全 文 ：第９卷第１期
２０１１年１月
生　物　加　工　过　程
ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｐｒｏｃｅｓｓＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ．９Ｎｏ．１
Ｊａｎ．２０１１
ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７２－３６７８．２０１１．０１．００７
收稿日期：２０１０－０８－２３
基金项目：国家高技术研究发展计划（８６３计划）资助项目（２００６ＡＡ０２０３０１４１０）
作者简介：柴进凯（１９８４—），男，四川宜宾人，硕士研究生，研究方向：工业微生物；张伟国（联系人），教授，Ｅｍａｉｌ：ｚｈａｎｇｗｇ１６８＠１２６．ｃｏｍ
Ｌ 谷氨酰胺高产菌的选育和发酵条件
柴进凯，张伟国
（江南大学 工业生物技术教育部重点实验室，无锡 ２１４１２２）
摘　要：以嗜乙酰乙酸棒杆菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）ＬＧ ３为出发菌株，经紫外线（ＵＶ）和硫酸二乙酯
（ＤＥＳ）诱变处理，磺胺胍（ＳＧ）、高浓度（ＮＨ４）２ＳＯ４定向筛选，获得１株谷氨酰胺高产菌株ＬＧ ６５，在未经优化的条
件下摇瓶发酵７２ｈ可产谷氨酰胺４３５ｇ／Ｌ，比出发菌株的产量３２４ｇ／Ｌ提高了３４３％。在此基础上，对其发酵条
件进行优化，经７２ｈ摇瓶发酵产量可达４７～４８ｇ／Ｌ，７Ｌ发酵罐补料分批发酵４０ｈ可达５５ｇ／Ｌ。
关键词：育种；发酵；Ｌ谷氨酰胺；诱变
中图分类号：Ｑ８１５　　　　文献标志码：Ａ　　　　文章编号：１６７２－３６７８（２０１１）０１－００２９－０６
ＢｒｅｅｄｉｎｇｏｆＬｇｌｕｔａｍｉｎｅｈｉｇｈｐｒｏｄｕｃｉｎｇ
ｓｔｒａｉｎａｎｄｉｔｓｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ
ＣＨＡＩＪｉｎｋａｉ，ＺＨＡＮＧＷｅｉｇｕｏ
（ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＩｎｄｕｓｔｒｉａｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｏｆｔｈｅＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＥｄｕｃａｔｉｏｎ，ＪｉａｎｇｎａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｘｉ２１４１２２，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＴｈｅｏｒｉｇｉｎａｌｓｔｒａｉｎＬＧ３ｗａｓｍｕｔａｔｅｄｂｙｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔｒａｄｉａｔｉｏｎａｎｄｄｉｅｔｈｙｌｓｕｌｆａｔｅ，ａｎｄｓｃｒｅｅｎｅｄ
ｉｎｃｕｌｔｕｒｅｄｉｓｈｈａｖｉｎｇｈｉｇｈｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｓｕｌｆａｇｕａｎｉｄｉｎｅｏｒ（ＮＨ４）２ＳＯ４．ＡｓｔｒａｉｎＬＧ６５ｗａｓｏｂｔａｉｎｅｄ
ｆｏｒｐｒｏｄｕｃｉｎｇ４３５ｇ／ＬｏｆＬｇｌｕｔａｍｉｎｅ．Ｔｈｅｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｗｅｒｅｆｕｒｔｈｅｒｏｐｔｉｍｉｚｅｄ，ｔｈｅｙｉｅｌｄ
ｒｅａｃｈｅｄ４７－４８ｇ／Ｌｉｎｓｈａｋｅｒｆｌａｓｋｆｏｒ７２ｈａｎｄｒｅａｃｈｅｄ５５ｇ／Ｌｃｕｌｔｉｖａｔｅｄｉｎ７Ｌｆｅｒｍｅｎｔｏｒｆｏｒ４０ｈ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｂｒｅｅｄｉｎｇ；ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ；Ｌｇｌｕｔａｍｉｎｅ；ｍｕｔａｔｉｏｎ
　　Ｌ 谷氨酰胺（Ｌｇｌｕｔａｍｉｎｅ，简称 Ｌ Ｇｌｎ）是 Ｌ
谷氨酸γ 羧基酰胺化的必需氨基酸。临床上主要
用于治疗胃肠溃疡［１］、缓解运动疲劳［２］、调节免疫
力［３］、增强脑神经机能［４］以及辅助治疗癌症等，还
可以改善脑出血后的记忆障碍，促进智力低下儿童
的智力发育，防治癫痫病发作，是一种极有发展前
途的新药［５－６］。因此，Ｌ Ｇｌｎ作为医疗或食品保健
品，有着巨大的市场。
　　目前，全球的Ｌ Ｇｌｎ年产量已达１００００ｔ左右，
且呈增长趋势，但主要由日本等几个国家生产。我
国的生产规模仍处于小试或中试阶段，出口规模不
到１０００ｔ［７］，需加强Ｌ Ｇｌｎ工业生产菌株和工艺的
研究。国际上生产 Ｌ Ｇｌｎ均采用发酵法。Ｙａｍａｄａ
等［８］通过诱变获得了青霉素抗性突变株产黄菌
ＦＥＲＭ Ｐｎｏ．３６２８，Ｌ Ｇｌｎ生产能力由１０ｇ／Ｌ提高
到２５ｇ／Ｌ。汪世华等［９］以谷氨酸棒杆菌Ｓ９１１４为出
发菌株，经γ线和硫酸二乙酯（ＤＥＳ）诱变处理，定向
选育出 １株生产菌 ＳＨ４４，Ｌ Ｇｌｎ产量可积累达
４１４ｇ／Ｌ。李爽等［１０］以黄色短杆菌 ＳＧｒ和 ＤＯＮｒ抗
性菌株作为生产菌株，１６Ｌ罐中发酵４４ｈ后可产
Ｌ Ｇｌｎ５５２ｇ／Ｌ。汪世华等［１１］采用 γ线 ＤＥＳ γ
线进行复合诱变，筛选得到１株高产菌株 ＳＨ７７，Ｌ
Ｇｌｎ平均生产能力由８２ｇ／Ｌ提高到５５３ｇ／Ｌ，最高
达５６２ｇ／Ｌ，这是目前国内报道的最高产能。
　　本文采用紫外和化学诱变相结合的方法，经
高浓度的磺胺胍（ＳＧ）和（ＮＨ４）２ＳＯ４定向筛选，以
获得 １株 高 产 Ｌ Ｇｌｎ的 菌 株 ＬＧ ６５（ＳＧｒ，
（ＮＨ４）２ＳＯ
ｒ
４），并在７Ｌ发酵罐中发酵，考察其优化
后的发酵条件。
１　材料与方法
１．１　材料
１．１．１　菌种
　　嗜乙酰乙酸棒杆菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍａｃｅｔｏａｃｉ
ｄｏｐｈｉｌｕｍ）ＬＧ ３，笔者所在实验室保藏。
１．１．２　试剂
　　葡萄糖（工业级），山东西王生化科技有限公
司；玉米浆，华北制药康欣有限公司；（ＮＨ４）２ＳＯ４（工
业级），山东菱花味精股份有限公司；磺胺胍（ＳＧ），
美国Ｓｉｇｍａ公司；硫酸二乙酯（ＤＥＳ）、（ＮＨ４）２ＳＯ４
（分析纯），国药集团化学试剂有限公司。
１．１．３　仪器与设备
　　ＳＢＡ ４０Ｃ生物传感分析仪，山东省科学院生
物研究所；ＵＶ ２１００可见紫外分光光度计，上海尤
尼克有限公司；往复式摇床，无锡查桥轻机厂；
ＰＨＳ ３Ｃ型精密 ｐＨ计，上海雷磁仪器厂；７Ｌ发酵
罐，高百特发酵机（上海）有限公司。
１．１．４　培养基
　　基本培养基（ｇ／Ｌ）：葡萄糖２０，（ＮＨ４）２ＳＯ４１５，
ＫＨ２ＰＯ４１，Ｋ２ＨＰＯ４·３Ｈ２Ｏ１，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ０１，
ＭｎＳＯ４·４Ｈ２Ｏ００１，ＦｅＳＯ４·７Ｈ２Ｏ００１，尿素 １５，琼
脂 ２０，生物素 ０００００３，ＶＢ１０００００４。
　　完全培养基 （ｇ／Ｌ）：葡萄糖 ５，牛肉膏 １０，蛋白
胨 １０，酵母膏 ５，ＮａＣｌ５，琼脂 ２０。
　　种子培养基（ｇ／Ｌ）：葡萄糖 ２５，Ｋ２ＨＰＯ４·３Ｈ２Ｏ
１，ＫＨ２ＰＯ４１，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ０５，玉米浆３０，尿素５。
　　摇瓶发酵培养基（ｇ／Ｌ）：葡萄糖１４０，玉米浆１２，
（ＮＨ４）２ＳＯ４７０，ＫＨ２ＰＯ４·３Ｈ２Ｏ２，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ０５，
ＭｎＳＯ４·Ｈ２Ｏ００１，ＣｕＳＯ４·５Ｈ２Ｏ０００１，ＺｎＳＯ４·７Ｈ２Ｏ
０００１，ＶＢ１·ＨＣｌ０００１，ＶＨ０００００３，ＣａＣＯ３５０。
　　上罐发酵培养基（ｇ／Ｌ）：葡萄糖 １００，玉米浆
１２，（ＮＨ４）２ＳＯ４７０，ＫＨ２ＰＯ４·３Ｈ２Ｏ２，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ
０５，ＭｎＳＯ４·Ｈ２Ｏ００１，ＣｕＳＯ４·５Ｈ２Ｏ００１，ＺｎＳＯ４·
７Ｈ２Ｏ０００１，ＶＢ１·ＨＣｌ０００１，ＶＨ０００００３。另加消
泡剂０１５ｍＬ／Ｌ。
　　将（ＮＨ４）２ＳＯ４配制成４００ｇ／Ｌ的溶液，用ＮａＯＨ
溶液调节ｐＨ为７０，与发酵液分开灭菌，接种前与
发酵液混合。所有培养基灭菌前用 ＮａＯＨ溶液调
ｐＨ为 ７０～７２，种子培养基、基本培养基和完全培
养基在０１ＭＰａ下灭菌２０ｍｉｎ，发酵培养基在００７
ＭＰａ下灭菌１５ｍｉｎ。
１．２　方法
１．２．１　培养方法
　　１）斜面、平板培养方法　在３０℃培养箱里培
养２０～２４ｈ。
　　２）摇瓶培养方法　种子培养：５００ｍＬ三角瓶中
装液１００ｍＬ，于往复式摇床上３０℃、９０ｒ／ｍｉｎ振荡
培养７～８ｈ。
　　摇瓶发酵培养：５００ｍＬ三角瓶中总装液２０ｍＬ，
接种前加入（ＮＨ４）２ＳＯ４使其质量浓度为７０ｇ／Ｌ，接
一环菌体或 ２ｍＬ种 子 液 于 往 复 式 摇 床 上
１００ｒ／ｍｉｎ、３０℃培养７２ｈ。
　　３）７Ｌ发酵罐培养方法　总装液量４Ｌ，接种前
加入（ＮＨ４）２ＳＯ４溶液使其质量浓度为７０ｇ／Ｌ，接种
量１０％，通风２Ｌ／ｍｉｎ，调节搅拌转速使溶氧８ｈ前
维持在 １０％ ～１５％，之后使溶氧维持在 １８％ ～
２５％；前期调节ｐＨ为７２，８ｈ后调节ｐＨ为５５５～
５６０，发酵过程中流加８００ｇ／Ｌ葡萄糖溶液使其残
糖质量浓度维持在４０～５０ｇ／Ｌ，后期不再补糖使发
酵结束时残糖质量浓度在１０ｇ／Ｌ以下，发酵４０～
４５ｈ结束。
１２．２　诱变方法
　　紫外诱变和常规化学诱变法［１２］。
１．２．３　筛选方法
　　１）平板筛选　把诱变的菌液分别涂布于含 ＳＧ
和（ＮＨ４）２ＳＯ４的基本培养基上，３０℃下培养 ３～４
ｄ，挑出长势较好的单菌落进行摇瓶筛选。
　　２）摇瓶筛选　初筛：将诱变得到的单菌落分别
接环于２０ｍＬ摇瓶发酵液中培养，挑出产酸较高的
菌株。复筛：将初筛得到的菌株接于种子液中，培
养７～８ｈ，再将种子液分别接种于３个摇瓶发酵液
中进行摇瓶发酵，测出产量，挑出高产菌株。
１．２．４　分析方法
　　１）ｐＨ的测定　国产精密 ｐＨ试纸和 ＰＨＳ ３Ｃ
型精密ｐＨ计测定。
　　２）ＯＤ的测定　取０２ｍＬ发酵液用０２５ｍｏｌ／Ｌ
ＨＣｌ溶液稀释２５倍，于５６２ｎｍ测吸光度。
　　３）发酵液中还原糖含量的测定　采用 ＳＢＡ
０３ 生　物　加　工　过　程　　 第９卷　
４０Ｃ生物传感分析仪测定。
　　４）发酵液中Ｌ Ｇｌｎ含量的测定　纸层析法［１３］
和酸解酶膜联用法［１４］测定。
２　结果与讨论
ＳＧ是对氨基苯甲酸的结构类似物，能通过阻碍
叶酸的合成，从而间接抑制 ＡＴＰ。若菌种具有 ＳＧ
抗性，便能解除这种抑制，从而提高细胞中 ＡＴＰ的
含量，促进Ｌ Ｇｌｎ的生成。谷氨酸在谷氨酰胺合成
酶（ＧＳ）的作用下结合一个 ＮＨ＋４后生成 Ｌ Ｇｌｎ，高
浓度的ＮＨ＋４是 Ｌ Ｇｌｎ大量合成的必要条件，但是
过量的ＮＨ＋４对ＧＳ有阻遏作用，所以选育具有 ＮＨ
＋
４
抗性的突变株，可解除对 ＧＳ的阻遏，从而有利于
Ｌ Ｇｌｎ的合成。
２．１　Ｌ Ｇｌｎ高产菌株的选育与抗性比较
２．１．１　Ｌ Ｇｌｎ高产菌株的选育
　　ＬＧ ３经ＵＶ和ＤＥＳ诱变，再经ＳＧ平板、高浓
度（ＮＨ４）２ＳＯ４平板筛选和摇瓶发酵，得到１株具有
ＳＧ抗性和高浓度（ＮＨ４）２ＳＯ４抗性的突变株
ＬＧ ６５，在未经优化的条件下，可生产 Ｌ Ｇｌｎ
４３５ｇ／Ｌ。
２１．２　ＬＧ ３与ＬＧ ６５抗性比较
　　把ＬＧ ３与ＬＧ ６５分别涂布于含不同浓度梯
度的 ＳＧ、（ＮＨ４）２ＳＯ４抗性平板上，培养温度为
３０℃，４８ｈ后发现 ＬＧ ６５能分别在 ３００ｍｇ／Ｌ的
ＳＧ平板和８０ｇ／Ｌ（ＮＨ４）２ＳＯ４的平板上生长，其抗
性与出发菌株ＬＧ ３相比有了很大提高，结果见表
１和表２。
表１　ＬＧ ３与ＬＧ ６５的ＳＧ抗性比较
Ｔａｂｌｅ１　ＳＧｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｏｆＬＧ３ａｎｄＬＧ６５
ρ（ＳＧ）／
（ｍｇ·Ｌ－１）
生长状况
ＬＧ ３ ＬＧ ６５
１００ ＋ ＋＋
１５０ ＋ ＋＋
２００ － ＋＋
２５０ － ＋＋
３００ － ＋
３５０ － ±
４００ － －
　　　　　注：＋＋、＋、±、－分别表示生长良好、生长、
微弱生长和不生长。
表２　ＬＧ ３与ＬＧ ６５的（ＮＨ４）２ＳＯ４抗性比较
Ｔａｂｌｅ２　（ＮＨ４）２ＳＯ４ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｏｆＬＧ３ａｎｄＬＧ６５
ρ（（ＮＨ４）２ＳＯ４）／
（ｇ·Ｌ－１）
生长状况
ＬＧ ３ ＬＧ ６５
６０ ＋＋ ＋＋
６５ ＋ ＋＋
７０ ± ＋＋
７５ － ＋＋
８０ － ＋
８５ － ±
９０ － －
　　　　　注：＋＋、＋、±，－分别表示生长良好、生长、
微弱生长和不生长。
２．１．３　ＬＧ ６５的遗传稳定性
　　将突变株 ＬＧ ６５在斜面上连续传代５次，进
行摇瓶试验考察，结果如表３所示。由表３可知：
ＬＧ ６５经过传代５次，遗传标记和产酸能力的稳定
性依然良好，可供进一步研究。
表３　ＬＧ ６５的遗传稳定性
Ｔａｂｌｅ３　ＧｅｎｅｔｉｃｓｔａｂｉｌｉｔｙｏｆＬＧ６５
传代数 遗传标记 ρ（ＬＧｌｎ）／（ｇ·Ｌ－１）
１ ＋ ４３２
２ ＋ ４３５
３ ＋ ４３３
４ ＋ ４３８
５ ＋ ４２８
　　　　　注：＋表示具有“ＳＧｒ、（ＮＨ４）２ＳＯｒ４”遗传标记。
２．２　发酵培养基对产Ｌ Ｇｌｎ的影响
２．２．１　葡萄糖质量浓度对产Ｌ Ｇｌｎ的影响
　　在发酵过程中，菌体的生长受到底物浓度的影
响。当培养基中的葡萄糖浓度增加到一定量时，会
对菌体生长和产酸产生抑制作用。本实验采用不
同起始糖浓度进行摇瓶发酵，后期补加８００ｇ／Ｌ葡
萄糖，使其质量浓度３０ｈ前维持在４０～５０ｇ／Ｌ。
　　从图１可以看出：当初糖质量浓度小于１４０ｇ／Ｌ
时，产酸和ＯＤ随着初糖质量浓度的增加而有所上
升；当初糖质量浓度大于１４０ｇ／Ｌ时，菌体生长明显
受到抑制，产酸也相应降低，所以采用初糖质量浓
度为１４０ｇ／Ｌ。
１３　第１期 柴进凯等：Ｌ谷氨酰胺高产菌的选育和发酵条件
图１　葡萄糖质量浓度对产Ｌ Ｇｌｎ的影响
Ｆｉｇ．１　ＥｆｅｃｔｓｏｆＧｌｕｃｏｓｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｎ
ｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆＬＧｌｎ
２．２．２　玉米浆质量浓度对产Ｌ Ｇｌｎ的影响
　　玉米浆（ＣＳＬ）是一种用亚硫酸（Ｈ２ＳＯ３）浸泡玉
米后得到的浸泡水浓缩物，含有丰富的氨基酸、核
酸、维生素、无机盐等。玉米浆的成分因玉米原料
来源及处理方法而不同，每批均需进行小型实验以
确定其用量［１５］。
　　采用不同质量浓度的玉米浆进行摇瓶发酵，结
果见图２。从图２可知：随着玉米浆质量浓度的增
加，菌体质量浓度也开始了迅速的增长，而副产物
谷氨酸（Ｌ Ｇｌｕ）的产量有所降低。但 Ｌ Ｇｌｎ的产
量并不是一直在增加，而是在玉米浆为１２５ｇ／Ｌ时
达到最大值４４６ｇ／Ｌ；继续增大玉米浆的质量浓度，
Ｌ Ｇｌｎ的产量开始降低。
图２　玉米浆质量浓度对产Ｌ Ｇｌｎ的影响
Ｆｉｇ．２　ＥｆｅｃｔｓｏｆＣＳＬｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｎ
ｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆＬＧｌｎ
２．２．３　（ＮＨ４）２ＳＯ４质量浓度对产Ｌ Ｇｌｎ的影响
　　（ＮＨ４）２ＳＯ４不仅为菌体生长提供了 Ｎ源，同时
也为Ｌ Ｇｌｎ的顺利合成提供了所必需的 ＮＨ４
＋，如
果ＮＨ４
＋浓度不足，将影响由谷氨酸到 Ｌ Ｇｌｎ的转
化；若（ＮＨ４）２ＳＯ４的浓度太高，对发酵液的后处理即
提取精制带来困难，且容易影响提取的收率［１０］。
　　从图３可以看出：当（ＮＨ４）２ＳＯ４的质量浓度为
７０ｇ／Ｌ时，Ｌ Ｇｌｎ的产量最大，达４４８ｇ／Ｌ。
图３　（ＮＨ４）２ＳＯ４质量浓度对产Ｌ Ｇｌｎ的影响
Ｆｉｇ．３　Ｅｆｅｃｔｓｏｆ（ＮＨ４）２ＳＯ４ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｎｔｈｅ
ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆＬＧｌｎ
２．２．４　ｐＨ对产Ｌ Ｇｌｎ的影响
　　Ｌ Ｇｌｎ在积累过程中也会在谷氨酰胺酶的作
用下降解为谷氨酸。谷氨酰胺酶的最适 ｐＨ在６２
附近，低于５８或高于６８，酶活都会明显降低［１６］。
本实验分别采用ｐＨ为５２、５６、６０为条件在７Ｌ发
酵罐上发酵培养４０ｈ，结果见图４。从图４可以看
出，ｐＨ５６更有利于Ｌ Ｇｌｎ的积累。
图４　ｐＨ对产Ｌ Ｇｌｎ的影响
Ｆｉｇ．４　ＥｆｅｃｔｓｏｆｐＨｏｎｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆＬ Ｇｌｎ
２．２．５　摇床转速对产Ｌ Ｇｌｎ的影响
　　由葡萄糖生物合成Ｌ Ｇｌｎ时，需要消耗大量的
ＡＴＰ。如果合成过程中的溶氧过低，产能不够，代谢
转向由丙酮酸生物合成乳酸的方向，此时产 Ｌ Ｇｌｎ
受到抑制；溶氧过高时，葡萄糖进入完全氧化体系
进行代谢（三羧酸循环），不利于 α 酮戊二酸进一
步产生还原氨基化的反应［１７］，从而使 Ｌ Ｇｌｎ的产
量降低。
　　采用振幅为８ｃｍ的摇床分别在不同转速下进
行摇瓶发酵，结果见图 ５。从图 ５可知：当转速为
１００ｒ／ｍｉｎ时，对积累Ｌ Ｇｌｎ最有利。
２３ 生　物　加　工　过　程　　 第９卷　
图５　摇床转速对产Ｌ Ｇｌｎ的影响
Ｆｉｇ．５　ＥｆｅｃｔｓｏｆｓｈａｋｅｒｓｐｅｅｄｏｎｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆＬＧｌｎ
２．２．６　正交实验
　　根据单因素实验结果，对４个因素进行正交实
验，结果如表４、表５所示。实验结果表明：影响 Ｌ
Ｇｌｎ积累的各因素主次顺序为玉米浆质量浓度、转
速、（ＮＨ４）２ＳＯ４质量浓度、葡萄糖质量浓度。实验所
得最佳结果为 Ａ２Ｂ３Ｃ２Ｄ２。在该组合条件下重复实
验３批，得到 Ｌ Ｇｌｎ产量分别为 ４７５、４６８、４７８
ｇ／Ｌ，其平均产量高于正交组合的实验结果。因此，
可得摇瓶发酵的最佳组合条件为葡萄糖１４０ｇ／Ｌ、
（ＮＨ４）２ＳＯ４７０ｇ／Ｌ、玉米浆１２ｇ／Ｌ、转速１００ｒ／ｍｉｎ。
表４　Ｌ９（３
４）正交实验的设计与结果
Ｔａｂｌｅ４　Ｌ９（３
４）ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｄｅｓｉｇｎａｎｄｒｅｓｕｌｔ
实验号
因　　素
Ａ
ρ（葡萄糖）／
（ｇ·Ｌ－１）
Ｂ
ρ（（ＮＨ４）２ＳＯ４）／
（ｇ·Ｌ－１）
Ｃ
ρ（玉米浆）／
（ｇ·Ｌ－１）
Ｄ
摇床转速／
（ｒ·ｍｉｎ－１）
ρ（Ｌ Ｇｌｎ）／
（ｇ·Ｌ－１）
１ １３５ ６０ １１ ９５ ４１２
２ １３５ ６５ １２ １００ ４６８
３ １３５ ７０ １３ １０５ ４０４
４ １４０ ６０ １２ １０５ ４４２
５ １４０ ６５ １３ ９５ ４１７
６ １４０ ７０ １１ １００ ４４５
７ １４５ ６０ １３ １００ ４１４
８ １４５ ６５ １１ １０５ ３８８
９ １４５ ７０ １２ ９５ ４７３
表５　正交实验结果分析
Ｔａｂｌｅ５　Ａｎａｌｙｓｉｓｏｆｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｄｅｓｉｇｎ
误差源 Ａ Ｂ Ｃ Ｄ
Ｋ１ １２８４ １２６８ １２４５ １３０２
Ｋ２ １３０４ １２７３ １３８３ １３１７
Ｋ３ １２７５ １３２２ １２３５ １２３４
Ｒ（极差） ２９ ５４ １４８ ８３
２．３　７Ｌ发酵罐实验
　　图６为ＬＧ ６５在７Ｌ发酵罐上的发酵过程曲
线。从图６可以看出：菌体没有明显的延滞期，发
酵从一开始，菌体便迅速增长，随着菌体质量浓度
的增大，耗糖速率逐渐增加，０～１２ｈ产 Ｌ Ｇｌｎ的
量很少；１２～３２ｈ为菌体稳定生长期，耗糖和产
Ｌ Ｇｌｎ的速率都明显加快；３２～４０ｈ为衰亡期，此
阶段 ＯＤ逐渐降低，耗糖速率也有所减缓，直至发
酵结束。４０ｈ产Ｌ Ｇｌｎ产量为 ５５ｇ／Ｌ，糖酸转化
率为３４４％。
图６　７Ｌ发酵罐产Ｌ Ｇｌｎ的发酵过程曲线
Ｆｉｇ．６　Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｃｏｕｒｓｅｃｕｒｖｅｓｏｎ７Ｌｆｅｒｍｅｎｔｏｒ
３３　第１期 柴进凯等：Ｌ谷氨酰胺高产菌的选育和发酵条件
３　结　论
　　以 ＬＧ ３为出发菌株，经 ＵＶ和 ＤＥＳ诱变处
理，ＳＧ、高浓度（ＮＨ４）２ＳＯ４定向筛选后，获得１株高
产Ｌ Ｇｌｎ的菌株ＬＧ ６５，在未经优化的条件下，摇
瓶发酵７２ｈ，可产Ｌ Ｇｌｎ４３５ｇ／Ｌ。
　　经过对培养基各组分及发酵条件的优化，可使其
产量经７２ｈ摇瓶发酵后达到４７～４８ｇ／Ｌ，７Ｌ发酵罐补
料分批发酵４０ｈ后达到５５ｇ／Ｌ。优化后的培养基：葡
萄糖１４０ｇ／Ｌ，玉米浆１２ｇ／Ｌ，（ＮＨ４）２ＳＯ４７０ｇ／Ｌ。
参考文献：
［１］　ＲｅｅｄｓＰＪ，ＢｕｒｉｎＤＧ．Ｇｌｕｔａｍｉｎｅａｎｄｔｈｅｂｏｗｅｌ［Ｊ］．ＪＮｕｔｒ，
２００１，１３１：２５０５２５０８．
［２］　ＲｅｎｎｉｅＭＪ，ＡｈｍｅｄＡ，ＥｈｏｇａｌｉｓＥＯ，ｅｔａｌ．Ｇｌｕｔａｍｉｎｅｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ
ａｎｄｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｓｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅａｎｄｈｅａｒｔａｎｄｔｈｅｉｒｃｌｉｎｉｃａｌｒｅｌｅ
ｖａｎｃｅ［Ｊ］．ＪＮｕｔｒ，１９９６，１２６：１１４２１１４９．
［３］　ＮｅｗｓｈｏｌｍｅＰ．ＷｈｙｉｓＬｇｌｕｔａｍｉｎｅｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｉｍｐｏｒｔａｎｔｔｏｃｅｌｓ
ｏｆｔｈｅｉｍｍｕｎｅｓｙｓｔｅｍｉｎｈｅａｌｔｈ，ｐｏｓｔｉｎｊｕｒｙ，ｓｕｒｇｅｒｙｏｒｉｎｆｅｃｔｉｏｎ
［Ｊ］．ＪＮｕｔｒ，２００１，１３１：２５１５２５２２．
［４］　ＮｅｕＪ．ＧｌｕｔａｍｉｎｅｉｎｔｈｅｆｅｔｕａｎｄｃｒｉｔｉｃａｌｙＩＩｌｏｗｂｉｒｔｈｗｅｉｇｈｔｎｅ
ｏｎａｔｅ：ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍａｎｄｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆａｃｔｉｏｎ［Ｊ］．ＪＮｕｔｒ，２００１，
１３１：２５８５２５８９．
［５］　ＶａｎｄｅｒＨｕｌｓｔＲＲ，ＶａｎＫｒｅｅｌＢＫ，ＶｏｎＭｅｙｅｎｆｅｌｄｔＭＦ，ｅｔａｌ．
Ｇｌｕｔａｍｉｎｅａｎｄｔｈｅｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎｏｆｇｕｔｉｎｔｅｇｒｉｔｙ［Ｊ］．Ｌａｎｃｅｔ，１９９３，
３４１：１３６３１３６５．
［６］　ＳｏｕｂａＷＷ，ＨｅｒｓｋｏｗｉｔｚＫ，ＡｕｓｔｇｅｎＴＲ，ｅｔａｌ．Ｇｌｕｔａｍｉｎｅｎｕｔｒｉ
ｔｉｏｎ：ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎａｎｄｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｉｍｐａｃｔ［Ｊ］．ＪＰａｒｅ
ＥｎｔｅＮｕｔｒ，１９９０，１４（Ｓ）：２３７５２４３５．
［７］　汤亚杰，张伟，李红梅，等．发酵法生产 Ｌ 谷氨酰胺研究进展
［Ｊ］．食品科学，２００８，２９（３）：４９９５０３．
［８］　ＹａｍａｄａＳ，ＮａｂｅＫ，ＵｊｉｍａｒｕＴ，ｅｔａｌ．ＬＧｌｕｔａｍｉｎｅｆｏｒｍａｔｉｏｎｂｙ
Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｒｉｇｅｎｓｅ［Ｊ］．ＡｐｐｌＥｎｖｉｒｏｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９７９，３７：
１０６３１０６６．
［９］　汪世华，白文钊，吴思方，等．Ｌ 谷氨酰胺高产菌株的诱变育
种［Ｊ］．食品科学，２００２，２３（３）：６４６７．
［１０］　李爽，章健，解云峰，等．谷氨酰胺发酵条件的研究［Ｊ］．工业
微生物，１９９８，２８（４）：７１０．
［１１］　汪世华，白文钊，吴思方，等．Ｌ 谷氨酰胺高产菌株的定向选
育及产胺条件的研究［Ｊ］．微生物学报，２００２，４２（６）：
７５１７５４．
［１２］　诸葛健，王正祥．工业微生物实验技术手册［Ｍ］．北京：中国
轻工业出版社，１９９４：３８３３９４．
［１３］　杨梅，张伟国．Ｌ谷氨酰胺高产菌株的选育和发酵条件优化
［Ｊ］．无锡轻工大学学报，２００４，２３（２）：８２８５．
［１４］　陈奎发，蒋楠，杨艳，等．酸解 酶膜联用法检测谷氨酰胺［Ｊ］．
食品与发酵工业，２００２，２８（９）：２６２８．
［１５］　陈宁．氨基酸工艺学［Ｍ］．北京：中国轻工业出版社，
２００７：８３．
［１６］　韩铭海，赵娟娟，华盛龙，等．一株高产谷氨酰胺酶菌株的鉴
定和酶活特性的研究 ［Ｊ］．大豆科学，２００８，２７（６）：
１０３７１０４０．
［１７］　张伟国，钱和．氨基酸生产技术及应用［Ｍ］．北京：中国轻工
业出版社，１９９７：
櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒
５０．
国内简讯
稳定无活性维甲酸Ｘ受体（ＲＸＲ）四聚体构象的天然小分子首次被发现
中国科学院上海药物研究所沈旭课题组与蒋华良及胡立宏课题组合作，博士研究生张海涛与周蓉（华
东理工大学药学院联合培养硕博生）等发现天然产物 Ｄａｎｔｈｒｏｎ是 ＲＸＲａ特异性拮抗剂，并获得了 ＲＸＲａ
ＬＢＤ／Ｄａｎｔｈｒｏｎ复合物晶体，成功解析了其结构，这是国际上 ＲＸＲ与其拮抗剂复合物晶体结构的首例报道，
研究发现的Ｄａｎｔｈｒｏｎ采用稳定无活性ＲＸＲ受体四聚体构象方式拮抗 ＲＸＲａ的转录激活。研究所取得的成
果将为ＲＸＲ拮抗剂的设计筛选提供新的重要研究思路。此外，由于Ｄａｎｔｈｒｏｎ是中药大黄的主要成分之一，
大黄曾被发现具有抗糖尿病和抗癌的作用，但其作用机制尚不明确，因此该项研究还为中药大黄有效成分
的相应药理作用提供了相关作用靶点信息。
向具超凡转化利用能力的白蚁学习造“生物反应器”
能源短缺和环境污染，是当前人类面临的重大挑战。生物质资源在解决这２个问题方面潜力巨大。然而，生
物质的高效、经济转化问题“久攻不克”，已成为当前困扰国际科学界和产业界的公认难题。江苏大学特聘教授孙
建中认为，以白蚁为代表的肠道消化系统是世界上最小但又非常高效的“生物反应器”，对木质纤维素具有超凡的
转化利用能力，整合多学科力量研究和探索，以白蚁为代表的自然界生物高效转化系统的仿生理论和技术途径，有
可能帮助我们解决困扰多年的生物质高效转化中的相关基础理论和关键核心技术问题。
（文伟河）
４３ 生　物　加　工　过　程　　 第９卷