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万方数据
2006年2月 王金霞等：大肠杆菌K12苹果酸酶的克隆、表达与纯化 ·37·
1．2．4重组NAD．ME酶活测定
先配制反应混合物(50蛐01／LHEPEs／NaoH，
1 mmol／LNAD，5mmol／LL—malate，5mmol／LMnCl2，pH
7．2)，活性分析时快速加入酶液，混匀后置于紫外分
光光度计中，在25℃下连续监测340啪的吸收值，
通常在1rnin内获得理想活性数据[7]。酶活力单
位：每分钟催化产生1”molNADH所需的酶量。
NADH的摩尔消光系数按6220mol／cm计[8]。酶活
性用下面的公式进行计算：酶活(u㈦=卷害测
耽：总体积(0．2mL)；仫：样品体积(0．01mL)；
6．22：在测定条件下NADH的毫摩尔消光系数
(Imol／cm)；1．0：光程(cm)；彤：稀释因子；C：在溶液
中酶的浓度。
2结果与讨论
2．1 NAD．ME基因的克隆
以E．c0屁K12基因组DNA为模板，经PCR扩增
出NAD．ME全长基因。PCR产物插入载体pE他4b
(+)的毗I和‰工位点之间，对阳性克隆进行
双酶切，结果如图1所示，约1．7l【b的片段为目的基
因。测序结果表明，载体上NAD—ME基因的蛋白质
编码序列与报道的序列(AceessionNo．Nc—000913)完
全一致b]，说明得到了正确的重组表达质粒，命名为
pET24b—ME。由于在PCR下游引物设计时删除了
NAD．ME基因的终止密码子，蛋白质表达时将利用
载体pET24b(+)的下游终止密码子，得到的重组
NAD—ME在c一末端带有连续的6个组氨酸(H逸)标
签，有利于分离纯化。
1：‰I和Ⅳ如I双酶切；M：1kbDNAmarker
图1 重组质粒pEl翟b-ME的酶切鉴定
Fig．1Re“ctiondigestion鹊钮yofrec伽幽mt趴t
plasmidpE似b．ME
2．2重组NAD．ME的诱导表达以及产物的鉴定分
析
将pE他4b．ME表达质粒转化E．co缸BL21
(DE3)，在I研G诱导下表达，分别对不同诱导时间
和不同培养时间的表达产物进行sDS—PAGE检测，
在分子量65kDa处见一诱导表达带(图2)。结果显
示重组NAD—ME在破菌上清和破菌沉淀中都存在，
说明即有可溶性蛋白又有包涵体。但在培养液中未
检测出NAD．ME，说明NAD—ME未被分泌到胞外。
比较不同条件对表达的影响发现，30℃培养产生的
可溶性蛋白量高于37℃产生的量；经诱导后30℃
培养16h后可溶性重组蛋白产量很高，约占总蛋白
量的50％以上。
M：蛋白分子量标准；1：破菌沉淀，30℃鹏r诱导5h；2：破
菌沉淀，37℃IPGT诱导5h；3：破菌沉淀，30℃IPGT诱导16
h；4：破菌沉淀，37℃鹏T诱导16h；5：破菌上清，30℃IPGT
诱导5h；6：破菌上清，37℃IPGT诱导5h；7：破菌上清，30cC
IPG了诱导16h；8：破菌上清，37℃IPGT诱导16h
图2不同温度不同时间NAD．ME表达的SDS．PAGE的检测
Fig．2SDS．PAGEassayofexpressionofNADLMEatdiff色rent
temDemtureandi饪bI℃nttime
在E．co如中表达重组蛋白除了以可溶性蛋白
表达外，还经常以包涵体形式表达。通常只有可溶
性蛋白才有酶活，所以需要减少包涵体的形成提高
可溶性蛋白表达量。一般通过降低诱导培养温度、
降低IPm浓度及在基本培养基中生长等方式提高
可溶性蛋白产量。本实验中即发现诱导后在30℃
培养有利于可溶性NAD—ME生产。对于m的用
量，根据启动子的不同，一般推荐使用终浓度为
0．O卜1．Omm01／L。本试验结果显示，1wG用量在
0．01咖ol／L时菌体可溶性重组蛋白含量较高，提高
IPllG浓度并没有显著提高重组蛋白的产量。这可
能是因为低浓度I即G诱导时，蛋白质合成速度有利
于蛋白正确折叠。
2．3 重组NAD．ME的纯化
重组NAD—ME含有C一末端Hi％标签，可采用镍
亲和层析法快速纯化。细胞裂解液和Ni．Nr]rA树脂
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·38· 生物加工过程 第4卷第1期
在4℃下混合孵育，重组蛋白结合到树脂上，经过低
咪唑含量的缓冲液洗涤除去非特异性结合蛋白，再
利用高浓度咪唑(0．25mol／L)缓冲液洗脱，得到纯度
较高的目的蛋白。根据纯化过程的sDs—PAGE检测
结果，可以估算产物的纯度可达95％以上(图3A)，
基本满足从事生物催化和酶学研究。经过搅拌式超
滤器浓缩后，重组NAD．ME的质量浓度达到12．9
mg／mL。
M：蛋白分子量标准；1：破菌上清；2：穿透产物；3～6：l～4次
洗涤产物；7：洗脱产物；8：重组NAD—ME；9：牛血清白蛋白(单
体66kD)
图3重组NAD．ME纯化过程的SDSPAGE检测(A)
和非变性PAGE检测(B)
Fig．3SDS_PAGEa11alysisofpIlI语cationa11dnonder斌u五ng
PAGEassayofNAD．ME
2．4非变性PAGE检测
理论上重组NAD．ME的分子量为65331Da，这
和SDS．PAGE图上蛋白质的迁移速度非常一致(图
2，3A)。但是，非变性PAGE发现重组NAD．ME分别
在约130kDa和260kDa处存在明显的条带(图
3B)。由于非变性PAGE能粗略测定蛋白质在溶液
中的自然聚集状态，以上结果可以初步认定，重组
NAD．ME在溶液中的自然聚集状态主要存在同二聚
体和同四聚体两种形式。不同来源的NAD—ME有二
聚体、四聚体、八聚体等几种类型，不同聚集状态之
间可以互相转变。影响聚集体解离的因素包括酶浓
度、pH、还原剂浓度、离子强度、苹果酸与柠檬酸的
存在及贮存条件旧j。
2．5 NAD．ME活性测定
实验发现细胞裂解液即具有明显的NAD．ME活
性。但是由于宿主菌B121(DE3)存在野生NAD—ME，
需要进行蛋白纯化以确认重组NAD—ME的活性。经
镍亲和层析纯化得到目的蛋白具有很高的活性(图
4)，比活可达到100U／暇以上，进一步表明重组的可
溶性NAD．ME具有正常的生物催化活性。其它来源
的NAD．ME的比活都比较低，植物一般是
20～40u／mg[4|，猪蛔虫28u／嘴[9]，人线粒体
35u／nlg‘10】。而来自微生物的NAD—ME在30℃的比活
比较高，据报道E．c0屁MCl061和．吼印靓僦獬锄厶中
NAD—ME比活分别可达300u／Ing㈨和97U／nlg㈨。
O．8
飞06
O．4
∥s
图4纯化后NAD-ME酶活时间扫描光谱
Fig．4Real—timescanspectmmofNAD—ME
activ畸碰erpuri6catio“
3结论
成功地构建了可用于表达大肠杆菌辅酶NAD+
依赖型苹果酸酶的表达质粒载体pEl以b．ME，将其
转化到宿主菌E．∞如B也1(DE3)中，得到相应的工
程菌株。在踟诱导下重组NAD．ME获得稳定的
高表达，且表达蛋白主要为可溶性形式。采用镍亲
和层析技术，一步法得到纯度达95％的重组蛋白。
经SDS—PAGE和非变性PAGE检测，发现重组NAD．
ME分子量约为65kDa，但在溶液中主要以二聚体和
四聚体两种形式存在。辅酶NAD+存在下重组
NAD—ME催化￡．苹果酸氧化脱羧产生丙酮酸，比活
可高达100u，mg。上述结果得到了含有NAD．ME基
因的表达质粒，建立了重组NAD—ME的表达、纯化和
活性测定方法，为进一步研究吡啶核苷酸辅酶依赖
型氧化还原体系和辅酶再生工程提供了实验材料，
相关的工作正在进行中。
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