全 文 ：第７卷第６期
２００９年１１月
生 物 加 工 过 程
ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｐｒｏｃｅｓｓＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ．７Ｎｏ．６
Ｎｏｖ．２００９
ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１７６２－３６７８．２００９．０６．００６
收稿日期：２００９－０３－３０
基金项目：国家自然科学基金资助项目（３０５７０００４）；安徽农业大学校综合性实验项目
作者简介：张 琛（１９６８—），男，安徽淮南人，讲师，博士研究生，研究方向：生物化学与酶工程，Ｅｍａｉｌ：ｓｗｚｚｃ００１＠１６３．ｃｏｍ
海藻酸钠包埋法制备固定化菠萝蛋白酶
张 琛，张宽朝，章 琛，缪 伟
（安徽农业大学 生命科学学院，合肥 ２３００３６）
摘 要：以海藻酸钠为载体，包埋法固定菠萝蛋白酶，对固定化条件进行优化，同时探讨固定化菠萝蛋白酶的部分
酶学性能。结果表明：固定化菠萝蛋白酶的质量受海藻酸钠质量分数、固定化酶量、固定化时间以及 ＣａＣｌ２质量分
数的影响，其最佳固定化条件为：海藻酸钠质量分数１０％，ＣａＣｌ２质量分数３％，固定化酶液量与海藻酸钠体积之比
１∶２，固定化时间６０ｍｉｎ，在此条件下，制备的固定化菠萝蛋白酶的比活力为２１１８Ｕ／ｇ（湿质量载体），由此制得的
固定化酶的最适ｐＨ为７６，与游离酶相比，升高了０８个ｐＨ单位，同时显示固定化菠萝蛋白酶能耐受较高的碱性
环境，固定化酶最适温度与游离酶相同，均为５０℃，固定化酶在较高温度范围内，仍能保持较高的相对活力。
关键词：海藻酸钠；固定化；菠萝蛋白酶
中图分类号：Ｑ８１４ 文献标志码：Ａ 文章编号：１６７２－３６７８（２００９）０６－００３１－０４
Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎｏｆｂｒｏｍｅｌａｉｎｂｙｅｍｂｅｄｄｉｎｇｉｎｓｏｄｉｕｍａｌｇｉｎａｔｅ
ＺＨＡＮＧＣｈｅｎ，ＺＨＡＮＧＫｕａｎｃｈａｏ，ＺＨＡＮＧＣｈｅｎ，ＭＩＡＯＷｅｉ
（ＣｏｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ，ＡｎｈｕｉＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈｅｆｅｉ２３００３６，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｓｏｄｉｕｍａｌｇｉｎａｔｅｗａｓｕｓｅｄａｓａｃａｒｉｅｒｆｏｒｔｈｅｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎｏｆｂｒｏｍｅｌａｉｎ．Ｔｈｅｏｐｔｉｍｕｍｏｐｅｒａ
ｔｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｗｅｒｅａｓｆｏｌｏｗｓ：ｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｓｏｄｉｕｍａｌｇｉｎａｔｅａｎｄＣａＣｌ２ｓｏｌｕｔｉｏｎｗｅｒｅ１０％ ａｎｄ
３０％，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ；ｔｈｅｒａｔｉｏｏｆｅｎｚｙｍｅｓｏｌｕｔｉｏｎｔｏｓｏｄｉｕｍａｌｇｉｎａｔｅｗａｓ１∶２；ｔｈｅｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎｔｉｍｅ
ｗａｓ６０ｍｉｎ．Ｕｎｄｅｒｔｈｅｓｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，ｔｈｅｏｐｔｉｍｕｍｐＨｏｆｔｈｅｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄｅｎｚｙｍｅｗａｓｓｈｉｆｔｅｄｆｏｒｍ６８ｔｏ
７６，ａｎｄｔｈｅｏｐｔｉｍｕｍｒｅａｃｔｉｏｎｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｗａｓ５０℃．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｓｏｄｉｕｍａｌｇｉｎａｔｅ；ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ；ｂｒｏｍｅｌａｉｎ
菠萝蛋白酶存在于菠萝植株中，含有多种蛋
白水解酶组分，对蛋白质及多肽具有催化水解活
性，食品工业上用于啤酒澄清、肉类嫩化及水解蛋
白的生产等［１］；医药上主要用于抗炎、消除水肿、
烧伤后脱痂等［２］；畜牧业中，菠萝蛋白酶可作为一
种新型安全兽药［３］。但菠萝蛋白酶作为生物活性
物质，易受有关因素的影响而失活。固定化酶与
游离酶相比，具有热稳定性高、保存稳定性好、抵
抗性强、不易水解以及对变性剂的耐受性好等特
性，因而固定化技术成为生物酶得到广泛而有效
利用的重要手段。
制备固定化酶的方法主要有吸附、包埋、共价
键结合和交联法等，其中包埋法不需要化学修饰酶
蛋白的氨基酸残基，具有反应条件温和，很少改变
酶分子结构，酶活力损失小等优点［４－５］。固定化酶
常用的包埋材料有很多，其中海藻酸钠最为常
见［６］，二价金属离子如Ｃａ２＋与可溶性海藻酸钠反应
生成海藻酸钙微凝胶［７］，无毒、安全，有良好的生物
相溶性，可以在温和条件下实现对酶的固定，有助
于保持酶的生物活性。此外海藻酸钠具有价格低
廉、材料易得等特点，因而受到广泛重视，已应用于
药物缓释与食品、生物工程等领域［８］。
本文利用海藻酸钠为载体对菠萝蛋白酶进行
固定化，分析固定化条件对菠萝蛋白酶活性的影
响，同时对固定化酶的酶学性质进行初步探讨，为
菠萝蛋白酶的固定化制备提供参考依据。
１ 材料与方法
１１ 主要材料与试剂
菠萝蛋白酶参考文献［９］实验室自制；酪蛋白
（进口分装），海藻酸钠，化学纯；三氯乙酸等试剂为
国产分析纯。
１２ 主要仪器与设备
紫外可见光分光光度计，南京第四分析仪器有
限公司；ＨＨ ２数显恒温水浴锅，常州国华电器有
限公司；ＦＡ２０２４Ａ电子天平，上海精密科学仪器有
限公司；ｐＨ２１３酸度计，上海精天电子仪器厂；离心
沉淀器，长沙平凡仪器仪表有限公司。
１３ 实验方法
１３１ 固定化菠萝蛋白酶的制备
参考文献［１０］制备固定化菠萝蛋白酶。
１３２ 菠萝蛋白酶的活力测定
参考文献［１１－１２］进行菠萝蛋白酶的活力
测定。
酶活力单位定义：一个酶活力单位是指在一定
实验条件下 （ｐＨ７０，３５℃时，一定底物浓度、反应
体积、反应１０ｍｉｎ）水解酪蛋白产生１μｇ酪氨酸时
所需要的酶量，单位 Ｕ／ｇ。固定化酶的相对活力是
指在同组试验中以活性最高的为１００，其余的固定
化酶活力与之相比，以百分数表示。
２ 结果与讨论
２１ 固定化条件对固定化酶活力的影响
２１１ 海藻酸钠质量分数对固定化酶活力的影响
将一定量酶液与不同质量分数的海藻酸钠溶
液混合，测定固定化酶的活性。结果如图１所示。
由图１可知，在海藻酸钠质量分数为１０％时，
固定化酶活力最大。当海藻酸钠质量分数过大时，
其黏度很大，难以挤成球状，影响凝胶成型，同时凝
胶的孔径也小，影响酶与底物的结合。反之海藻酸
钠质量分数太小，凝胶的孔径较大，固定化酶容易
流失，也会影响酶活。因此，合适质量分数的海藻
酸钠易形成机械强度适宜的凝胶，同时底物和产物
图１ 海藻酸钠质量分数对固定化酶活性的影响
Ｆｉｇ．１ Ｅｆｅｃｔｓｏｆｓｏｄｉｕｍａｌｇｉｎａｔｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｎ
ａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄｅｎｚｙｍｅ
易于从凝胶微孔扩散通过，酶促反应速度较快，所
以选择海藻酸钠质量分数１０％为宜。
２１２ 酶量对固定化酶活力的影响
用于固定化的酶量直接关系到固定化酶的活
力，酶的加入量亦有一最佳值，将酶液量与质量分
数为１％海藻酸钠溶液按体积比１∶１、１∶２、１∶３、１∶４
进行固定，测定固定化酶的活力，结果如图２所示。
图２ 固定化酶量对固定化酶活力的影响
Ｆｉｇ．２ Ｅｆｅｃｔｓｏｆｄｉｆｅｒｅｎｔｅｎｚｙｍｅａｍｏｕｎｔｓｏｎ
ａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄｅｎｚｙｍｅ
由图２可知，当酶液量与海藻酸钠溶液体积比
大于１∶２时，固定化酶的活性下降，小于１∶２时而略
有降低，综合考虑，选择酶液量与海藻酸钠溶液的
体积比为１∶２为宜。
２１３ ＣａＣｌ２质量分数对固定化酶活力的影响
ＣａＣｌ２的质量分数对形成凝胶的机械强度有重
要影响。ＣａＣｌ２质量分数太大，过多的 Ｃａ
２＋布满
Ｃａ２＋凝胶表面，由于 Ｃａ２＋会与酶作用，从而降低酶
活性，若太少又导致凝胶强度太小，包埋不完全，包
埋在内部的部分酶会流失。将酶液与１％海藻酸钠
溶液以１∶２比例混合固定６０ｍｉｎ，测定固定化酶活
力。结果如图３所示。由图３可知，ＣａＣｌ２质量分数
为３％时，固定化酶活性达到最佳。
２３ 生 物 加 工 过 程 第７卷
图３ ＣａＣｌ２质量分数对固定化酶活性的影响
Ｆｉｇ．３ ＥｆｅｃｔｓｏｆＣａＣｌ２ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｎ
ａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄｅｎｚｙｍｅ
２１４ 固定化时间对固定化酶活力的影响
固定化时间是海藻酸钠与固定化酶的混合液
滴落到ＣａＣｌ２溶液中的反应时间。以上述条件，取
酶液与海藻酸钠溶液混匀，滴入 ３％的 ＣａＣｌ２溶液
中，分别固定３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０ｍｉｎ，测定固定
化酶活力，结果如图４所示。
图４ 固定化时间对固定化酶活性的影响
Ｆｉｇ．４ Ｅｆｅｃｔｓｏｆｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄｔｉｍｅｏｎａｃｔｉｖｉｔｙｏｆ
ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄｅｎｚｙｍｅ
由图４可知：开始固定化时，固定化酶的活性呈
升高趋势，到６０ｍｉｎ固定化酶活达到最大。随着固
定化时间延长，固定化酶活性降低，这可能是因为
随着固定化时间延长，交联程度高，高分子结构致
密，底物扩散阻力增加。
综合考虑上述不同因素对固定化酶活性影响，
在此优化条件下，制备的固定化菠萝蛋白酶活性为
２１１８Ｕ／ｇ（湿质量载体）。
２２ 固定化酶的酶学性质
２２１ 温度对固定化酶和游离酶活力的影响
在上述最佳固定化条件下，制备固定化酶，分
别于３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５℃下测定固定化酶
和游离酶活性，并计算相对活力，结果如图５所示。
图５ 温度对固定化酶和游离酶活力的影响
Ｆｉｇ．５ Ｅｆｅｃｔｓｏｆｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｏｎａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ
ｅｎｚｙｍｅａｎｄｌｉｑｕｉｄｅｎｚｙｍｅ
由图５可知，与游离酶相比，固定化后酶的最
适反应温度为５０℃，最适反应温度没有改变，但固
定化后酶在较高温度范围内，仍保持较高的相对活
力，分析原因可能是固定化载体稳定了酶的空间结
构，使酶对热的稳定性有所提高。
２２２ ｐＨ对固定化酶和游离酶活力的影响
上述其他条件不变，反应温度为５０℃，在不同
ｐＨ的磷酸缓冲溶液中测定固定化酶和溶液酶活力，
结果如图６所示。由图６可知，随着 ｐＨ值的提高，
固定化酶活性逐渐上升，其最适 ｐＨ为７６，而溶液
酶的最适ｐＨ为６８，固定化酶在 ｐＨ７２～８０范围
内，仍保持较高的相对酶活，这显示固定化酶比游
离酶较耐碱，相比游离酶有更宽泛的适应性。可能
原因是由于固定化后，载体对酶空间结构产生影
响，带负电荷的载体制备的固定化酶，最适 ｐＨ向碱
性偏移。
图６ ｐＨ对固定化酶和游离酶活力的影响
Ｆｉｇ．６ ＥｆｅｃｔｓｏｆｐＨｏｎａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ
ｅｎｚｙｍｅａｎｄｌｉｑｕｉｄｅｎｚｙｍｅ
３ 结 论
利用海藻酸钠作为载体制备的固定化菠萝蛋
白酶的活力受海藻酸钠质量分数、固定化酶量、固
３３ 第６期 张 琛等：海藻酸钠包埋法制备固定化菠萝蛋白酶
定化时间以及 ＣａＣｌ２质量分数等因素的影响，其最
佳固定化条件：海藻酸钠质量分数１０％，固定化酶
液量与海藻酸钠体积之比为１∶２，固定化时间为６０
ｍｉｎ，ＣａＣｌ２质量分数为３０％，在此条件下，制备的固
定化菠萝蛋白酶的比活力为２１１８Ｕ／ｇ（湿质量载
体）。固定化后的菠萝蛋白酶最适温度５０℃，没有
发生改变，但固定化酶在较高温度范围内，仍能保
持较高的相对活力；最适ｐＨ为７６，与游离酶相比，
升高了０８个 ｐＨ单位，同时显示固定化菠萝蛋白
酶能耐受较高的碱性环境。
本文仅对菠萝蛋白酶在海藻酸钠中固定化条
件进行了初步探讨，分析了固定化后酶的某些特
性，有关固定化菠萝蛋白酶应用条件及相关因素还
有待进一步研究。
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１９９２．
国内简讯
航天科工研发的生物柴油投产
中国航天科工集团公司０６１基地航天生物柴油投产庆典在贵阳市白云区贵州江南航天生物能源科技有
限公司举行。清澈透明的生物柴油源源不断地从精馏塔涌出，标志着航天科工自主研发的航天生物柴油正
式投产。
（文伟河）
４３ 生 物 加 工 过 程 第７卷