全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2016, 42(4): 600608 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn
本研究由国家转基因生物新品种培育科技重大专项(2011ZX08002-003)和国家现代农业产业技术体系建设专项(CARS-3-1-9)资助。
This study was supported by the National GMO Program of China (2011ZX08002-003) and the China Agriculture Research System (CARS-3-1-9).
* 通讯作者(Corresponding author): 许为钢, E-mail: xuwg1958@163.com, Tel: 0371-65712307
第一作者联系方式: E-mail: wangyongxia005@163.com, Tel: 0371-65721637
Received(收稿日期): 2015-10-12; Accepted(接受日期): 2016-01-11; Published online(网络出版日期): 2016-01-25.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20160125.1622.012.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2016.00600
导入外源玉米 C4型 NADP-ME基因对小麦光合效能的影响
王永霞 1,2 杜新华 1,2 许为钢 1,2,* 齐学礼 2 李 艳 2 王会伟 2 胡 琳 2
1南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室, 江苏南京 210095; 2河南省农业科学院小麦研究所 / 河南省小麦生物学重点实
验室, 河南郑州 450002
摘 要: 为研究玉米 C4型 NADP-ME 基因对小麦光合特性的影响, 以 T3代转 NADP-ME 基因小麦株系 10T(9)-1-1 和
10T(9)-225-4及其对照周麦 23为试材, 进行了分子特征鉴定、光合生理特性分析和单株产量性状调查, 并对其作用机制
进行了初步解析。结果表明, 外源基因已整合到转基因小麦的基因组中, 并能正确转录和翻译; 与对照周麦 23相比, 两
个转基因株系在 4 个测定时期旗叶 NADP-ME 酶活性均明显提高, 而旗叶净光合速率(Pn)则明显下降; 尤其在花后第 7
天, 两个转基因株系的酶活性较对照分别提高 1.33倍和 1.13倍, Pn分别较对照下降 17.26%和 10.35%; 千粒重和籽粒产
量较对照均显著下降。与对照周麦 23相比, 转基因株系 10T(9)-225-4利用强光和同化 CO2能力下降, 光合效率下降; 旗
叶气孔张开率和气孔导度均显著下降; 苹果酸含量降低了 5.6%, 丙酮酸含量则提高了 17.1%; 外施苹果酸可恢复其光合
速率。以上研究结果表明, 玉米 C4型 NADP-ME 基因的导入降低了小麦的光合特性, 苹果酸含量降低引起的气孔导度
下降可能是导致转基因小麦光合效能降低的原因。
关键词: 转基因小麦; NADP苹果酸酶; 净光合速率; 气孔导度
Photosynthetic Characteristics of Transgenic Wheat Expressing Maize C4-Type
NADP-ME Gene
WANG Yong-Xia1,2, DU Xin-Hua1,2, XU Wei-Gang1,2,*, QI Xue-Li2, LI Yan2, WANG Hui-Wei2, and HU Lin2
1 Nanjing Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China; 2 Henan
Provincial Laboratory of Wheat Biology / Wheat Research Institute, Henan Academy of Agricultural Sciences, Zhengzhou 450002, China
Abstract: To explore the physiological characteristics of the transgenic wheat expressing maize C4-type NADP-ME, we intro-
duced NADP-ME into the C3 crop wheat by using particle bombardment transformation. Two transgenic wheat lines (10T(9)-1-1,
10T(9)-225-4) and parental control (Zhoumai 23) were used to study molecular characteristics and photosynthesis property, to
reveal the mechanism. The results showed that the NADP-ME sequence was integrated into wheat genome, and the transcription
and translation were exactly same as expect. The enzyme activity of NADP-ME in flag leaf in transgenic plants were increased
significantly than untransformed plants, for instance it was increased 1.33 and 1.13 times on the 7th day after flowering. Net pho-
tosynthetic rate (Pn) of flag leaf in transgenic plants obviously decreased when compared to the untransformed plants. On the 7th
day after anthesis, Pn of transgenic wheat decreased by 17.26% and 10.35%. The yield and 1000-grain weight were decreased than
the control. Utilization efficiency on strong light utilizing and ability of CO2 assimilation in transgenic line 10T(9)-225-4 were
significantly declined, photosynthesis rate was also decreased. Stomatal opening rate and stomatal conductance were significant
decrease, malic acid content of transgenic wheat reducing 5.6% while pyruvate level is raised by 17.1%, and Pn of transgenic
wheat can be restored by feeding with exogenous malate. Those results indicated that the transgenic wheat expressing maize
NADP-ME gene showed lower photosynthetic characteristics than the control, the reason was maybe the decrease of stomatal
aperture caused by decline of malic acid content.
Keywords: Transgenic wheat; NADP-dependent malic enzyme; Net photosynthetic rate; Stomata conductance
长期以来, 许多科学家都在努力将 C4 作物的高光效 关键基因引入水稻、小麦等 C3作物中, 试图利用 C4型高
第 4期 王永霞等: 导入外源玉米 C4型 NADP-ME基因对小麦光合效能的影响 601
光效基因来改良 C3 作物光合作用的内在遗传基础, 使之
具备高光效特性, 从而大幅度提高光合效率, 实现生物学
产量和籽粒产量的同步提高[1-2]。随着分子生物学和植物
转基因技术的快速发展, 通过基因工程手段将 C4 途径光
合关键酶基因导入 C3 植物中, 在国内外已取得了显著进
展[3-4]。特别是在水稻、小麦、烟草等植物中转入 C4途径
高光效关键基因 PEPC和 PPDK, 并获得高效表达的转基
因植株的成功报道[5-16], 为进一步提升 C3 植物产量潜力
开辟了一条新的道路。NADP-ME 也是 C4 途径的关键酶
之一, 具有催化苹果酸脱羧, 释放的 CO2富集在 Rubisco
周围, 从而促进 Rubisco 的羧化反应, 降低其加氧反应,
提高光合作用效率作用。Ku 等[17]认为 NADP-ME 基因的
活性与光呼吸的速率呈负相关, 将 NADP-ME基因转入 C3
植物, 可能是降低 C3 植物的光呼吸, 提高其光合效率的
一种有效途径。目前, 已成功的将 C4型 NADP-ME基因导
入到拟南芥、烟草和水稻等上 C3 植物上, 但大多数结果
是对光合产量的提高无实质性的效果[18-23]。Tsuchida等[21]
发现在过量表达玉米叶绿体 NADP-ME cDNA的水稻转化
体中, NADP-ME酶活性比对照增加 30倍左右, 转化体叶
色变白并且生长明显受到抑制。迟伟等[22]研究结果显示,
在转高粱 C4 型 NADP-ME cDNA 的转基因水稻植株中,
NADP-ME酶活性比对照提高了 1~7倍, 但光合速率没有
提高。Laporte 等[23]发现, 转玉米 NADP-ME 基因的烟草
的气孔导度与NADP-ME的水平成反比, 转基因水稻的水
分利用效率(鲜重/水耗)比野生型高 15%~20%。截至目前,
外源 C4型 NADP-ME 基因对小麦光合效能的影响及其机
制研究尚未见报道。
本课题组从玉米高光效材料中分离了C4型NADP-ME
基因的cDNA序列[24], 并将其导入拟南芥[25]和小麦中。本
研究以T3代转玉米C4型NADP-ME基因小麦株系为材料 ,
研究该基因在小麦基因组中的整合与表达情况 , 光合生
理特性和产量性状的表现 , 并对其影响机制进行了初步
解析, 为合理利用C4型NADP-ME基因改良C3作物光合效
能提供依据。
1 材料与方法
1.1 转基因小麦获得
从玉米高光效自交系Z1194中分离了C4型NADP-ME
基因的cDNA序列 [24], 将其构建到含35S启动子的双元表
达载体pCambia3301中, 通过基因枪法导入普通小麦品种
周麦 23中 , 获得的 T3代转 NADP-ME基因小麦株系
10T(9)-1-1和10T(9)-225-4为试验材料。
2012年10月 , 将各转基因小麦株系和对照周麦23种
植于国家黄淮海转基因小麦中试基地(河南原阳, 35°00′ N,
113°40′ E), 每系行长2 m, 行距25 cm, 株距10 cm。田间
常规管理。
1.2 转基因小麦的分子特征鉴定
1.2.1 Southern杂交检测 2013年4月7日, 取拔节期小
麦叶片3 g, 用改良的CTAB法提取基因组DNA[26]。取
150 μg基因组DNA和50 ng质粒DNA, 使用限制性内切酶
Xbal I酶切消化, 纯化后电泳分离, 转移至尼龙膜(N+)上。
以质粒 pCambia3301-NADP-ME为模板 , 使用引物扩增
520 bp的 NADP-ME基因片段为探针标记模板。取外源基
因探针模板1 μL, 用DIG标记及检测试剂盒(德国Roche公
司)进行探针标记和杂交, 暗室中过夜、压片并检测信号。
1.2.2 qRT-PCR分析 2013年分别在抽穗期 (4月25
日)、开花期(5月2日)、花后第7天(5月13日)和花后第15天
(5月20日), 选取100 mg旗叶, 采用植物总RNA提取试剂
盒(天根生物科技有限公司)提取总RNA。RNA反转录为
cDNA (Promega公司试剂盒), 使用SYBR Green Real-time
PCR Master Mix QPK-201 (TOYOBO), 在Bio-Rad iQ5上
进行实时荧光定量PCR反应。扩增引物由生工生物工程
(上海)有限公司合成。NADP-ME基因引物(QF: 5-CGTG
GAGTACGAAGGAAAGACT-3; QR: 5-GAGATCTTTC
TGATGCTGGTGA-3)。扩增程序为: 94℃预变性2 min; 94
℃变性15 s, 58℃复性10 s, 72℃延伸15 s, 38个循环。以小
麦 肌 动 蛋 白 β-actin 为 内 参 照 基 因 ( 引 物 序 列 AF:
5-GTTCCAATCTATGAGGGATACACGC-3; AR: 5-GAA
CCTCCACTGAGAACAACATTACC-3)。扩增程序为: 94℃
预变性2 min; 94℃变性15 s, 55℃复性15 s, 72℃延伸15 s,
35个循环。所有试验样品均3次重复。
1.2.3 Western杂交检测 为进一步验证玉米C4型
NADP-ME基因在小麦中能否正确翻译出相应的蛋白, 在
抽穗期对T3代转基因小麦进行Western杂交分析。参照Ku
等[17]描述的方法从抽穗期(2013年4月25日)旗叶中提取粗
蛋白。取20 μg粗蛋白样品, 经SDS-PAGE、100 V湿转2 h
转移到硝酸纤维素膜上, 新鲜脱脂奶粉封闭1 h后加入一
抗(NADP-ME兔多抗)孵育2 h, TBST洗膜3次, 每次5 min,
再用HRP标记的二抗(山羊抗兔)孵育1 h, TBST洗膜6次,
每次5 min, 最后用ECL发光检测试剂盒暗室发光显影 ,
用Quantity One软件进行杂交条带的灰度分析。NADP-ME
兔多克隆抗体由美国Abcam公司制备, HRP标记的二抗购
自北京康为世纪生物科技有限公司。
1.3 转基因小麦光合生理指标测定
1.3.1 NADP-ME酶活性测定 2013年3月12日小麦返
青期, 将转基因植株和对照周麦23移植于直径285 mm、高
386 mm花盆内, 每份材料移植30盆, 每盆定苗3株, 常规
管理。参照Ku等[5]描述的方法测定抽穗期(4月25日)、开
花期(5月2日)、花后第7天(5月13日)和花后第15天(5月20
日)旗叶中NADP-ME酶活性。
1.3.2 气体交换参数测定 2013年 , 分别在抽穗期(4
月25日)、开花期(5月2日)、花后第7天(5月13日)和花后第
15天(5月20日), 利用CIRAS-2光合仪测定转基因小麦和
对照旗叶的净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、蒸腾速率(Tr)
和胞间CO2浓度(Ci)日变化。测定时CO2浓度为大气CO2浓
602 作 物 学 报 第 42卷
度, 气体流速为300 mL min–1。测定时间从6:00到18:00,
每间隔1 h往返重复测定3次。参照王兰兰等[27]描述的方法
计算单位日光合总量。测定时段的光合有效辐射和大气温
度见表1。
表 1 5个生育期的最大光合有效辐射和最高温度
Table 1 Maximal values of photosynthetically active radiation(PAR) and temperatures at five stages
生育期
Growth stage
光合有效辐射
Photosynthetically active radiation (μmol m–2 s–1)
温度
Temperature (℃)
抽穗期 Heading 1402.7±207.6 24.1±1.4
开花期 Anthesis 1425.9±143.6 26.4±0.5
花后第 7天 The 7th day after anthesis 1562.5±100.6 28.4±0.3
花后第 15天 The 15th day after anthesis 1600.4±2.4 29.2±1.0
n 1
i i i
i 1
1( ) ( 1)t
2N
P D P P
式中, PN (D)为单位日光合总量值(μmol m–2); Pi为i次
测光合速率(μmol m–2 s–1); ti为Pi与Pi+1次测定间隔时间(s);
n为测定次数。
1.3.3 旗叶Pn对光强和CO2响应曲线测定 2013年在
开花期 (5月2日 ) 9:00—11:30测定光合速率 (Pn)对光强
(PPFD)的响应曲线 , 叶室温度为29℃ , 叶室光强设定梯
度依次为1800、1600、1400、1200、1000、800、600、400、
200、150、80、40、10 μmol m–2 s–1, CO2浓度为380 μmol
mol–1。测定光合速率(Pn)对CO2浓度响应的相应曲线, CO2
浓度由系统配置的CO2钢瓶提供。利用初始期胞间CO2浓
度(Ci) 35~215 μmol mol–1的Pn与Ci进行回归, 其斜率为羧
化效率。叶室光强为1450 μmol m–2 s–1, 叶室温度为29℃。
1.4 气孔张开率和气孔导度测定
气孔张开率是指视野内开放气孔数与总气孔数的百
分比。2013年在抽穗期(4月25日), 剪取小麦叶片中部约
5 cm长 , 迅速投入到 FAA固定液 (甲醛 5 mL+冰醋酸
5 mL+70%酒精90 mL)中。将固定好的样品叶片表皮上的
溶液擦拭干净, 于其上、下表皮均匀涂上一层薄薄的透明
的指甲油。风干后将指甲油层用透明胶粘住剥取, 平放在
载玻片上, 在400倍显微镜下观测, 分别统计视野内开放
和关闭的气孔数, 所得数据为10个视野的平均值。气孔导
度采用CRIAS-2光合仪测定。所有样品各选取5片旗叶进
行测试指标分析。
1.5 苹果酸和丙酮酸含量的测定
2013年抽穗期(4月 25日)选取转基因小麦和对照各 6
片旗叶, 参照 Boehringer 等[28]和李琳等[29]描述的方法分
别进行苹果酸和丙酮酸含量的测定。
1.6 外施苹果酸处理和净光合速率的测定
2013年在抽穗期(4月25日)的上午9:30—11:30, 按照
Ji等[30]方法将苹果酸溶液(150 mmol L–1)均匀喷施于转基
因小麦株系10T(9)-225-4及对照旗叶表面, 每个处理选取
5片旗叶, 喷施蒸馏水作为对照组。将处理后的植株置于
暗处(20~30 μmol m–2 s–1)下处理1 h, 使苹果酸溶液和蒸
馏水充分渗入叶片组织内。自然光下适应1 h后 , 采用
CIRAS-2型光合作用系统测定其光合速率的变化, 重复往
返测定3次。
1.7 产量和农艺性状调查
2013年6月, 收获后取自然风干的转基因植株和对照
各30株, 调查株高、单株穗数、小穗数、穗粒数、千粒重
和单株籽粒重, 使用DPS7.55统计软件对转基因株系和对
照各项指标进行统计分析和显著性比较。
2 结果与分析
2.1 转基因小麦的分子鉴定
2.1.1 Souhern杂交结果 对3个转基因株系中PCR阳
性的T3代植株和对照周麦23的叶片提取基因组DNA进行
Southern杂交分析。经限制性内切酶Xbal I酶切消化的阳
性质粒与探针杂交后出现1条11.5 kb左右的杂交带, 受体
对照植株中无杂交信号, PCR检测阳性的转基因植株中出
现有杂交带(图1), 表明外源NADP-ME基因已整合到小麦
基因组中。
2.1.2 转录水平分析 对不同生育期转基因小麦中
NADP-ME的转录水平进行分析, 受体对照中出现cDNA
扩增产物, 內说明小麦中可能存在有 源NADP-ME基因。
外源NADP-ME基因导入后, 2个转基因株系中NADP-ME
基因的相对表达量与对照周麦23相比均显著提高 (P <
图 1 T3代转基因株系的基因组 Southern杂交分析
Fig. 1 Southern blot analysis of T3 transgenic lines
M: λDNA; +: 质粒 pMW003-NADP-ME; : 受体周麦 23; 1~2转
基因植株依次为 10T(9)-1-1和 10T(9)-225-4。
M: λDNA; +: Plasmid pMW003-NADP-ME; : recipient Zhoumai
23; 1–2: transgenic plants 10T(9)-1-1 and 10T(9)-225-4.
第 4期 王永霞等: 导入外源玉米 C4型 NADP-ME基因对小麦光合效能的影响 603
0.01), 且开花期>抽穗期>花后第7天>花后第15天。其中,
转基因株系10T(9)-1-1和10T(9)-225-4的NADP-ME基因表
达量, 开花期分别高2.32倍和3.75倍, 抽穗期分别较对照
高3.41倍和3.60倍(图2)。
2.1.3 翻译水平检测 Western杂交结果显示 , 转
基因小麦和受体对照中均出现65 kD的目的蛋白 , 说
明NADP-ME抗体能与小麦内源NADP-ME杂交 , 不同
转基因单株中NADP-ME翻译水平上存在差异 (图3-A);
杂交条带灰度分析显示 , 转基因株系 10T(9)-1-1和
10T(9)-225-4分别比对照高 0.90~1.77倍和 1.50~1.95倍
(图3-B)。
2.2 旗叶 NADP-ME酶活性变化
外源NADP-ME基因的导入 , 使两个转基因株系中
NADP-ME酶活性均不同程度的增强。在4个测定生育期,
除10T(9)-1-1在花后第15天与对照未达显著差异外, 两个
株系的旗叶NADP-ME酶活性均比对照显著提高(图4-A)。
其变化规律为花后第7天>开花期>抽穗期>花后第15天 ;
其中, 花后第7天转基因小麦NADP-ME酶活性提高幅度
图 2 转基因小麦及其对照(WT)不同生育期旗叶 NADP-ME基
因的相对表达量
Fig. 2 Relative expressions of NADP-ME in flag leaves of
transgenic wheat lines and wild type (WT) at different stages
内参基因为 β-actin。**表示转基因植株与对照之间差异显著
(P<0.01)。
Gene β-actin was used as the internal reference. ** indicates sig-
nificant difference between the transgenic plant and WT (P<0.01).
图 3 T3代转基因株系Western杂交(A)和杂交图片灰度分析(B)
结果
Fig. 3 Western blot (A) and gray level analysis (B) of T3
transgenic lines
以 WT的表达蛋白含量为 1。
The expression protein content of WT was 1.
最大, 分别较对照高1.33倍和1.13倍。
2.3 旗叶 Pn变化
外源NADP-ME基因导入后, 4个测定生育期的转基因
小麦旗叶Pn均比对照明显下降 , 除花后第15天转基因小
麦的Pn与对照无显著差异外 , 其他生育期两转基因株系
Pn均显著低于对照 (图4-B); 花后第7天下降幅度最大 ,
10T(9)-1-1下降了17.26%, 10T(9)-225-4下降了10.35%, 其
次为抽穗期 , 10T(9)-1-1和 10T(9)-225-4 Pn降幅分别为
16.15%和9.26%。
2.4 产量性状分析
与对照周麦23相比 , 转基因小麦株系10T(9)-1-1和
10T(9)-225-4的各产量性状指标均不同程度降低, 但只有
籽粒产量 (P=0.015与0.028)和千粒重 (P=0.020与0.025)达
到显著水平, 其中千粒重平均下降10% (表2)。结果表明,
玉米C4型NADP-ME基因的引入导致转基因小麦千粒重下
降, 进而造成籽粒减产。
图 4 不同生育期转基因小麦及对照(WT)旗叶 NADP-ME酶活性(A)和净光合速率(B)的变化
Fig. 4 Dynamic changes of NADP-ME enzyme activity(A) and photosynthetic rate (B) in flag leaves of transgenic wheat lines and the
wild type (WT) at different stages
*和**分别表示转基因植株与对照在 P < 0.05和 P < 0.01水平差异显著。
* and ** indicate significant difference between the transgenic plant and WT at P < 0.05 and P < 0.01 level, respectively.
604 作 物 学 报 第 42卷
2.5 旗叶 Pn日变化
4个测定生育期转基因小麦株系10T(9)-225-4和对照周
麦23的Pn日变化均表现为双峰曲线, 转基因小麦的Pn低于对
照周麦23, 其差异在花后第7天最明显(图5), 此时转基因小
麦旗叶Pn的最大值为24.59 μmol m–2 s–1, 较对照周麦23下降
了10.26%。转基因小麦Gs、Tr和Ci等光合特性参数的日变化
呈现与对照一致的趋势, 但转基因小麦的Ci明显高于对照周
麦23, 而Gs和Tr明显低于对照周麦23 (图6)。
表 2 转 NADP-ME基因小麦和非转基因对照的产量及农艺性状比较
Table 2 Comparison of yield related traits between NADP-ME transgenic wheat lines and WT
株系
Line
株高
Plant height
(cm)
分蘖数
Spike number
per plant
小穗数
Number per
spike
单株产量
Grain yield per
plant (g)
单穗粒数
Grain number
per spike
千粒重
1000-grain weight
(g)
WT 67.05±3.03 8.60±1.31 19.50±1.28 19.03±3.72 42.49±2.62 50.06±2.76
10T(9)-1-1 68.12±3.11 8.60±2.06 18.50±1.15 16.92±2.35* 40.62±4.54 45.03±2.43*
10T(9)-225-4 67.17±1.97 8.86±2.00 18.64±0.98 17.03±2.27* 40.26±3.97 45.10±2.17*
数据为 30个单株重复的平均值±标准差。*表示转基因株系与对照差异显著(P < 0.05)。
Data are shown as mean ± SD of 30 individual plants. * indicates significant difference between the transgenic lines and WT at P < 0.05.
WT: wild.
图 5 转基因株系和对照(WT)不同时期旗叶净光合速率日变化曲线
Fig. 5 Diurnal variation of photosynthetic rate of flag leaves in transgenic line and wild type (WT) at different stages
图 6 转基因株系和对照(WT)不同时期旗叶 Gs、Tr和 Ci平均日变化曲线
Fig. 6 Average diurnal variation of Gs, Tr, and Ci of flag leaves in transgenic line and wild type (WT) at different stages
图中数值均为 4个生育期测定数值的平均值。Data are the mean of four growth stages.
第 4期 王永霞等: 导入外源玉米 C4型 NADP-ME基因对小麦光合效能的影响 605
表 3 转 NADP-ME小麦不同生育时期的单位日光合总量
Table 3 Diurnal photosynthesis cumulative Pn in NADP-ME transgenic wheat lines at different growth stages (105 μmol m–2)
材料
Line
抽穗期
Heading
开花期
Anthesis
花后第 7天
7th day after anthesis
花后第 15天
15th day after anthesis
平均
Average
WT 8.30±0.63 7.83±0.89 9.07±0.57 8.48±0.68 8.42±0.66
10T(9)-225-4 7.63±6.28 7.38±0.75 7.80±0.55* 7.88±0.89 7.68±0.73
数据为 10个单株重复的平均值±标准差。*表示转基因株系与对照差异显著(P < 0.05)。
Data are shown as Mean ± SD of 10 individual plants. * indicates significant difference between the transgenic lines and WT at P < 0.05.
WT: wild type (Zhoumai 23).
4个测定生育期转基因小麦株系10T(9)-225-4平均日
光合总量与对照周麦23相比均明显下降, 尤其在花后第7
天, 比对照下降13.93% (表3)。上述结果表明, 转基因小麦
株系10T(9)-225-4的光合效率低于对照周麦23。
2.6 旗叶 Pn对光强、CO2浓度的响应
转基因小麦株系10T(9)-225-4和对照周麦23的饱和光
强分别为1400.33 μmol m–2 s–1和1599.33 μmol m–2 s–1, 比
对照周麦23下降12.44% (图7-A); 羧化效率分别为0.055
和0.085, 较对照周麦23下降35.29%; CO2补偿点分别为
102.00 μmol mol–1和86.50 μmol mol–1, 较对照周麦23高
17.92% (图7-B)。上述结果表明, 与对照周麦23相比, 转基
因小麦株系10T(9)-225-4利用强光和同化CO2能力下降。
2.5 作用机制分析
2.5.1 气孔张开率和气孔导度变化 与对照周麦23相
比, 转基因小麦株系10T(9)-225-4的气孔并没有完全张开,
气孔张开率为43.54%, 比对照周麦23 (51.32%)下降了
15.16%。在气孔数量上两者无明显差异(图8)。转基因小
麦株系10T(9)-225-4的气孔导度为253.30 mmol m–2 s–1, 比
对照周麦23 (288.49 mmol m–2 s–1)下降了12.18%; 旗叶Pn
为22.85 μmol m–2 s–1, 比对照周麦23 (26.22 μmol m–2 s–1)
下降了12.85%。结果表明, 转基因小麦中气孔导度的下降
是其净光合速率降低的原因。
2.5.2 苹果酸和丙酮酸含量变化 与对照周麦23相比,
抽穗期转基因小麦株系10T(9)-225-4的苹果酸含量降低了
8.89%, 而丙酮酸含量则和25.00%, 差异达到显著水平(表
4)。结果表明, 转基因小麦气孔导度的下降可能是由于其
叶片中NADP-ME酶活性的增强, 使得苹果酸浓度降低造
成的。
2.5.3 喷施外源苹果酸旗叶Pn变化 喷施苹果酸前 ,
转基因小麦株系10T(9)-225-4的旗叶Pn为22.77 μmol m–2
s–1, 较对照周麦23 (26.67 μmol m–2 s–1)下降了12.20%, 差
异达到显著水平 ; 喷施苹果酸后 , 转基因小麦株系
10T(9)-225-4的Pn达到25.15 μmol m–2 s–1, 比喷施前提高
了9.46%, 但与喷施苹果酸后的对照周麦23 (26.98 μmol
m–2 s–1)相比两者无明显差异(图9)。外施苹果酸可恢复转
基因小麦的光合特性, 由此可见, 转基因小麦气孔导度的
图 7 转基因小麦旗叶净光合速率对光照强度(A)和胞间 CO2浓度(C)的响应曲线
Fig. 7 Response curves of photosynthesis to PPDF (A) and Ci (C) in transgenic wheat
表 4 转 NADP-ME小麦和非转基因对照苹果酸、丙酮酸含量比较
Table 4 Comparison of malic acid and pyruvate acid content between NADP-ME transgenic wheat and WT
株系
Line
苹果酸含量
Malic acid content (mg g–1)
丙酮酸含量
Pyruvate acid content (mg g–1)
WT 0.45±0.07 0.12±0.02
10T(9)-225-4 0.41±0.07* 0.15±0.01*
数据为 5片旗叶重复的平均值±标准差。*表示转基因株系与对照差异显著(P < 0.05)。WT: 受体对照(周麦 23).
Data are shown as mean ± SD of 5 individual flag leaves. * indicates significant difference between the transgenic lines and WT at P <
0.05. WT: wild type (Zhoumai 23).
606 作 物 学 报 第 42卷
图 8 400倍目镜下转基因小麦(A)和对照(B)旗叶气孔导度
Fig. 8 Stomatal conductance of the flag leaves in transgenic
wheat (A) and wild type (B) at a magnification of ×400
图 9 外施苹果酸后转基因小麦和对照(WT)旗叶净光合速率
比较
Fig. 9 Dynamic changes of exogenous malate on
photosynthetic rate in transgenic wheat and wild type (WT)
下降是由于叶肉细胞苹果酸含量下降所导致的 , 进而导
致其净光合速率下降。
3 讨论
自Ku等[5]利用农杆菌介导法获得转玉米全长PEPC基
因水稻后 , 世界各国研究人员开始将C4光合相关基因导
入到C3植物中, 以期提高C3植物的光合生产力, 改善其产
量潜力[31]。然而将C4光合关键酶基因引入C3植物中提高
光合效率的研究一直备受争议[2,7]。Hu等[13]研究表明, 转
玉米C4型PEPC基因小麦光合高达31.95 μmol m–2 s–1, 较
对照提高26%。Takeuchi等[20]将玉米C4型NADP-ME基因全
长cDNA导入水稻 , 转化植株的NADP-ME活性提高了至
少30倍, 叶绿体内高活性的NADP-ME可能影响了叶绿体
发育。Jiao等[32]研究发现, 转玉米C4型NADP-ME基因水稻
中NADP–ME的活性比对照提高了5倍, 达到玉米的50%,
但转基因水稻的光合效率仍然没有提高。迟伟等[22]的研
究也得到相似的结果。本研究以T3代转NADP-ME基因小
麦株系 10T(9)-1-1和 10T(9)-225-4为材料 , 证实外源
NADP-ME基因已整合到小麦基因组中, 并能够正常转录
和翻译; 在4个测定生育期转基因株系的NADP-ME酶活
性与对照周麦23相比均有所提高, 而净光合速率(Pn)则明
显下降; 尤其在花后第7天, 2个转基因株系的酶活性分别
较对照提高1.33倍和1.13倍 , 净光合速率 (Pn)分别下降
17.26%和10.35%; 籽粒产量和千粒重较对照下降显著。
光合速率的提高是一个复杂的过程 , 受诸多因素影
响。有研究表明, 转PEPC基因水稻光合速率增加可能是由
于PEPC过量表达促进了苹果酸的合成, 并通过苹果酸调
节了气孔保卫细胞的有机酸代谢, 提高了气孔导度[6,15]。迟
伟等[21]研究发现, 转NADP-ME基因水稻在强光下叶绿体
会积累大量还原性的NADPH, 过量的NADPH会造成大量
活性氧的产生, 进而对光反应系统PSII的反应中心进行破
坏, 使转基因植株光抑制作用增强。苹果酸和丙酮酸分别
是NADP-ME酶反应的底物和产物(即: L-苹果酸+ NADP +
→丙酮酸+CO2 + NADPH+H+), 而苹果酸在叶肉表皮细胞
具有调节气孔开闭的作用。陈根云等[33]用外源C4光合原
初产物OAA或MA饲喂C3菠菜叶片, 观察到其光合能力提
高。朱素琴等[34]在水稻上也得到相似的结果。本研究中,
用150 mmol L–1的苹果酸溶液处理转基因小麦及对照旗叶
后 , 两者旗叶Pn均有所提高 , 其中转基因小麦增幅最大
(9.46%), 对照略微提高。对转基因株系10T(9)-225-4的光
合效率降低的原因进行分析, 发现转NADP-ME基因小麦
中NADP-ME活性提高, 但是其气孔张开率和气孔导度下
降; 旗叶苹果酸含量显著低于对照周麦23, 而丙酮酸含量
则显著提高; 外施苹果酸则可提高其Pn值, 与对照基本接
近。由此可见, 转基因小麦气孔导度的下降可能是由于其
苹果酸含量的降低造成的, 进而导致其光合效率下降, 而
外施苹果酸可恢复其光合特性。
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