全 文 ：第5卷第3鬟
猢7年8月
生粒加工过程
ChineseJournalofBioproeess嚣ngineering
众娃g．20孵
· 27·
粘红酵母和钝顶螺旋藻混合培养生产
微生物油脂培养基优化
苗金鑫，薛飞燕，张 栩，谭天伟
(北京化工大学 生命科学与技术学院，北京市生物加工过程重点实验室，北京100029)
攮要：通过单霞素实验和正交实验对粘红酵母和辘矮螺旋藻混合壤莽鼹培养基遗行了忧化，得或盼优化培养基
于5L发酵罐中实验，葡萄耱囊蚤浓度低于10．O∥L时，开始流加6∞∥L蔫蓠耱，控镧蓊萄糖质量浓度在(翰±5)
g／L，最终得到的油脂产量达到16．0∥L。
关键词：粘红酵母；钝项螺旋藻；微生物油脂；混合培养；正交实验
中图分类号：TQ517．2 文献标识码：A 文章编号：1672—3678(2007》03—0027一05
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福立分析仪器有限公司)，离心机(Eppendoff公
司)，漩涡混匀器(ScientificIndustries公司)。
1．3实验方法
1．3．1酶促转酯化合成生物柴油
在50mL具塞锥形瓶中，加入4．585g大豆油
和适量甲醇混合物，并置于可自动控温的摇床中，
加热至一定温度后，加入一定量的脂肪酶开始反
应，定时取出反应液，用于甲酯含量分析。将所取
的100IxL反应液离心分层，取上层液样5止，用
295 IxL正己烷溶解，加入300txL内标物(十七碳酸
甲酯正己烷溶液)，混匀，取1IxL样品进样。
1．3．2油脂完全甲酯化方法
取油样两滴，置于10mL具塞试管中，加入0．5
mol／LKOH—CH，OH溶液2mL，在75℃水浴中皂
化15 min，待油滴溶解后，放冷；加入15％BF，一
CH，OH溶液2mL，在75℃水浴中皂化2min，放冷；
加入正己烷2mL，振荡；加入饱和NaCl溶液2mL，
取上清液进行气相色谱分析。
1．3．3气相色谱分析
使用 GC一9790气相色谱仪，安捷伦-INNOWAX
毛细管柱(30m×0．25mmX0．25Ixm)，载气N2。柱
前压 0．1MPa，采用程序升温，柱温200℃，维持2
min后以3℃／min的速率升到235oC，再维持该温
度1min。FID检测器，气化室温度240℃，检测器
温度 280℃。
1． 3．4 生物柴油转化率的测定
万方数据
· 28· 生物加工过程 第5卷第3期
产漓脂麴微生物主要有霉菌、细菌、酵母穗藻类
等"]。而利用两种微生物混合培养生产油脂的研
究鲜见报道，本文探讨了粘红酵母和钝顶螺旋藻混
合培养生产淀脂的最佳条件。
l材料与方法
1．1 菌种
粘红酵母(霆磊。幻据阮如g勉in蠡)由中国食最发
酵所提供，钝顶螺旋藻(却im菇珏。p溉8燃嚣)由中国科
学院过程工程研究所提供。
l。2培养基
1．2．1螺旋藻种子培养基
NaHC0316．8g／L；K2HP040．5∥L；NaN032．5
g／L；NaCll。O∥毛；艇毋04·7鞋200。2∥￡；K2S04
1．Og／L；FeS04·7|{2O10m∥L；E捌隐80m∥L；
CaCl24m∥L；H38032．86m∥L；(NH4)6M070拟
0。。2m∥毛；鹾壬lCl2·4珏20l。8m∥￡；C毛王S瓯-5嚣20
0．125m∥L；ZnS04·7H200．22mg／L；
1。2．2粘红酵母种子培养基
葡萄糖4％；酵母粉0．15％；(N嚣4)2S哦o。2％；
KH2P040．7％；Na2S04O．2％；MgS04·7H2O
O．15％；初始pH德用O．1m彬LKOH调节到5．5；
{。2。3混合培养基
K2HP040．5g／L，KH2p047 g／L，MgS04·7H20
1．5∥L，K2S040．5∥L，Na2S04l∥L，NaCll g／L，
薹套S04·7疆2010￡珏∥￡；嚣9鞑S0I狂∥L；CaCl2
4mg／L；H3B032．86mg／L；(NH4)6M07024
O。02m∥己；MnCl2·4H20l。8m∥L；CuS啦·5H20
O．125m∥毛；Z魏S04·7H200．22H影￡；碳源和氮源
在不同实验中有所改变。
1．2．4发酵罐培养基
麓拶04·7H201．5∥L；＆疆静40．5∥毛；
KH2P047．0∥L；NaS041．O∥L；K2S041．0g／L；
NaCll。O∥L；NaN032．O∥L；(NH4)2S042。O∥b；
脲2．o∥L；大豆蛋白胨lO．0∥L；酵母粉6．O∥L；
葡萄糖80．0g／L；糖蜜5．Og／L；FeS0。·7H20
lOm∥L；EDTA80m∥L；C8C124m∥乙；醚3B03
2．86m∥L；(NH4)6M07024O．02m∥L；MnCl2·
4H201．80m∥L；CuS04·5H200．125mg／L；ZnS04·
7珏200。22强∥L。
1．3分析方法
菌体细胞质量浓度测定采用于重法。取40mL
瀚发酵液离心收集蔼俸，洗涤2次，在∞℃下恒温
干燥至恒重称取干菌体质量。
油脂产量测定采用氯仿甲醇法口J。
葡萄糖浓度由sBA40C生物传感分柝仪(豳东
省科学院生物研究所)测得。
1．4摇瓶培养
250mL三角瓶装液_：墓为50mL(根据不同实验
要求培养基成分不同)，接种10％对数生长期的菌
体，在冷冻恒温振荡器(太仓市实验设备厂，型号
D壬{z—DA)中培养(30℃，140r／min，2000lx)。
1．5发酵罐培养
5己发酵罐(Biote蘸o002，上海保兴)中装液量
3L，两种微生物的接种量均为10％，搅拌转速为
300r／min，通气量为2L／min，温度控制在30℃，
2结果与讨论
2，l不霹碳源的影晌
分别选取无机碳源：碳酸氢钠、醋酸钠；有机碳
源：葡萄糖、木糖、麦芽糖、蔗糖，糖蜜单独培养粘红
酵母秘螺旋藻(图1)，保持粘红酵母程螺旋藻的氮
源浓度和碳氮比与各自种子培养耱相同。螺旋藻
对无机碳和有机碳都可以很好地利用。各种碳源
对螺旋藻的缨脆质量浓发影嚷差别不大，碳酸氢镳
和葡萄糖对螺旋藻细胞生长和油脂合成都很有利，
得到相对较高的油脂产量，分别为O。20g／L和O。08
∥毛。牯红酵母基本不能利用无视碳生长，当碳酸
氢钠或醋酸钠为碳源时，粘红酵母的细胞质量浓度
不到1．00g／L，远低于以有机碳为碳源培养的水平。
糖蜜和葡萄糖对粘红酵母细胞生长和油脂合成均
有利，得到相对较高的油脂产量，分别为0．14g／L
和0．06∥L。综合考虑，在以上7种碳源中，葡萄糖
对两种微生物浦脂产量的提高都有利，碳酸氢钠利
于螺旋藻油脂产量，但成本较高，在工业生产中可
以用CO。取代，而糖蜜为糖厂发酵凌水，成本较低。
因此，在混合培养中考虑选取糖蜜和葡萄糖为碳源。
．2不同氨源的影响
分另《选取无撬氮源：硫酸铵、氯纯铵、硝酸铵、
硝酸钠、脲和有机氮源：酵母粉和牛肉蛋白胨对粘
红酵母和螺旋藻各自进行单独培养(图2)，保持粘
红酵母穰螺旋藻的碳源浓度帮碳氮毖与各巍种子
培养基相同。3种铵盐对螺旋藻的生长和油脂合成
都很不利，细胞质量浓度均低于0．10g／L，油脂质量
万方数据
2007年8月苗金鑫等：粘红酵母和钝顶螺旋藻混合培养生产微生物油脂培养基优化 ·29·
1一碳酸氢钠；2一醋酸钠；3一葡萄糖；
4一木糖；5一麦芽糖；6一蔗糖；7一糖蜜
图1 不同碳源对2种微生物油脂产量的影响
Fig．1E骶ctofdi虢re越earbonsourceonlipid
productionoftwoIIlicr00rg锄ism8
分数低于1．0％，高浓度的NHf对螺旋藻有毒害作
用∞J。硝酸钠和脲对螺旋藻的细胞生长和油脂合
成最有利，得到的油脂产量分别为15．88g／L和
7．42∥L，远高于其他几种氮源。两种有机氮源对
螺旋藻的生长影响相近，细胞质量浓度均在o．30
g／L左右，而酵母粉更利于油脂的合成。脲和牛肉
蛋白胨对酵母的生长最有利，细胞质量浓度分别为
7．43g／L和9．14g／L，氯化氨和酵母粉则更利于酵
母油脂的合成，油脂质量分数分别为3．07％和
1．40％。因此，在混合培养中可以考虑选取脲、酵母
粉、蛋白胨、硝酸钠和硫酸铵为氮源。
2．3混合培养碳源和氮源的影响
本实验室研究表明，粘红酵母和螺旋藻的混合
培养利于油脂产量的提高(另文发表)。采用L。。
(37)正交表设计对混合培养的碳氮源进行了研究
(表1)。混合培养得到的最低油脂产量也高于两种
微生物单独培养时的油脂产量，证明混合培养利于
l一硫酸铵；2一氯化铵；3一硝酸铵；
4一硝酸钠；5一脲；6一酵母粉；7一牛肉蛋白胨
图2不同氮源对2种微生物油脂产量的影响
Fig．2Effectofdi甜brentni rogensouI℃eon1ipid
pmduction《momicmorganjsms
油脂产量的提高。正交实验得到的最高油脂质量
分数为20．53％。经正交实验优化后的碳氮源种类
和浓度分别为：葡萄糖80g／L，糖蜜5∥L，脲2
∥L，酵母粉6g／L，蛋白胨lo∥L，硝酸钠2∥L，硫
酸氨2g／L。从方差分析表(表2)可以看出：葡萄
糖、蛋白胨、脲和硫酸氨影响显著。进一步在发酵
罐中用优化后的培养基进行实验。
2．4 5L发酵罐混合培养
由图3知，采用5L发酵罐批次发酵，葡萄糖在
56h就几乎被耗尽，质量浓度为4．50∥L。油脂质
量分数在此时达到最高12．9％，在65h细胞质量浓
度达到最高40．80g／L，菌体进入生长稳定期，此后
细胞质量浓度维持在30．0g／L左右，而油脂质量分
数开始下降，说明此时抑制菌体油脂合成的最主要
因素是碳源的不足。所以考虑流加葡萄糖来提高
油脂产量。
万方数据
·30· 生物加工过程 第5卷第3期
表1混合培养碳氮源L。。(37)正交实验
Table1 ThelipidcomentoforthogonalexperimnetsL18(37)ofmiX—cultivation
因素
实验号 p(葡萄糖)／p(糖蜜)／
(g·L_1)(g·L_1)
p(脲)／
(g·L_1)
p酵母粉／
(g·L_1)
p蛋白胨／
(g·L_1)
p硝酸钠／
(g·L_1)
p硫酸氨／
(g·L_1)
叫(油脂)／
％
1
1
4
、
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
均值1
均值2
均值3
10
10
10
40
40
40
80
80
80
10
10
10
40
40
40
80
80
80
8．455
13．776
15．199
3
30
60
3
30
60
，
30
60
，
30
60
30
60
，
30
60
12．566
11．478
13．386
O．5
1．2
0．5
1．2
1．2
1
0．5
0
0．5
1．2
1．2
1
0．5
2
0．5
1．2
11．976
11．618
13．836
极差 6．744 1．908 2．218 1．865 2．719 0．531 2．305
表2混合培养油脂的方差分析结果
T西le2 Thev撕aJlceanalysisoflipidcontentof
mix—cuhivation(理=0．05)
注：+显著性
，
■
●
3
X
曾
导
≮
，
一
●
3
＼
皿删
{L
口皿∞
是
O 20 40 60 80 100
发酵时间／}l
一细胞质量浓度； 一·一油脂产量
——葡萄糖质量浓度；一耳一”(油脂)
、20
70
J
60
s。s115
40岛1 釜
s嘻1m粪
20摇{i
q一5
o J
一10J0
注：搅拌转速300r／min，通气量2I／min温度30qC
图3 混合培养批次发酵对油脂产量的影响
Fig．3Effectofmix—cultivationb ch
fe瑚entationonlipidpmducti6n
弱躬记∞他卯撕踞眇加％舶砸抡∞够巧卵
电&L乏禾丘t互i
n殳&王L禾n龟Z
}1
1
1
l
1
1
l
l
1‘1
1
7
2
2
8
9
5
4
7
l
1
2
5
5
1
2
5
l
2
1
2
5
2
5
1
2
5
1
L王Z
9
6
5
2
6
3
4
7
2
2
4
8
8
2
4
4
8
2
4
8
2
8
2
4
2
4
8
Z
Z互
l
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9缸钙垢
3
6
m
6加3
m
3
6
6加3
3
6
m加3
6㈦n
M∞如码
5
5
3
3
6
0
6
0
3
3
6
O
O
3
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O
3
6
6
0
3
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万方数据
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