全 文 ：第 ! 卷第 # 期
$%&% 年 && 月
生"物"加"工"过"程
*cF/3! 8F3#
8FM3$%&%
DFC"&%37#7 ,^3C11L3$ ?#6!3$%&%3%#3%%&
收稿日期"$%&% ?%# ?$!
基金项目"国家高技术研究发展计划 $ !# 计划% 资助项目 $ $%%#..%$%$%0 %&国家重点基础研究发展计划 $ 76 计划% 资助项目
$$%%6*` 6%6!%&%&南京林业大学高学历人才基金项目$&#%%%0%%
作者简介"李"鑫$&76(%#男#辽宁大连人#博士#讲师#研究方向"生物化工#Z-J@C/"bCL3/HHeAFJ
米根霉利用纯糖和不同预处理玉米秸秆
酶解糖生产 ! 乳酸
李"鑫#马"瑞#赵晗璐#欧阳嘉#徐"勇#勇"强
$南京林业大学 林木遗传与生物技术省部共建教育部重点实验室#南京 $&%%6%
摘"要"通过单因素实验设计#优化米根霉摇瓶发酵产 ! 乳酸( 在此基础上#以蒸气爆破和碱处理玉米秸秆酶解
液为混合*源#与纯糖对比#研究不同预处理玉米秸秆混合*源对米根霉发酵产 ! 乳酸的影响( 结果显示"在初
始葡萄糖质量浓度 &%% X,N)$8S
0
%
$
]+
0
质量浓度 $ X,N)接种量 #f$体积分数%)转速 &6% E,JCL)发酵 &$ <后添加
% X,N*@*+

的条件下#米根霉发酵产 ! 乳酸质量浓度为 #7g&( X,N( 米根霉发酵不同预处理玉米秸秆酶解混合
*源#木糖的存在影响了米根霉的*代谢网络#降低 ! 乳酸的产量(
关键词"玉米秸秆&水解物&! 乳酸&米根霉&木糖
中图分类号"59($3!""""文献标志码".""""文章编号"$ ?#6!$$%&%%%# ?%%%& ?%(
!H65:F.:5:.G942G3:0G742I:54J2-KG45F05/G0/LKI5F.:-KG426KL5F027
G.77040/F940F405F0G:24/1F2A041JK "#$%&()&*+%,-
NOPCL#Q.4GC#RS.+S@L-/G#+TU.8VWC@#PTUFLX#U+8V9C@LX
$)HKN@:FE@BFEKFIYFEH1BVHLHBCA1h C`FBHA*J1F45:F"YHEJHLB@BCFL AFLDCBCFL1IFE2EFDGABCFL FI!-/@ABCA@ACD :K345(6/-(&*5#,_HEHF2BCJC;HD CL
1CLX/H-I@ABFEHb2HECJHLB13*FJ2@EHD _CB< A@E:FG1CLXBBHD AFEL 1BFMHE135X,N#$8S
0
%
$
]+
0
$ X,N#CLFAG/GJ#f $M,M%#&6% E,JCL# @LD @DDCLX% X,N*@*+

@IBHE&$ < IHEJHL-
B@BCFL35A@E:FL 1FGEAH1<@D @LHX@BCMHHIHABFL 2EFDGABCFL FI!-/@ABCA@ACD :KA@E:FL I/GbEHDC1BEC:GBCFL3
M0K N24G1"AFEL 1BFMHE&""! 乳酸$$ 羟基丙酸%是一种重要的生物化工
产品#广泛应用于食品)医药)化工)制革)纺织)环
保等领域*&+ ( ! 乳酸具有良好的生物相容性#且对
人体无毒#特别是近年来以 ! 乳酸为原料生产的聚
乳酸具备优越的生物可降解性#可减少化石资源消
耗*$+ #! 乳酸未来的市场前景十分广阔(
""目前#! 乳酸的生产菌种为细菌和根霉 $ 类#
主要生产原料依赖于葡萄糖和淀粉等粮食基原
料*+ ( 在粮食日益短缺的今天#以粮食原料大规模
生产 ! 乳酸#必然存在与人争粮的现象( 因此#开
发基于木质纤维素的 ! 乳酸生产技术势在必行(
以米根霉8NP Q && 为研究对象#以葡萄糖为 *
源#进行单因素实验优化#确定! 乳酸摇瓶培养条
件( 在此基础上#对比纯糖)蒸气爆破和碱处理玉
米秸秆酶解糖为混合*源的 ! 乳酸生产(
D?材料与方法
D=D?材料
""米根霉 8NP Q &&#南京林业大学生物化工
研究所保藏&玉米秸秆蒸气爆破酶解液和碱处理
酶解液#南京林业大学生物化工研究所自制&! 乳
酸标准品购自 ]CXJ@公司#其他试剂均为市售分
析纯(
D=B?培养基
&3$3&"斜面培养基$X,N%
""马铃薯 $%%#葡萄糖 $%#琼脂 &( i$%( 自然 2S(
&3$3$"发酵培养基$X,N%
""葡萄糖&%%#$8S
0
%
$
]+
0
$#)S
$
=+
0
%g#QX]+
0
!6S
$
+
%g6(#RL]+
0
!6S
$
+%g$( *@*+

&g( X,瓶$单独灭菌%(
自然 2S(
D=O?培养方法
&33&"斜面培养
""$! j#培养 ( i6 D(
&33$"摇瓶培养
""取一支新鲜的斜面菌种#加入一定量的无菌
水#制成孢子悬浊液$每 JN&%6个孢子%#按一定接
种量接种于装有 (% JN发酵培养基的 $(% JN三角
瓶中#添加一定量的 *@*+

#置于 $! j)&6% E,JCL
摇床中培养 6$ i&$% <(
D=P?分析方法
""高效液相色谱方法" C`F-4@D .JCLHbS=P !6S
色谱柱#流动相 ( JJF/,NS
$
]+
0
#流速 %g# JN,JCL#
柱温 (( j#示差折光检测器#进样量 &%
#
N(
B?结果与讨论
B=D?发酵培养基的优化
$3&3&"初始葡萄糖质量浓度对 ! 乳酸发酵的影响
""在 #% i&!% X,N葡萄糖质量浓度范围内#研究
葡萄糖对米根霉生产 ! 乳酸的影响#结果如图 &
所示(
""从图 & 可以看出"! 乳酸的产量随着初始葡萄
糖质量浓度的升高而升高( 当葡萄糖质量浓度达
到 &%% X,N时#糖酸转化率达到最大值#说明此时葡
图 D?初始葡萄糖质量浓度对! 乳酸发酵的影响
Q.;=D?#70:F127./.F.56;63:210:2/:0/F45F.2/2/
942G3:F.2/27!H65:F.:5:.G
萄糖较好地被利用&此后#进一步增加葡萄糖质量
浓度#! 乳酸的产量趋于平稳#糖酸转化率明显下
降#说明米根霉无法将多余的葡萄糖较好地转化为
! 乳酸( 葡萄糖是 *源中最易为微生物所利用的
糖#但是过多的葡萄糖会加速菌体的呼吸#导致培
养基中的溶氧不能满足菌体需求#使某些代谢中间
产物不能完全氧化#积累在菌体或培养基中#影响
某些酶活性#从而抑制菌体生长和产物合成*0+ ( 综
合考虑 ! 乳酸的产量和糖酸转化率#选用初始葡萄
糖质量浓度为 &%% X,N(
$3&3$"$8S
0
%
$
]+
0
质量浓度对 ! 乳酸发酵的影响
""米根霉可以利用多种8源#对8源要求低#选择
$8S
0
%
$
]+
0
为8源( 基于发酵培养基#设定$8S
0
%
$
]+
0
质量浓度在 & i( X,N范围内#研究$8S
0
%
$
]+
0
对
! 乳酸发酵的影响#结果如图 $ 所示(
图 B?$$"
P
%
B
!+
P
质量浓度对! 乳酸发酵的影响
Q.;=B?#70:F1275II2/.3I1369-5F0:2/:0/F45F.2/2/
942G3:F.2/27!H65:F.:5:.G
""从图 $ 可以看出"当加入$8S
0
%
$
]+
0
质量浓度
为 $ X,N时#! 乳酸质量浓度和糖酸转化率达到最
大值( 8源的质量浓度对微生物的菌体生长和产物
产量有较大的影响( 8源不足会使菌体生长缓慢或
$ 生"物"加"工"过"程"" 第 ! 卷"
产物产量过低&而 8源质量浓度过高#又会造成菌
体快速生长#消耗过多的糖#使产物浓度很低*( ?6+ (
因此#确定$8S
0
%
$
]+
0
的质量浓度为$ X,N(
B=B?发酵培养条件的确定
$3$3&"*@*+

的添加量及添加时间对 ! 乳酸发酵
的影响
""米根霉产乳酸过程中#发酵液的 2S不断降低#
会抑制微生物的生长和乳酸的积累#因此必须添加
中和剂调节发酵液 2S*+ ( 常用的中和剂有
*@$+S%
$
)*@*+

)8@
$
*+

)氨水)8@+S等*!+ ( 徐国
谦等*7+对比了氨水)8@+S和 *@*+

调控 ! 乳酸发
酵过程的 2S#对于间歇分批发酵#*@*+

是一种较
好的中和剂( 因此#选择添加 *@*+

的方式调控
2S( 基于发酵培养基#研究在 % i#% X,N范围内#添
加时间为发酵后 % i% <#*@*+

加入量对! 乳酸发
酵的影响#结果如图 和图 0 所示(
图 O?,5,+
O
添加量对! 乳酸发酵的影响
Q.;=O?#70:F127:56:.3I:54J2/5F0:2/:0/F45F.2/2/
942G3:F.2/27!H65:F.:5:.G
图 P?,5,+
O
的添加时间对! 乳酸发酵的影响
Q.;=P?#70:F127F-05GG./; F.I027:56:.3I
:54J2/5F02/942G3:F.2/27!H65:F.:5:.G
""从图 可知"*@*+

的添加量对 ! 乳酸的产量
有较大影响( 当*@*+

的添加量为 % X,N时#! 乳
酸质量浓度和糖酸转化率达到最大值( 进一步增
加*@*+

的加入量#对 ! 乳酸的生成和糖酸转化率
无较大影响( 因此#! 乳酸发酵过程中 *@*+

的添
加量为 % X,N(
""发酵过程中#由于乳酸的不断积累#溶液 2S降
低#加入*@*+

不仅可以调节 2S#而且还与乳酸反
应生成乳酸钙#可以降低产物抑制作用#增加乳酸
产量( 选择不同的*@*+

添加时间#对 ! 乳酸发酵
有较大影响( 从图 0 可以看出"米根霉发酵 &$ < 时
添加*@*+

#! 乳酸的质量浓度和糖酸转化率达到
最大值( 因此#选择在米根霉发酵 &$ < 添加 % X,N
的*@*+

( 另外#发酵液中 *@$k通过作用于细胞中
的钙调素参与菌丝顶端生长的极性和菌丝分支形
成的控制#*@$k还与细胞原生质膜相结合生成新的
A.Q=结合位点而强化糖降解过程*&%+ (
$3$3$"接种量对 ! 乳酸发酵的影响
""接种量是由发酵时菌体生长繁殖的速度决定
的#通常较大的接种量可以缩短生长周期#使产物
合成提前#但如果接种量过大则可能使菌种生长过
快#溶氧量不足#从而影响产物的合成*&&+ ( 研究接
种量在 0f i$$f范围内对 ! 乳酸发酵的影响#结
果如图 ( 所示(
图 R?接种量对! 乳酸发酵的影响
Q.;=R?#70:F127./2:363I2/942G3:F.2/27
!H65:F.:5:.G
""从图 ( 可以看出"接种量为 #f时#! 乳酸的产
量和糖酸转化率达到最大值( 进一步增加接种量#
缩短延迟期时间#菌体进入快速生长期#菌体大量
繁殖#自身消耗大量葡萄糖#产生过多的代谢废物#
抑制 ! 乳酸的形成*&$+ ( 因此#选定米根霉发酵
! 乳酸的接种量为 #f(
$3$3"转速对 ! 乳酸发酵的影响
""摇床转速主要影响发酵过程中的通气量( 此
外#米根霉本身菌丝体较长#生长过程中较易结块#
而由于发酵过程中又加入了 *@*+

#会使米根霉结
"第 # 期 李"鑫等"米根霉利用纯糖和不同预处理玉米秸秆酶解糖生产 ! 乳酸
块现象变得严重#提高转速有利于形成分散的菌
落#从而提高乳酸产量*&%+ ( 基于发酵培养基#研究
!% i%% E,JCL转速对 ! 乳酸发酵的影响#结果如
图 # 所示(
图 @?转速对! 乳酸发酵的影响
Q.;=@?#70:F12742F5F.2/1900G2/942G3:F.2/27
!H65:F.:5:.G
""从图 # 可以看出"随着转速的提高#! 乳酸的
质量浓度和糖酸转化率随之升高( 当转速超过 &6%
E,JCL#! 乳酸质量浓度和糖酸转化率趋于平稳(
因此#米根霉发酵产 ! 乳酸选定转速为 &6% E,JCL(
B=O?,源对! 乳酸发酵的影响
""! 乳酸发酵采用的 *源主要以葡萄糖和淀粉
为主*#&+ ( 为了降低 ! 乳酸发酵对粮食的依赖和
和生产成本#利用大量低廉的木质纤维素资源作为
*源( 很多研究探索玉米芯*&0 ?&(+ )小麦秸秆*&#+等
*源发酵生产乳酸#而以玉米秸秆为 *源的研究较
少( 以玉米秸秆为原料#通过蒸气爆破和碱处理
后#经纤维素酶水解得到相应的混合 *源( 基于优
化发酵条件#利用米根霉生产 ! 乳酸#研究葡萄糖)
蒸气爆破和碱处理的酶解混合 *源对! 乳酸发酵
的影响$发酵 6$ <%#结果如表 & 所示(
表 D?米根霉利用,源发酵生产! 乳酸
E5J60D?S42G3:F.2/27!H65:F.:5:.G31./; :54J2/1234:01JK "#$%&()&*+%,- ;"T
UD
*源
"
$葡萄糖%
"
$葡萄糖残糖%
"
$木糖%
"
$木糖残糖%
"
$! 乳酸%
葡萄糖 &%%g%% % % % #7g&(
蒸气爆破酶解液 7(g%% &g0 &&g%% &%g#! $&g0$
碱处理酶解液 &%%g%% !(g&6 6g%% g#& #g7#
""从表 &可以看出"葡萄糖是米根霉生产 ! 乳酸
的最适*源#玉米秸秆蒸气爆酶解液*源次之#玉米
秸秆碱处理酶解液最差( 同时#随着培养基中木糖质
量浓度的增加#! 乳酸的质量浓度呈现明显下降趋
势#且木糖质量浓度越大#! 乳酸产量越低( cC@/K
等*&#+认为发酵液中木糖的存在对 ! 乳酸生产有着
负面的影响( 玉米秸秆经预处理后#会产生一些发酵
抑制物#如糠醛)羟甲基糠醛)甲酸)乙酸*&6+ ( 但在本
研究中#彻底清洗预处理原料后#再进行酶水解#由此
降低了原料中发酵抑制物对米根霉的影响( 因此#木
糖的存在改变了米根霉的*代谢网络(
B=P?混合,源中木糖对! 乳酸发酵的影响
""为了进一步验证混合 *源中木糖对 ! 乳酸发
酵的影响#在 &%% X,N纯葡萄糖培养基中#添加 $% i
#% X,N木糖#并延长发酵时间#研究木糖存在对米
根霉发酵的影响#结果如表 $ 所示(
表 B?混合,源中木糖对! 乳酸发酵的影响
E5J60B?#70:F127VK6210./I.V0G:54J2/1234:012/942G3:F.2/27!H65:F.:5:.G??? ;"T
UD
"
$葡萄糖%
"
$木糖%
6$ < &$% <
"
$! 乳酸%
"
$富马酸%
"
$木糖%
"
$! 乳酸%
"
$富马酸%
"
$木糖%
&%% % (!g$ g%& % #&g#$ $g7( %
&%% (% !g$0 $g$( &(g6& &&g7 0g%0 6g00
&%% $% (6g67 g!$ &6g66 (!g0# g! &#g$&
&%% % (0g7( 0g%( $#g6 (6g&% (g%0 $0g#0
&%% 0% (0g( 0g0( 0g7& ((g$& (g! %g#6
&%% (% (%g#6 (g$6 0(g7! (%g!0 #g0& !g!#
&%% #% 06g7& (g$ (&g## 0!g(0 #g($ 00g#&
""所有的*源经米根霉 6$ <发酵后#葡萄糖残糖
质量浓度均为 %( 从表 $ 可以看出"米根霉发酵主
要产物为 ! 乳酸和富马酸( 通过单一的葡萄糖和
木糖发酵结果对比可以发现"木糖的代谢明显慢于
0 生"物"加"工"过"程"" 第 ! 卷"
葡萄糖#这是因为木糖的代谢必须诱导产生木糖还
原酶和木糖醇脱氢酶#经两步还原和氧化反应生成
木酮糖#进而通过戊糖磷酸途径#再经糖酵解途径
生成丙酮酸*&!+ ( 葡萄糖培养基中逐渐增加的木糖
质量浓度#并没有对 ! 乳酸的生成量作出贡献( 相
反的#无论米根霉发酵 6$ <或 &$% <#! 乳酸的生成
量都随木糖质量浓度的增加而降低#同时#富马酸
的生成量却随木糖质量浓度的增加而增加( 表 $ 的
研究结果进一步证明混合 *源中木糖的存在改变
了米根霉中*代谢网络(
O?结?论
""&%优化的米根霉摇瓶发酵条件"初始葡萄糖质
量浓度 &%% X,N#$8S
0
%
$
]+
0
质量浓度 $ X,N#米根霉
发酵 &$ < 后添加 % X,N*@*+

#接种量 #f#转速
&6% E,JCL( 在优化条件下#米根霉发酵产 ! 乳酸
质量浓度为 #7g&( X,N(
""$%玉米秸秆不同预处理的酶水解混合 *源与
纯糖对比#混合*源中的木糖改变了米根霉的 *代
谢网络#降低了 ! 乳酸的生成量(
参考文献"
*&+"钱志良#劳含章#王健#等3工业乳酸发酵的近期进展*W+3生
物加工过程#$%%#&$&%"$-$63
9C@L RCL CLDG1BEC@//@ABCA@ACD 2EFDGABCFL :KJCAEFFEX@LC1J1*W+3*C`F2EFAZLX#$%%#&$&%"$-$63
*$+"张景强#林鹿#孙勇#等3由木质纤维素发酵乳酸制备生物质塑
料的研究进展*W+3云南化工#$%%7##$&%"(6-#&3
R<@LXWCLXdC@LX#NCL NG#]GL UFLX#HB@/34H1H@EA< @DM@LAHFL
B*W+3UGLL@L **+"赵博#周帅#马翠卿#等3乳杆菌 !#+7(9#+$/-123Nb2发酵高产
! 乳酸研究*W+3生物加工过程#$%%(#$0%"60-663
R<@F` F#RBCA@ACD IHEJHLB@BCFL :K@!#+7(9#+$/-123*W+3*ZLX#$%%(#$0%"60-663
*0+"杨子培#成琰如#袁东波#等3玉米淀粉深层发酵生产 ! 乳酸
*W+3食品与发酵工业#&770$(%"&!-$3
U@LXRC2HC#*!-/@ABCA@ACD IEFJAFEL 1B@EA< :K1G:JHEXHD IHEJHLB@BCFL *W+3
YFFD @LD YHEJHLB@BCFL OLDG1BECH1#&770$(%"&!-$3
*(+"于雷#雷霆#裴晓林#等3! 乳酸发酵培养基中氮源的优化
*W+3食品科技#$%%6$#%"07-(3
UG NHC#NHC5CLX#=HCPC@F/CL#HB@/3+2BCJC;@BCFL FILCBEFXHL
1FGEAHCL JHDCGJFI!-/@ABCA@ACD IHEJHLB@BCFL*W+3YFFD ]ACHLAH
@LD 5HA*#+"VF/D:HEXO#]BCHX/CB;B` 3OJ2EFMHD E@BHFIIGJ@ECA@ACD 2EFDGABCFL
:KB_HHL1@LD MHXHB@:/HFC/1CL 345(6/-#&45/-*W+3 C`FBHAC`FHLX#&7!(#$6$6%"&%#6-&%#73
*6+"Q@EXG/CH1Q#cC1FI3456(/-*W+3WFGEL@/FI`@ABHECF/FXK#&7#&#!&"&-73
*!+"蒲洋#丁涓#李静#等3不同中和剂对 ! 乳酸发酵的影响*W+3
安徽农业科学#$%%7#6$&&%"0!!(-0!!!3
=G U@LX#\CLXWG@L#NCWCLX#HB@/3ZIHAB1FIDCIHEHLBLHGBE@/C;HE1
FL !-/@ABCA@ACD IHEJHLB@BCFL *W+3WFGEL@/FI.L]ACHLAH1#$%%7#6$&&%"0!!(-0!!!3
*7+"徐国谦#储炬#王永红#等3不同的中和剂对 !$k% 乳酸发酵的
影响*W+3工业微生物#$%%6#6$0%"&-(3
PG VGFdC@L#*LHGBE@/C;HE1FL !$k%-/@ABCA@ACD IHEJHLB@BCFL*W+3OLDG1BEC@/QC-
AEF:CF/FXK#$%%6#6$0%"&-(3
*&%+ 蒋明珠#吴芷萍#许孟琴#等3! 乳酸发酵的研究*W+3微生物
学报#&77&#&$&%"0&-063
WC@LXQCLX;JHLB@BCFL FI!-/@ABCA@ACD*W+3.AB@QCAEF:CF/FXCA@]CLCA@#&77&#
&$&%"0&-063
*&&+ 闫智慧#高静#周丽亚#等3乳酸的应用与发酵生产工艺*W+3
河北工业大学学报#$%%0#$%"&(-&73
U@L R2EFDGABCFL BHASH:HCTLCMHE1CBKFI5HA*&$+ 陈坚#堵国成#李寅#等3发酵工程实验技术*Q+3北京"化学
工业出版社#$%%3
*&+ SG@LXN=#WCL #`N@LB=3\CEHABIHEJHLB@BCFL FI2FB@BF1B@EA<
_@1BH_@BHEBF/@ABCA@ACD :K345(6/-(&*5#,@LD 345(6/-#&45/-
*W+3 C`F2EFAH11@LD C`F1K1BHJ1ZLXCLHHECLX#$%%(#$6"$$7-$!3
*&0+ 乔长晟#汤凤霞#白雪娟#等3利用纤维素类物质"玉米芯生产
! 乳酸的研究*W+3中国食品学报#$%%###$0%"&%&-&%(3
9C@F*<@LX1!-/@ABCA@ACD 2EFDGABCFL IEFJAH/G/F1H-AFELAF:*W+3W*YFFD ]AC5HA*&(+ 陈育如#夏黎明#岑沛霖3一株乳杆菌对蒸汽爆破处理纤维物
料的乳酸发酵研究*W+3生物加工过程#$%%#&$$%"$#-$73
*B@BCFL _CB< @1BE@CL !#+7(9#+$/-123G1CLX1BH@JHb2/F1CFL 2EH-
BEH@BJHLB/CXLFAH/G/F1HJ@BHEC@/*W+3*$$%"$#-$73
*&#+ cC@/KV#Q@EA<@/4#VGC/:HEB83!$k%-/@AB@BH2EFDGABCFL IEFJA@E-
:F0g66*W+3[FE/D WFIQCAEF: C`FBHA*&6+ R@/DCM@EW#8CH/1HL W#+/11FL N3YGH/HB<@LF/2EFDGABCFL IEFJ/CXLF-
AH/G/F1H"@A<@/HLXHIFEJHB@:F/CAHLXCLHHECLX@LD 2EFAH11CLBH-
XE@BCFL*W+3.22/QCAEF:C` CFBHA*&!+ Q@@14S[#]2ECLXHEW#ZXXCLa V#HB@/3PK/F1HJHB@:F/C1JCL BIGLXG1345(6/-(&*5#,"HIHABFIXEF_B< @LD EH12CE@BCFL FL !$k%-
/@ABCA@ACD 2EFDGABCFL*W+3WFGEL@/FIOLDG1BEC@/QCAEF:CF/FXK@LD
C`FBHA("第 # 期 李"鑫等"米根霉利用纯糖和不同预处理玉米秸秆酶解糖生产 ! 乳酸