全 文 ：乌天麻 Gastrodianin 基因的鉴定及其在天麻
发育进程中的表达
?
王浩鑫1 , 2 , 杨 涛1 , 2 , 曾 英1
??
, 胡 忠1
( 1 中国科学院昆明植物研究所 , 云南 昆明 650204; 2 中国科学院研究生院 , 北京 100039 )
摘要 : 基于相似性克隆策略和 RT-PCR , 从兰科植物乌天麻 ( Gastrodia elata f. glauca) 球茎克隆得到两个新
的天麻抗真菌蛋白基因 , 命名为 gastrodianin-4A ( ga4A) 和 gastrodianin-4B ( ga4B) , 并首次用 Northern杂交
研究了该基因在植物不同部位的转录表达。结果表明 , 天麻个体的不同部位只转录表达同一种 Gastrodianin
基因 , 纯化自球茎的 Gastrodianin蛋白质的肽质量指纹谱与推导的 Ga4A 和 Ga4B 成熟蛋白的氨基酸序列相
吻合 ; Northern杂交证明天麻的地上器官 Gastrodianin基因转录表达量远远高于地下球茎 , 而次生球茎皮层
组织的表达量比中柱和整个营繁茎的都高一些。天麻球茎 Gastrodianin的外周表达模式可能是天麻在地下
抵御蜜环菌 ( Armillaria mellea Karst) 入侵球茎皮层内部的防卫机制之一 , 但该基因在天麻地上部分的高丰
度表达暗示 Gastrodianin可能蕴藏其它生理功能。
关键词 : 天麻抗真菌蛋白 ; 表达 ; 乌天麻 ; 兰科 ; 蜜环菌
中图分类号 : Q 945 文献标识码 : A 文章编号 : 0253 - 2700 (2007) 03 - 345 - 06
Identification of the Gastrodianin Gene ga4B in an Achlorophyllous
Plant Gastrodia elata (Orchidaceae) and Its Expression
Pattern during Life Cycle*
WANG Hao-Xin
1 , 2
, YANG Tao
1 , 2
, ZENG Ying
1 **
, HU Zhong
1
(1 Kunming Instituteof Botany, ChineseAcademy of Sciences, Kunming 650204 , China;
2 GraduateSchool of the Chinese Academy of Sciences, Beijing 100039 , China)
Abstract : Through a similarity-based cloning strategy, two types of cDNA cloneswith complete cDNA sequences matching
the known gastrodianins were obtained from Gastrodia elata f . glauca (Orchidaceae) and designated gastrodianin-4A
( ga4A) and gastrodianin-4B ( ga4B) , respectively . But onlyone identical isoformwas foundtobeexpressed inall differ-
ent parts of a single plant . The deduced amino acid sequences of ga4A?-4B accord closely with those of the plant-purified
gastrodianinsbased on the peptide mass fingerprinting analysis . RNA gel blot analyses indicate that gastrodianins were
much moreabundantly expressed in the fully-openedflowers thanthe undergroundcormswhereanenhanced expressionwas
found in the out layers of secondary corms . Fromits expression pattern and level in corms, the gastrodianin is assumed to
prevent Armillaria hyphaefromgrowingon secondary cormsandretard thefurther penetration of Armillariahyphae intonu-
tritive corms . Gastrodianins are therefore considered to play a defensive role against the fungus Armillaria . Given the ap-
parently abundant expression in theabove-ground parts of the plant, however, gastrodianins seem unlikely to be limited to
such a role .
Key words: Gastrodianin; Expression pattern; Gastrodia elata; Orchidaceae; Armillaria mellea
云 南 植 物 研 究 2007 , 29 (3) : 345～350
Acta Botanica Yunnanica

?
?? ?通讯联系人 Author for correspondence; E-mail : biochem@ mai .kib. ac. cn
收稿日期 : 2006 - 10 - 17 , 2006 - 12 - 18 接受发表
作者简介 : 王浩鑫 (1979 - ) 男 , 博士生 , 主要从事天然产物的生物合成研究。E-mail: whaoxing@ mail. kib. ac. cn ?
基金项目 : 云南省自然科学基金项目 (2003C0059M ) 资助
天麻 ( Gastrodia elata Bl .) 是一种传统的中
药材 , 在中国已有上千年的使用历史。它是不含
叶绿素的异养型兰科植物 , 依赖蜜环菌 ( Armill-
aria mellea Karst) 完成其生活史。天麻生长在地
下 , 只是开花期间花葶花序伸出地面高达 1 m。
蜜环菌菌丝定植于营养繁殖茎 ( 简称营繁茎 ) 或
初生球茎 , 但并不侵染从营繁茎上长出的次生球
茎。营繁茎表面覆盖大量的棕褐色菌索 , 而菌丝
进入营繁茎的表皮层并在此被消化成为供次生球
茎生长的营养物质 (周铉等 , 1987 )。天麻的花
序为茎生总状花序 , 小花着生于 U 型的苞片内 ;
抽苔开花后 , 营繁茎逐渐腐化并与母体脱离 , 而
次生球茎的中柱也渐渐空化。
昆明植物所胡忠研究员最先从红天麻次生球
茎分离到一种分子量约 14 kD 的蛋白质取名 Gast-
rodia antifungal protein (GAFP) , 后来称作 Gastrodi-
anin, 它在体外能抑制蜜环菌和绿色木霉 ( Tri-
choderma viride) 的生长 ( 胡忠等 , 1988 ) , 加之
天麻次生球茎极少被蜜环菌侵染 , 因此认为 Gas-
trodinin的积累可能在天麻抵御蜜环菌深入球茎
内部的机制中起重要作用 ( 胡忠等 , 1988; Xu
等 , 1998; Wang 等 , 2001 )。最 近发现红 天麻
gastrodianin-2 ( ga2) 的启动子是真菌诱导型启动
子 , 进一步说明天麻 Gastrodianin 基因的表达可
能与蜜环菌入侵有关 (Sa等 , 2003)。
天麻有 4 个亚种 , 分别是红天麻 ( G. elata
Bl . f. elata) 、黄天麻 ( G. elata Bl . f . flavida S .
chow)、乌天麻 ( G. elata Bl . f. glauca S . chow)
和绿天麻 ( G. elata Bl . f . viridisMakino) , 除野生
绿天麻资源已变得很稀少以外 , 其余 3 种都能够
栽培繁殖。目前 , 已先后从红天麻和黄天麻中克
隆到 一组 Gastrodianin 基 因的 cDNA ( 胡 忠等 ,
1999; Sa 等 , 2003; Wang等 , 2001 ) , 这些 cD-
NA 有很高的序列相似性 , 都具有 516-bp 的开放
阅读框。由 Gastrodianin基因 cDNA 推导的蛋白质
属于甘露糖结合蛋白 ( mannose-binding proteins,
MBPs) 超家族 , 迄今为止已在被子植物石蒜科、
天南星科、百合科、兰科以及鸢尾科中发现该家
族成员 ( Van Damme 等 , 1998; 2000; Wang 等 ,
2001) 。本研究从乌天麻分离到两个新的 Gastro-
dianin基因 , 并首次用 Northern 杂交研究了该基
因在植物不同部位的转录表达 , 研究结果将有助
于阐明 Gastrodianin 在天麻这种异养植物的生长
发育进程中的生理功能。
1 材料与方法
1 .1 材料
乌天麻采自云南昭通 , 洗净后去除营繁茎的蜜环菌
菌索 , 分别切取营繁茎和次生球茎的表皮层、中柱、花
序芽以及花葶和成熟花序 , 经液氮速冻后在 - 70℃保存。
蜜环菌菌种由昆明植物所纪大干老师馈赠。
1 .2 Gastrodianin基因的克隆和鉴定
1 .2 .1 克隆 Gastrodianin 基 因 参照 异 硫氰 酸胍 法
(Chomczynski and Sacchi, 1987) 提取总 RNA , 并根据天麻
球茎淀粉含量高的特点进行相应调整 , 主要是将前两次
的离心力加大到 50 000 g, 可成功得到高质量的 RNA。
从乌天麻多个次生球茎的混合皮层组织提取总
RNA , 用 SuperscriptTM First-Strand Synthesis kit ( Invitrogen)
进行反转录合成 cDNA 第一链。基于相似性的克隆策略 ,
根据已知的黄天麻 Ga-NF基因 (GenBank AJ277783) 成熟
肽设计引物对 : 5′> TGG - 阔CCATGGCGTCAGACCGTTTGAATTCC
< 3′和 5′> GTG - ?GGATCCCTAGCCAGACGCCGCCGCT < 3′, 酶切
位点及其保护序列用斜体字母表示 , 以上述 cDNA 第一链
为模板扩增 Gastrodianin类似基因片段。PCR 扩增程序 :
预变性 94℃ 3 min; 95℃ 30 s, 55℃ 30 s, 72℃ 90 s, 循环 35
次 , 72℃延伸 7 min。目的片段经过割胶纯化、连接转化
到大肠杆菌 DH5α中 , 送交上海基康生物技术公司测序。
以黄天麻 Ga-NF 基因 (GenBank AJ277783) 的 5′端非翻译区
为引物 (5′-CCACCTAGCCATCAAGCAGCC -3′) , 配合 3′ada-
ptor特异引物 (5′> GACCACGCGTATCGATGTCGAC < 3′) 通
过 3′RACE 法得到含有完整读码框的 cDNA 序列 , 用序列
比对软件 CLUSTAL W (1. 82 version, http:?www. ebi .ac.uk?
clustalw?) 进行序列分析。
1 .2 .2 天麻个体不同器官的 RT-PCR 克隆测序 取三个
尚未开花 (但已有花序芽 ) 的乌天麻和两个抽苔开花的
乌天麻作为供试材料 , 这些材料涵盖天麻生长发育的不
同阶段 , 分别提取未开花天麻的营繁茎、连接区、次生
球茎、花序芽和正在抽苔开花的花序、花葶、球茎的总
RNA , 用 1 .2 .1 中的反转录试剂盒得到 cDNA 第一链后进
行 PCR , 引 物对 处 于 非 翻译 区 : 5′-CCACCTAGCCAT-
CAAGCAGCC-3′; 5′-TGTTGAGGTGTTGGGATGTTC-3′。每个
RT-PCR 至少随机挑取五个克隆进行双向测序。
1 .2 .3 肽质量指纹谱分析 参照胡忠等 (1988) 的方法
从乌天麻多个次生球茎的皮层组织提取纯化蛋白 Gastro-
dianin, SDS-PAGE 检测纯度为一条带 , 蛋白样品交由上
海基康生物技术公司用基质辅助激光解吸?电离飞行时间
质谱 (Voyager-DE PRO, Applied Biosystems) 进行肽质量指
纹谱 (PMF) 分析 , 所用蛋白酶是胰蛋白酶 (Trypsin)。
643 云 南 植 物 研 究 29 卷
理论 肽 谱 由 PeptideMass program ( http:?us. expasy. org?
tools?) 生成。
1 .3 Northern杂交分析
将 Ga4B 的 Ser29 -Gly157 肽段对应的基因序列克隆到
pST19 载体的多克隆位点 EcoRⅠ?HindⅢ , 用 SP6 RNA 聚
合酶生成地高辛标记的 RNA 反义探针。
分别提取未开花乌天麻的营繁茎皮层 (Nc)、营繁
茎中柱 ( Cs— n)、次生球茎皮层 ( Sc)、次生球茎中柱
(Cs— s) 的总 RNA 和正在抽苔开花的乌天麻小花 ( Fl )、
花葶 (Is)、次生球茎皮层 (Sc) 的总 RNA , 提取离体培
养的蜜环菌总 RNA 作为对照 , 进行甲醛变性电泳 , 每个
样品的 RNA 上样量为 15μg。用 DIG 标记的 RNA 反义探
针在 68℃进行严谨杂交 8 h, 杂交液为 Roche公司的 DIG
Easy Hyb buffer, 洗膜和免疫检测按试剂盒说明书进行。
2 结果与分析
2 .1 基因克隆和序列比对
用已知 Gastrodianin 基因的序列设计引物 ,
通过 RT-PCR 产生了 400 bp的目的片段 , 测序得
到两种与已知 Gastrodianin 基因相似但不完全相
同的 cDNA 序列 ( A 型和 B 型 ) , 预示可能是新
的 Gastrodianin基因。为了得到全长 cDNA 序列 ,
以黄天麻的 Ga-NF 基因的 5′端非翻译区为引物通
过 3′RACE 法获得含有完整读码框的两个 cDNA
序列 , 分 别 命名 为 gastrodianin-4A ( ga4A) 和
gastrodianin-4B ( ga4B) , 在 GenBank?EMBL data-
base的序列登记号分别为 AY764387 ( ga4A) 和
AY764388 ( ga4B)。
同已知的 Gastrodianin 蛋白序列相似 , 推导
的 Ga4A 和 Ga4B 蛋白质全长序列也在 N 端含有
28 个氨基酸的信号肽 , 除去信号肽和 C 末端肽
以后形成 112 个氨基酸的成熟蛋白 , 即第 29 位
丝氨酸 (S) 到第 140 位天冬酰胺 (N) 的氨基酸
序列。将天麻的几种成熟蛋白包括红天麻的 Ga1
和 Ga2 ( AF334813 )、黄天麻的 Ga-NF 和 Ga-GM
(AJ277784) 与兰科植物二叶兰 ( Listera ovata)、
火烧兰 ( Epipactis helleborine) 以及雪花莲 ( Ga-
lanthus nivalis) 的甘露糖结合蛋白 , 用序列比对
软件 CLUSTAL W 进行序列比对 , 发现 Ga4A 和
Ga4B 成熟蛋白之间的氨基酸序列一致率为 93% ,
与其它 Gastrodianins 的氨基酸序列一致率大约为
86% (图 1) 。甘露糖结合位点 QXDXNXVXY ( 图
1 下划线 ) 位于蛋白的 26 - 34 , 57 - 65 和 88 - 96
位氨基酸残基 ; Ga4A 或 Ga4B 有 83 - 86%的氨基
酸与二叶兰 LoMBP (L18895) 和 火 烧 兰 EhMBP
图 1 Gastrodianins和其它甘露糖结合蛋白的序列比对
相同和相似的氨基酸分别用黑色和灰色阴影显示 , 三个甘露糖结合部位 QXDXNXVXY 用下划线标示 , 原始比对图谱用
CLUSTAL W (1 . 82 version, http:?www. ebi . ac.uk?clustalw?) 软件生成。
Fig . 1 Sequence alignment among gastrodianins and related lectins at the mature protein level .
Identical or similar residues are indicated by dark and light shading, respectively . Three mannose-binding sites (QXDXNXVXY , underlined)
exist in all sequences . Alignment was generated by CLUSTAL W ( 1 . 82 version, http:??www. ebi . ac. uk?clustalw?) .
7433 期 王浩鑫等 : 乌天麻 Gastrodianin基因的鉴定及其在天麻发育进程中的表达
(AAC48927 ) 相同 , 而几种 Gastrodianins 与雪花
莲凝集素 GNA (1MSAA) 的氨基酸序列一致率在
50 - 53%。
2 .2 ?天麻个体的不同器官只表达同一种 Gastro-
dianin 基因
在天麻的不同发育阶段 , 以未开花天麻的营
繁茎、连接区、次生球茎、花序芽和正在抽苔开
花的花序、花葶、球茎为材料 , 通过 RT-PCR 和
克隆测序发现 , 来源于同一个体无论是营繁茎还
是花序芽的 Gastrodianin基因克隆都是同一序列 ,
只是有的个体表达 ga4A 而有的表达 ga4B。因
此 , 尽管发现乌天麻有两种 Gastrodianin 基因转
录表达 , 但同一个体的不同器官都只表达同一个
基因。
2 .3 乌天麻 Gastrodianin 的生化鉴定
离体抗菌活性实验证实 , 从混合的乌天麻球
茎皮层分离纯化到的 Gastrodianin 蛋白具有抑制
绿色木霉 ( Trichoderma viride) 生长的活性 , 抑
制水平与红天麻的相当。由于乌天麻的两种 Gas-
trodianin蛋白具有极为相似的理论等电点和分子
量 ( pI?Mr) , 分别为 9 .06?12211 Da ( Ga4A ) 和
9 .03?12240 Da ( Ga4B ) , 从混合球茎皮层分离纯
化到的单一蛋白条带含有 Ga4A 和 Ga4B 两种蛋
白 , 肽质量指纹谱分析也证明这一事实 ( 图 2 )。
乌天 麻 Gastrodianin 的 PMF 显 示 , 分 子 量 为
1382.4 Da 和 1180 .4 Da 的两 个主要 离子峰 与
Ga4A 和 Ga4B 的理论肽谱在分子量和氨基酸序列
上都符合 ; 同样 , PMF 实际图谱中分子 量为
1050.4 Da和 1032 .4 Da的离子峰分别与 Ga4A 的
A - 萶MWASNTNR 肽段和 Ga4B 的 A 萶IWASNTNR 肽段
相对应。另一方面 , 乌天麻的实际和理论 PMF
图谱都没有分子量为 1553 .7 Da的离子峰 , 该离
子对应的序列为 MQ - 蔝N58 DGNLVIYSGSR , 却在红天
麻和黄天麻 Gastrodianins的理论图谱中存在 ; 而
1180.7 Da离子峰 ( 对应 DGNLVIYSGSR 肽段 ) 在
Ga4A 和 Ga4B 的实际 PMF 图谱中明显检测到 ,
但其它 Gastrodianins 的理论图谱均不含分子量为
1180.7 Da的肽段离子。PMF 分析结果证实乌天
麻 Gastrodianins的第 58 位氨基酸应是能被胰蛋白
酶识别并水解的精氨酸 ( R ) , 而不是红天麻和
黄天麻 Gastrodianins的天冬酰胺 (N)。
2.4 Gastrodianin 基因在天麻不同器官的转录表达
图 2 乌天麻 Gastrodianin 的肽质量指纹谱
Fig . 2 Peptide mass fingerprinting profileof the
plant-purified gastrodianin
图 3 Gastrodianin 基因在天麻不同器官的转录表达
上图 : Northern 杂交的总 RNA 来自小花 ( Fl) 、花葶 ( Is) 、次生
球茎皮层 ( Sc)、营繁茎皮层 ( Nc)、次生球茎中柱 (Cs—s) 、营
繁茎中柱 ( Cs— n)、蜜环菌菌丝 ( Am) ; Nc 和 Cs— s 之间 Sc 是
正在开花的次生茎皮层。下图 : 等量的总 RNA 上样
Fig . 3 Northern blot analysis ( above) of gastrodianin transcripts from
fully-opened flowers ( Fl) , inflorescence stalks ( Is) , theout layer tissues
of secondary corms ( Sc) , the out layer tissues of nutritive corms ( Nc) ,
central stele from secondary corms ( Cs—s) , central stele from nutritive
corms (Cs— n) , Armillariamelleahyphae (Am) ; TheSc between Nc and
Cs— s was generated from plants in flowering . 15 μg total RNA per lane
was loaded . Ethidium bromide staining of ribosomal RNA showed the
equivalenceof total RNA loading between the samples ( below) .
由于 ga4A和 ga4B的 cDNA 序列一致性达到
98% , 而且它们的非翻译区序列也几乎一致 , 因
此 , 用 ga4A 或 ga4B 作为探针很可能得到完全
相同的核酸杂交结果。从 ga4B 生成的 RNA 反义
探针用于 Northern杂交显示 , 天麻的地上成熟器
官 (包括花葶和成熟小花 ) 的 Gastrodianin 基因
转录表达量远远高于地下球茎包括营繁茎和次生
球茎 , 而次生球茎皮层组织的表达量比中柱和整
个营繁茎的都高一些 ; 此外 , 蜜环菌 RNA 中没
有检测到 Gastrodianin 基因或类似基因的转录表
达 (图 3) 。天麻球茎 Gastrodianin 的外周表达模
843 云 南 植 物 研 究 29 卷
式可能是天麻在地下抵御蜜环菌入侵球茎皮层内
部的防卫机制之一 , 但它在天麻地上部分的转录
表达量明显高于地下的球茎 , 该结果还是首次报
道 , 暗示 Gastrodianin的生理作用似乎并不仅限
于此。
3 讨论
迄今已从天麻的 3 个亚种发现 10 余个 Gast-
rodianin基因 , 其中黄天麻的两个基因编码的成
熟蛋 白 之 间 仅 相 差 两 个 氨 基 酸 ( Wang 等 ,
2001) , 与黄天麻的 Ga-NF 相比 , 来自红天麻的
Ga1 和 Ga2 有四个不同氨基酸 , 而本研究发现的
乌天麻 Gastrodianins的氨基酸序列变异最大 , 各
有十五个不同氨基酸 , 变异高发位点在第 6～12
残基 (图 1 )。尽管在天麻同一亚种已发现两个
或两个以上的 Gastrodianin 基因 , 但同一个天麻
植株无论是地下的球茎还是地上的花器官 , 都只
表达同一种基因。
本研究发现并证实了 Gastrodianin 基因在天
麻地上器官的表达丰度明显高于地下器官 ( 图
3)。先前推测 Gastrodianin 可能在营繁茎合成然
后被运往次生球茎积累于次生球茎的皮层组织
中 , 至抽苔时转移到花葶中 ( 胡忠等 , 1994 )。
但本研究的实验证据表明 , 次生球茎皮层和花葶
花序都能够转录表达 Gastrodianin 基因 , 而且其
转录水平明显高于营繁茎。也就是说 , Gastrodi-
anin在天麻次生球茎皮层和花葶花序中能够大量
合成 , 应该没有必要从营繁茎转运而来。天麻球
茎 Gastrodianin的外周表达模式可能是天麻在地
下抵御蜜环菌入侵球茎皮层内部的防卫机制之
一 , 但它在天麻地上部分的转录表达量明显高于
地下的球茎 , 该结果还是首次报道 , 暗示 Gastro-
dianin的作用似乎并不仅限于此。这一发现在某
种程度上有些“意外”, 似乎与 Gastrodianin抵御
蜜环菌的功能不太相配 , 因为天麻的地上成熟器
官约有 1 m高 , 几乎不可能接触到营腐生生活的
蜜环菌 , 故推测 Gastrodianin可能蕴藏其它生理
功能 , 比如抵御昆虫或其它病菌。但另一方面 ,
已报道的兰科其它植物的 MBPs大都来自地上部
分的叶片或果实 (Van Damme等 , 1998 ) , 因此
Gastrodianin表达量在天麻花器官最高也应是预料
之中。
其实 , 我们对单子叶植物甘露糖结合蛋白
(或称凝集素 ) 包括 Gastrodianin的生物学功能还
知之甚少。据 Peumans and Van Damme (1995) 以
及 Barre等 (1996 ) 报道 , MBPs在植物抵御有害
动物、昆虫以及微生物侵害时起到某种防卫作
用 , 如此推测 , Gastrodianin同雪花莲凝集素 GNA
或其他凝集素相似 , 有可能参与天麻对微生物或
昆虫的防卫机制。已有的研究表明 , 除极个别凝
集素如火烧兰单体凝集素 ( Epipactis helleborine
merolectin) 外 , 大多数 MBPs 并无抗真菌活性
(Wang等 , 2001 )。虽然 Gastrodianin 显示体外抗
真菌活性 , 但它同已知的几类抗真菌蛋白在序列
和结构上并无任何同源性 , 后者为几丁质结合蛋
白如 hevein or hevein-like proteins, 因此很难相信
Gastrodianin也以几丁质结合的方式起作用。北京
生物物理研究所的王大成研究组在解析 Gastrodi-
anin的晶体结构时发现 , 典型的 MBP 只同甘露
糖结合 ( Liu等 , 2005) ; 而 Gastrodianin独特的四
级结构— 新型单体 , 使其有别于其它 MBP 超家
族成员。因此 , 认为单体的整体结构而非局部的
结构变化造就了 Gastrodianin 的抗真菌活性 (Liu
等 , 2005) , Gastrodianin的单体结构状态是其抗真
菌活性的支撑因素 , 事实上火烧兰单体凝集素也
具有体外抗真菌活性 , 但二聚体和四聚体凝集素
如雪花莲凝集素 GNA 却没有 ( Wang 等 , 2001 )。
尽管如此 , Gastrodianin在植物体内的作用仍然是
个谜 , 但结合天麻离体培养、细胞壁结构解析以
及基因调控技术的运用 , 谜团会逐渐解开。
〔参 考 文 献〕
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