种。 固定化
酶法合成 ＧＯＳ 具有酶利用率高，稳定性好，产率高，
产物后处理工艺少等优点，已成为合成研究的热
点。 树脂［４］是一种廉价的材料，具有机械强度好，
物化性能稳定，容易再生等特点。
本文采用树脂作为 β 半乳糖苷酶的固定化载
体，分别对酶固定化的条件及固定化酶的性质进行
研究，以期为酶法合成低聚半乳糖提供新的思路。
１　 材料与方法
１􀆰 １　 实验材料
低聚半乳糖标品，上海惠诚生物科技有限公
司；诺维信（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）乳糖酶 Ｌａｃｔｏｚｙｍ Ｐｕｒｅ ６ ５００
Ｌ［５］，北京嘉瑞富德食品科技公司；葡萄糖、戊二醛
（体积分数 ５０％），国药集团化学试剂有限公司；乳
糖、半乳糖、牛血清白蛋白（ＢＳＡ），上海惠兴生化试
剂有限公司； ＫＨ２ ＰＯ４、 Ｋ２ ＨＰＯ４、乙醇、正丙醇、
ＮａＯＨ、无水 Ｎａ２ＣＯ３，西陇化工股份有限公司；邻硝
基苯酚 （ ＯＮＰ）、邻硝基苯 β Ｄ 半乳糖糖苷
（ＯＮＰＧ）、考马斯亮蓝 Ｇ２５０，Ｓｉｇｍａ 公司；９８％浓硫
酸、盐酸，上海凌峰化学试剂有限公司。
Ｄ１１３ 树脂、 Ｄ００１ ＣＣ 树脂、 ＨＰＤ３００ 树脂、
ＤＡ２０１ Ａ树脂，南开大学化工厂；Ｉ００２树脂、ＨＺ００４
树脂，由笔者所在课题组制备。
ＺＱＺＹ Ｃ 型恒温摇床，上海知楚仪器有限公
司；ＨＨ ２型恒温水浴锅，国华电器有限公司；ＵＶ
２６００型紫外 可见分光光度计，上海尤尼柯仪器有
限公司；１２００ ｓｅｒｉｅｓ 高效液相色谱仪，安捷伦公司；
ＨＰＸ ８７Ｈ型 Ａｍｉｎｅｘ色谱柱，Ｂｉｏ⁃Ｒａｄ公司。
１􀆰 ２　 实验方法
１􀆰 ２􀆰 １　 树脂预处理方法
Ｄ１１３、Ｄ００１ ＣＣ、ＨＺ００４和 Ｉ００２ 树脂是阳离子
交换树脂，ＨＰＤ３００、ＤＡ２０１ Ａ 树脂是大孔吸附树
脂。 先在乙醇里浸泡 ８ ｈ，用去离子水洗涤，再浸入
１ ｍｏｌ ／ Ｌ ＮａＯＨ浸泡 ８ ｈ，用去离子水洗至中性，最后
浸入 １ ｍｏｌ ／ Ｌ ＨＣｌ 浸泡 ８ ｈ，用去离子水洗至中性，
去离子水浸泡备用。
Ｉ００２树脂的活化：１０ ｇ 树脂加入到 ４０ ｍＬ 的
０􀆰 １ ｍｏｌ ／ Ｌ ｐＨ ８􀆰 ０的磷酸缓冲液中，搅拌 １５ ｍｉｎ后，
测 ｐＨ，维持 ｐＨ ７􀆰 ８􀆰 ０～８􀆰 ２，１ ｈ后过滤抽干。
１􀆰 ２􀆰 ２　 固定化乳糖酶的制备
取 １ ｇ 树脂加入到 ５ ｍＬ 的酶液里，在 ３０ ℃条
件下吸附 １２ ｈ 后，加入 ２００ μＬ 戊二醛溶液，２５ ℃、
１５０ ｒ ／ ｍｉｎ 固定化处理 ６ ｈ。 固定化结束后，固定化
酶用去离子水洗涤，晾干，测定固定化酶活和上清
液酶活。
１􀆰 ２􀆰 ３　 酶活标准曲线的绘制
称取 ２８ ｍｇ 的邻硝基苯酚（ＯＮＰ），１ ｍＬ 的甲醇
溶解，再用 ｐＨ为 ６􀆰 ５、浓度 ０􀆰 １ ｍｏｌ ／ Ｌ 的磷酸缓冲液
定容至 １００ ｍＬ，配制成 ２ ｍｍｏｌ ／ Ｌ 的 ＯＮＰ 原液，加入
不同体积的 ＯＮＰ 和磷酸缓冲液，总量为 ４ ｍＬ。 在
４０ ℃条件下反应 ２０ ｍｉｎ，加入 ２ ｍＬ 的 １ ｍｏｌ ／ Ｌ 的
Ｎａ２ＣＯ３灭活测定波长 ４２０ ｎｍ处的吸光度 ＯＤ４２０，并绘
制乳糖酶的标准曲线。
１􀆰 ２􀆰 ４　 乳糖酶酶活的测定
游离酶活力测定［６］：取 ３ ｍＬ 含有 ４ ｇ ／ Ｌ ＯＮＰＧ
的磷酸缓冲溶液于试管中，在 ４０ ℃条件下水浴 ７
ｍｉｎ，加入 １ ｍＬ稀释过的酶液，振荡，４０ ℃条件下反
应 １０ ｍｉｎ，再加入 ２ ｍＬ浓度为 １ ｍｏｌ ／ Ｌ的 Ｎａ２ＣＯ３终
止反应，摇匀，在 ４２０ ｎｍ处测定 ＯＤ４２０。
固定化酶活的测定：称取 １ ｇ 的固定化酶颗粒，
加入 １０ ｍＬ ｐＨ ６􀆰 ５ 的磷酸缓冲溶液溶解的底物
ＯＮＰＧ，于 ４０ ℃反应 ２０ ｍｉｎ，加入 １􀆰 ５ ｍＬ 浓度为 １
ｍｏｌ ／ Ｌ的 Ｎａ２ＣＯ３用来灭活，测定灭活结束后 ＯＤ４２０。
酶活的定义：在特定的反应条件下（４０ ℃、ｐＨ
６􀆰 ５、反应 １０ ｍｉｎ），每分钟催化生成 １ μｍｏｌ 的 ＯＮＰ
所需的酶量定义为一个酶活单位（Ｕ），即
乳糖酶活（Ｕ） ＝ ＯＤ４２０ × Ｎ ／ ０􀆰 ７１４ｔ （１）
式中 Ｎ为游离酶的稀释倍数；０􀆰 ７１４ 为换算系数，即
ＯＮＰ 浓度为 １ μｍｏｌ ／ Ｌ的 ＯＤ４２０；ｔ为反应时间（ｍｉｎ）。
１􀆰 ２􀆰 ５　 产物定量方法
使用美国安捷伦 １２００ 系列 ＨＰＬＣ 检测乳糖和
８１ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷　
＼ ＼ＤＺ１９ ＼Ｄ ＼孙桂云 ＼生物加工 ２０１５ ＼第 ４期 ＼第 ４期．ＰＳ　 ４校样　 排版：孙桂云　 修改日期：２０１５ ／ ０７ ／ ０８
转苷反应后的物质 （ＧＯＳ，Ｄ 半乳糖和 Ｄ 葡萄
糖）。 检测条件：流动相为 ５ ｍｍｏｌ ／ Ｌ 硫酸，柱温为
６５ ℃， 色谱柱为 Ａｍｉｎｅｘ ＨＰＸ ８７Ｈ， 流速 ０􀆰 ６
ｍＬ ／ ｍｉｎ，示差折光检测器检测，每次进样量 １０ μＬ。
１􀆰 ２􀆰 ６　 固定化酶活性吸附率和回收率计算
固定化酶活性吸附率和回收率的计算方法分
别见式（２）和式（３）。
吸附率＝加入游离酶总活力
－上清液酶活力
加入游离酶总活力
×１００％ （２）
固定化酶回收率＝
固定化酶活力
加入游离酶总活力－上清液酶活力
×１００％ （３）
２　 结果与讨论
２􀆰 １　 β 半乳糖苷酶的标准曲线
按照实验方法中酶活标准曲线绘制来测定吸
光值 ＯＤ４２０，绘制 β 半乳糖苷酶的标准曲线。 ＯＮＰ
原液添加量与测到的 ＯＤ４２０的数据见表 １。
表 １　 ＯＤ４２０数值
Ｔａｂｌｅ １　 ＯＤ４２０ｖａｌｕｅｓ
ｃ（ＯＮＰ） ／ （μｍｏｌ·Ｌ－１） ０ ０􀆰 １ ０􀆰 ３ ０􀆰 ４ ０􀆰 ５ ０􀆰 ６ ０􀆰 ７
ＯＤ４２０ ０ ０􀆰 ０５８ ０􀆰 ２０４ ０􀆰 ２７８ ０􀆰 ３６４ ０􀆰 ４２５ ０􀆰 ５０９
　 　 由表 １ 数据绘制标准曲线，标准方程为 Ｙ ＝
０􀆰 ７１４ ３４Ｘ，Ｒ２ ＝ ０􀆰 ９９９ ２。
２􀆰 ２　 乳糖酶固定化条件的优化
２􀆰 ２􀆰 １　 固定化树脂的选择确定
纯酶液酶活为 ５１􀆰 ７９６ Ｕ，加各种树脂 １ ｇ，按照
１􀆰 ２􀆰 ４节实验方法测其上清液的酶活和固定化酶
活，然后根据式（２）、式（３）来计算吸附率和回收率，
结果见表 ２。
由表 ２ 可知：大孔吸附树脂 Ｉ００２、 ＨＰＤ３００、
ＤＡ２０１ Ａ的吸附率相对比较高，可能原因是大孔
吸附树脂的表面积大且吸附量大。 离子交换树脂
固定化乳糖酶时，酶蛋白与树脂进行离子交换的机
率比较高，对酶活的影响较小，因此，其固定化酶活
回收率较高。 在 ６种树脂中，Ｉ００２ 树脂对乳糖酶的
吸附率和回收率最高，分别为 ８０％和 ３８􀆰 ５％，故选
择 Ｉ００２交换树脂作为乳糖酶固定化载体。
表 ２　 不同树脂载体的吸附率和回收率比较
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｔｈｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ｒａｔｉｏ ａｎｄ ｒｅｃｏｖｅｒ ｒａｔｉｏ ｏｆ ｓｅｖｅｒａｌ ｒｅｓｉｎｓ
固定化树脂类型 上清液酶活力 ／ Ｕ 吸附率 ／ ％ 固定化酶活 ／ Ｕ 固定化酶回收率 ／ ％
Ｉ００２ １０􀆰 ３６ ８０􀆰 ０ １５􀆰 ９５ ３８􀆰 ５
ＨＺ００４ ２７􀆰 ０９ ４７􀆰 ７ ６􀆰 ７０ ２７􀆰 １
Ｄ１１３ ２５􀆰 ６４ ５０􀆰 ５ ８􀆰 ９５ ３４􀆰 ２
Ｄ００１ ＣＣ ２２􀆰 ８９ ５５􀆰 ８ ９􀆰 ３６ ３２􀆰 ４
ＨＰＤ３００ １９􀆰 ５３ ６２􀆰 ３ ９􀆰 ８４ ３０􀆰 ５
ＤＡ２０１ Ａ ２０􀆰 ５１ ６０􀆰 ４ ８􀆰 ０４ ２５􀆰 ７
２􀆰 ２􀆰 ２　 戊二醛用量对酶固定化的影响
吸附在离子交换树脂 Ｉ００２ 上的乳糖酶容易受
外界的影响而脱落，因此，可以用戊二醛作为交联
剂来进一步提高固定化酶的稳定性。 取处理后的
Ｉ００２ 树脂 １ ｇ加入到 ０􀆰 ２ ｍｏｌ ／ Ｌ、ｐＨ ６􀆰 ５磷酸缓冲液
稀释的酶液中，然后加入 ５１􀆰 ８ Ｕ ／ ｇ（以 １ ｇ 树脂计）
的 β 半乳糖苷酶，在 ２５ ℃条件下吸附 １２ ｈ 后，加
入不同体积分数的戊二醛，在 ４０ ℃ 条件下 １５０
ｒ ／ ｍｉｎ的摇床中交联 ６ ｈ，研究戊二醛用量对固定化
酶活和固定化酶回收率的影响，结果如图 １所示。
由图 １ 可知：固定化酶回收率和固定化酶活在
戊二醛体积分数为 ４％的时候最大。 其中，戊二醛
在用量不高时主要起分子间的交联作用，可是当戊
二醛用量过高时，会导致酶分子自己的结合，从而
改变蛋白质分子的构象，使得固定化酶活降低，所
以最佳戊二醛用量确定为 ４％。
９１　 第 ４期 费俊杰等：树脂固定化 β 半乳糖苷酶制备低聚半乳糖
＼ ＼ＤＺ１９ ＼Ｄ ＼孙桂云 ＼生物加工 ２０１５ ＼第 ４期 ＼第 ４期．ＰＳ　 ４校样　 排版：孙桂云　 修改日期：２０１５ ／ ０７ ／ ０８
图 １　 戊二醛体积分数对酶固定化的影响
Ｆｉｇ􀆰 １　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ ｖｏｌｕｍｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
ｏｎ ｅｎｚｙｍｅ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ
２􀆰 ２􀆰 ３　 温度对酶固定化的影响
离子交换反应需要一定的活化能，温度的升高
有利于交换速度的提高，影响分子热运动的速度，
但温度过高会导致蛋白质的变性而失活，因此多种
因素决定了温度对酶的固定化过程的影响，综上固
定化乳糖酶存在一个最适温度范围。
按实验方法 １􀆰 ２􀆰 ２ 节处理后的乳糖酶（戊二醛
体积分数 ４％），在不同温度下交联 ６ ｈ，研究不同温
度对固定化酶回收率和固定化酶活的影响，结果见
图 ２。
图 ２　 温度对酶固定化的影响
Ｆｉｇ􀆰 ２　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｎ ｅｎｚｙｍｅ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ
由图 ２可知：在 ４０ ℃时固定化酶回收率和固定
化酶活最大，固定化温度在 ３０～５０ ℃时固定化回收
率为 ３９􀆰 １％和固定化酶活为 １６􀆰 ２ Ｕ，且变化不大。
酶蛋白在树脂上的吸附是一个吸热过程，在温度较
低时，酶不容易吸附到树脂上，随着固定化温度的
升高，分子运动逐渐加剧，载体对酶的吸附量也会
有所提高。 当温度超过 ５０ ℃，固定化酶回收率和固
定化酶活会降低且变化幅度很大，是由于温度过
高，导致戊二醛对酶变性作用过强，而且酶蛋白在
较高的温度下容易变性失活。 综上，最佳固定化温
度选择为 ４０ ℃。
２􀆰 ３　 固定化乳糖酶性质的研究
２􀆰 ３􀆰 １　 ｐＨ对乳糖酶酶活的影响
在 ０􀆰 ２ ｍｏｌ ／ Ｌ磷酸缓冲盐体系下（含 １􀆰 ５ ｍｍｏｌ ／ Ｌ
的 ＭｇＣｌ２），在温度 ４０ ℃条件下，分别测固定化酶与
游离酶相对酶活，结果见图 ３。
图 ３　 ｐＨ对 β Ｄ 半乳糖苷酶活性的影响
Ｆｉｇ􀆰 ３　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｐＨ ｏｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ β⁃Ｄ⁃ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ
由图 ３可知：ｐＨ为 ５􀆰 ０ ～ ８􀆰 ３ 时，乳糖酶游离状
态下最适 ｐＨ为 ６􀆰 ２，乳糖酶固定在 Ｉ００２ 树脂上后，
ｐＨ为 ６􀆰 ２～７􀆰 ４时，酶活性很稳定，即使在酸性条件
下，酶的相对活力都比游离酶活高，这表明通过结
合在载体后，酶分子稳定性得到了提高［７－８］。 这是
因为酶固定过程中与载体多位点结合［９－１０］，构象更
加稳定，减弱了外部溶液变化对酶分子构象的影响。
２􀆰 ３􀆰 ２　 温度对乳糖酶酶活的影响
在 ０􀆰 ２ ｍｏｌ ／ Ｌ磷酸缓冲盐体系下（含 １􀆰 ５ ｍｍｏｌ ／ Ｌ
的 ＭｇＣｌ２），ｐＨ为 ６􀆰 ５ 条件下考察温度对游离酶和
固定化酶的影响，结果见图 ４。
图 ４　 温度对 β Ｄ 半乳糖苷酶活性的影响
Ｆｉｇ􀆰 ４　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ
ｏｆ β⁃Ｄ⁃ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ
由图 ４ 可知：乳糖酶游离状态下的适合温度为
４０ ℃，乳糖酶固定在 Ｉ００２ 树脂上后，温度在 ３０ ～ ５０
℃时相对酶活都较高。 这表明通过载体的结合，酶
分子稳定性得到了提高。 可能是因为酶分子结构
刚性增强，所以不易折叠变性。
０２ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷　
＼ ＼ＤＺ１９ ＼Ｄ ＼孙桂云 ＼生物加工 ２０１５ ＼第 ４期 ＼第 ４期．ＰＳ　 ４校样　 排版：孙桂云　 修改日期：２０１５ ／ ０７ ／ ０８
２􀆰 ３􀆰 ３　 固定化的转苷反应结果
Ｉ００２树脂固定 β 半乳糖苷酶，乳糖 ２５０ ｇ ／ Ｌ，
ｐＨ ６􀆰 ５，比酶活为 ３ Ｕ ／ ｍＬ，在磷酸缓冲体系中 ４０ ℃
条件下进行酶解反应，测定产物含量，在转苷反应
形成 ＧＯＳ 过程中，各个产物生成量与反应时间的关
系见图 ５。
图 ５　 反应生成物浓度与时间之间的关系
Ｆｉｇ􀆰 ５　 Ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｏｆ ｐｒｏｄｕｃｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
ａｎｄ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ
由图 ５可以看出，当反应时间低于 ６０ ｍｉｎ 时，
ＧＯＳ的生成量急剧增加，三糖的合成速率远远高于
其他糖的合成速率；当反应超过 １２０ ｍｉｎ，三糖、四糖
的生成量趋于稳定，但葡萄糖和半乳糖的量持续增
加；尽管反应至 ２４０ ｍｉｎ 时， ＧＯＳ 含量达到最大
（６０􀆰 ５ ｇ ／ Ｌ），相对乳糖的收率为 ２４􀆰 ２％，但是自从反
应超过 １２０ ｍｉｎ，ＧＯＳ 的生成量增加不明显，因此，
为了提高 ＧＯＳ的生产效率，确定 ６０ ｍｉｎ为合适的反
应时间。
２􀆰 ３􀆰 ４　 固定化酶反应的稳定性
固定化乳糖酶在 ｐＨ ６􀆰 ５和 ４０ ℃的条件下连续
操作 ９ 次，每次操作后测定固定化酶活，结果见
图 ６。
图 ６　 固定化酶的操作稳定性
Ｆｉｇ􀆰 ６　 Ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｅｎｚｙｍｅ
由图 ６ 可知：固定化酶的相对活性随反应次数
的增加而逐渐降低，酶活的降低可能有两方面原
因，一方面是固定化酶在进行连续反应过程中，长
时间机械搅拌会导致部分乳糖酶的失活；另一方面
在重复回收的过程中可能会有一些人为的损失。
但结果表明：固定化乳糖酶重复使用 ９ 次后仍保留
了较高的活性， β 半乳糖苷酶的相对活力仍为
７５％，可见固定化乳糖酶具有良好的反应连续性和
稳定性。
２􀆰 ３􀆰 ５　 固定化酶的储存稳定性
考察乳糖酶在固定化和游离状态下，在 ５ ℃冰
箱内的储存稳定性是衡量其商业化应用的重要指
标。 将固定化乳糖酶和游离乳糖酶置于 ５ ℃冰箱内
保存，每隔一段时间去测定乳糖酶活力，其酶活变
化情况见图 ７。
图 ７　 乳糖酶的储存稳定性
Ｆｉｇ􀆰 ７　 Ｓｔｏｒａｇｅ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ β⁃Ｄ⁃ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ
由图 ７可知：固定化乳糖酶储存 ９０ ｄ，其酶活力
保持在 ８９％，而游离酶保持在 ７７％。 与游离酶相
比，固定化酶在 ５ ℃储存时稳定性增强，这可能是由
于酶的固定化降低了蛋白酶对乳糖酶的降解能力。
酶的低温贮存稳定性增强，可进一步提高酶的应用
价值，为固定化酶的实际应用提供了有利的数据
参考。
３　 结论
选择 ６种离子交换树脂进行固定化吸附率和回
收率的比较实验，并对吸附率和回收率最高的 Ｉ００２
树脂进行吸附交联固定化，用戊二醛作为交联剂。
处理后的 １ ｇ 离子交换树脂 Ｉ００２ 加入用 ｐＨ ６􀆰 ５、
０􀆰 ２ ｍｏｌ ／ Ｌ磷酸缓冲液稀释的酶液，加酶量经测定
为 ５１􀆰 ８ Ｕ ／ ｇ（以 １ ｇ树脂计），在 ２５ ℃吸附 １２ ｈ后，
加入体积分数 ４％的戊二醛，在 ４０ ℃条件下交联 ６
ｈ，最终获得的固定化酶活为 １６􀆰 ２ Ｕ，固定化酶回收
率为 ３９􀆰 １％。 并且利用固定后的树脂在比酶活为 ３
Ｕ ／ ｍＬ（磷酸缓冲盐溶液），ｐＨ 为 ６􀆰 ５，温度为 ４０ ℃
１２　 第 ４期 费俊杰等：树脂固定化 β 半乳糖苷酶制备低聚半乳糖
＼ ＼ＤＺ１９ ＼Ｄ ＼孙桂云 ＼生物加工 ２０１５ ＼第 ４期 ＼第 ４期．ＰＳ　 ４校样　 排版：孙桂云　 修改日期：２０１５ ／ ０７ ／ ０８
条件下进行酶解反应，得到 ＧＯＳ产率为 ２４􀆰 ２％。
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（责任编辑　 荀志金）
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［２０］ 　 Ｘｕｅ Ｘ Ｄ， Ｌｉ Ｗ， Ｌｉ Ｚ Ｍ， ｅｔ ａｌ． Ｅｎｈａｎｃｅｄ １， ３⁃ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏｌ
ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｓｕｐｐｌｙ ｏｆ ｏｒｇａｎｉｃ ａｃｉｄｓ ａｎｄ ｒｅｐｅａｔｅｄ ｆｅｄｂａｔｃｈ
ｃｕｌｔｕｒｅ［Ｊ］ ．Ｊ Ｉｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０１０，３７（７）：６８１⁃６８７．
（责任编辑　 荀志金）
２２ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷　
＼ ＼ＤＺ１９ ＼Ｄ ＼孙桂云 ＼生物加工 ２０１５ ＼第 ４期 ＼第 ４期．ＰＳ　 ４校样　 排版：孙桂云　 修改日期：２０１５ ／ ０７ ／ ０８