全 文 ：Nov．2008
·52·
生物加工过程
ChineseJournalofBioprocessEngineering
第6卷第6期
2008年11月
聚氨酯泡沫固定产脂肪酶粗状假丝酵母
(Candidavalida12)细胞的研究
欧阳军梅，段学辉，傅 奇，牛春铃
(南昌大学食品科学与技术国家重点实验室，南昌330031)
摘要：对聚氨酯泡沫固定产脂肪酶粗状假丝酵母(Candidavalida12)细胞的固定化条件进行了研究。实验结果
表明，聚氨酯泡沫颗粒经密度和粒径筛选，酸碱处理，以及固液比优化，载体固定细胞干质量比达到l571ms／g，细
胞脂肪酶的酶活为每克干细胞l415U。电镜图片显示粗状假丝酵母茵(Cand／dava／／dal2)在载体孔隙内和脊壁上
缠绕充盈，生长良好，固定结构稳定。固定化细胞连续催化水解桐籽油5批次，细胞相对水解酶活保持率迭73％。
固定细胞的损失率为12．5％。固定化细胞颗粒显示出良好的操作稳定性和酶活保持率，为进一步的应用研究提供
了实验基础。
关键词：粗状假丝酵母；固定化细胞；脂肪酶；聚氨酯泡沫
中图分类号：TQ925+．6 文献标志码：A 文章编号：1672—3678(2008)06—0052—06
Immobilizationoflipase-producingcellsofCandidavalidaT2
withpolyurethanefoams
OUYANGJun-mei，DUANXue-hui，FUQi，NIUChun-ling
(StateK yLaboratoryofFoodScienceandTechnology，NanchangUniversity，Nanchang330031，China)
Abstract：Theimmobilizationcond tionsoflipase-producingcellsofCand／davalidaI"2withpolyurethane
foamwereinvestigated．Ther sultss owedthatthecelloadofpolyurethanefo mreached1 415ms／g
andthelipasea tivityof hedrycellachieved1 255U／gaftertheoptimizationof heconditionsonthe
carrierd nsity，theparticlesize，thepr treatmentprocedure，andtheratioofsolidcarriertofermentation
broth．Scanningelectricm roscopeshowedthemyceliumCand／davalida，12enlacedorfiHedintherib
andontheinnerwallofthecarriercavity．TheimmobilizedCand／daval／dar12cellsgrewwellandcolony
configurationw stable．Inacatalyzedhydrolysisoftungoilbytheimmobilizedcells，theenzymaticc-
tivityremained73％．andtheachratewas12．5％afterfiveepeatreactions．
Keywords：Candidaval T2；immobilizedcell；lipase；polyurethanefoam
生物柴油是典型的“绿色能源”，发展生物柴油
对推进能源替代，减轻石化能源压力，控制城市大
气污染具有重要意义。目前，生物柴油的生产方法
主要有化学法和生物酶法。由于商业化的脂肪酶
成本较高，许多研究者都致力于用固定化方法来降
低生产成本。固定化细胞是在固定化酶基础上发
收稿日期：2008-04-01
基金项目：江西省科技攻关资助项目(2004180103000)。
作者简介：欧阳军梅(1979一)，女，江西九江人，硕士研究生，研究方向：食品生物技术。
联系人：段学辉，教授，E-mail：xhduan@IIUC．edu．crlo
万方数据
2008年11月欧阳写割每等：聚氨酯泡沫固定产暗肪酶魍愀酵压K饧砌渤m／／dav2)细胞的研究·53·
展起来的新技术，比固定化酶工艺简单，可免除酶
的提取纯化，保持细胞活力，进行连续催化发酵，有
利于提高生产能力，降低成本，提高产物分离纯化
效率⋯，在一些应用领域显示出明显的优越性。
载体选择是固定化技术的关键，目前常用的载
体有聚氨酯泡沫(polyurethanefoam，PUF)，多孔玻
璃、聚乙烯醇等。其中，PUF作为新型固定载体材
料显示出一定的优势心]。Ory等旧】比较了木块、多
孔玻璃和PUF固定化培养醋酸杆菌的效果，结果显
示PUF载体能在最短时间内固定更多的醋酸杆菌
细胞。另外，PUF作为固定化细胞载体在生物柴油
制备领域也得到了应用。Ban等H1将丙酮干燥过的
产脂肪酶的米根霉IF04697细胞固定在PUF颗粒
内，直接用来催化大豆油生产生物柴油。假丝酵母
(Candidasp．)是国内外研究较多的产脂肪酶菌种。
本文以PUF为载体，固定一株产脂肪酶的菌株Can—
didavalidaT2细胞，研究固定化条件对载体固定细
胞生物量及细胞产脂肪酶活性的影响，以及固定化
细胞重复使用的稳定性。
1材料与方法
1．1试验材料
1．1．1菌种
粗状假丝酵母(Candidavalida12)：由本实验
室保藏。
1．1．2培养基
斜面培养基：麦芽汁培养基；
种子培养基(g／L)：蔗糖20．0，蛋白胨5．0，
NaCI2．0，K2HP042．0，酵母浸膏5．0；
发酵培养基(g／L)：橄榄油15．0，黄豆粉30．0，糊
精5．0，NH。N031 ．0，Mgs04·7H201．0，l(2HP04
2．0，Tween800．50
上述培养基在121℃湿热灭菌25min，冷却后
备用口】。其中，发酵培养基中加入一定量的PUF后
灭菌。
1．2细胞固定化方法
以无菌操作将斜面菌种接种到60mL种子培养
基中，于30℃，120r／min下培养26h。然后按10％
的接种量接入到100mL加有PUF的发酵培养基
中，在30℃，160r／rain发酵48h，假丝酵母进入或
依附于PUF内壁生长，将固定细胞的载体与发酵液
过滤分离，生理盐水清洗3次，30℃风干，得到固定
化细胞，4℃保藏待用。
1．3 固定化载体处理及制备
市售聚氨酯泡沫，剪成小立方体，沸水煮30
min，去离子水清洗3次，烘箱烘干备用。
1．3．1聚氨酯泡沫预处理
将经过制粒、煮沸、烘干的聚氨酯泡沫按下述
方法处理，考察载体生物量的固定能力和固定化细
胞的酶活性。
1)直接使用。
2)酸处理：将聚氨酯泡沫浸在5％HCl溶液中
24h，去离子水洗至中性，烘干备用。
3)碱处理：将聚氨酯泡沫浸在5％NaOH溶液
中24h，去离子水洗至中性，烘干备用。
4)先酸处理，再用碱处理：将聚氨酯泡沫浸在
5％HCI溶液中24h，去离子水洗至中性，然后将其
浸入5％NaOH溶液中24h，洗至中性，烘干备用。
5)先碱处理，再用酸处理：将聚氨酯泡沫浸在
5％NaOH溶液中24h。去离子水洗至中性，然后将
其浸入5％HCI溶液中24h，洗至中性，烘干备用。
1．3．2载体颗粒的制备
将聚氨酯泡沫(密度为27kr／m3)分别制成边
长为10、8、6、4、2mm的立方体小块颗粒，各取0．2
g分别加入到装有100mL发酵培养基的摇瓶内，灭
菌，接种和发酵培养。
1．4分析方法
1．4．1细胞脂肪酶活力测定
NaOH滴定法测酶活【6J。
酶活力定义：40℃条件下，油脂水解反应15
rain，每分钟催化脂肪水解产生lo,mol脂肪酸的脂
肪酶量定义为一个脂肪酶单位(U)。
1．4．2载体固定的生物量测定
载体固定的生物量测定采用干质量法【7J。
1．4．3扫描电镜试样制备
根据文献[8]制备试样。
1．4．4水解率的测定一1
取水解物试样按酸值测定方法[1叫测定酸值，水
解率计算为：
V一仉
水解率=}—早×100％
oV一^P
式中：K、％分别为水解物样品在￡时刻的酸值和初
始酸值；S¨A，分别为桐籽油的皂化值和初始酸值
(折算为相同的底物量)
万方数据
·54· 生物加工过程 第6卷第6期
2结果与讨论
2．1 载体因素对细胞固定化的影响
2．1．1聚氨酯泡沫预处理的作用
通常聚氨酯泡沫中会残留一些对微生物生长
有危害的化学成分，需进行预处理清除，同时适当
的处理可使聚氨酯泡沫基料中的一些化学基团活
化，或改变其表面的粗糙度，从而有利于菌体的生
长和固定旧J。将不同方式处理的聚氨酯泡沫(密度
为27kg／m3，边长为8mm的立方体小块颗粒)各
0．2gg另lJJD入到装有100IllL发酵培养基的摇瓶内，
灭菌，接种和发酵培养。
实验结果如图1、图2所示。
囊蒿400k舢避 } I j l i鼍}囵目 囝 囡 臼
l ooo
瑚{800
霉
盏摹枷
嚣莹枷
篷200
O
l一直接使用；2一酸处理；3一碱处理；
4一先酸后碱处理；5一先碱后酸处理
图2酸碱处理对载体固定细胞生物量的影响
Fig．2EffectofPUFcarrierstreatedwithacid
01"basethimmobilizedcelbiomass
由图l、图2可知，载体处理方式不同，对聚氨
酯泡沫固定细胞生物量的影响不大，但对细胞产酶
的影响明显，说明单一的酸碱处理或煮沸处理无法
去除聚氨酯泡沫内部的一些成分，造成对细胞产酶
的影响，但是，酸碱处理的先后顺序对固定化细胞
产酶的影响无明显差异。先碱处理，再用酸处理的
方式每克载体固定细胞的干质量达到824mg，细胞
产酶酶活达到每克干细胞l022U。
2．1．2载体颗粒大小的影响
分离检测不同大小载体颗粒固定化细胞的干
质量和酶的活性，结果如图3所示。
900
辩
400器
300*
2lI】000"逼波
O
图3载体尺寸对产酶及固定细胞生物■的影响
Fig．3EffectofPUFsizeonthelipaseproduction
andtheimmobilizedcellbiomass
由图3可知，当载体尺寸较小时，固定的细胞较
少。较小颗粒载体在摇瓶振荡培养环境中，载体内
部受到流动培养摹的冲击相对较大，细胞难以稳定
生长和固定；而载体尺寸偏大时，颗粒内部受到传
质限制，营养传递和供氧不畅，不利于菌体生长。
切片观察颗粒内部只有少量的菌丝体甚至无菌丝
体。载体为边长8mm的立方体小块时，颗粒固定
细胞干质量最大，达到每克载体固定细胞824mg，
固定化细胞酶活达到每克干细胞l022U。
2．1．3载体材料密度的影响
实验在相同的培养条件下比较了密度为9、27、
40ks／m3聚氨酯泡沫载体的细胞固定化效果。结果
如图4所示。
l 000
霎 soo
羹摹600
嚣黑400
篷200
0
9 27 40
载体密度／(ks·m4)
圈4载体密度对固定细胞生物量的影响
Fig．4EffectofPUFdensityon heimmobilizedcellbiomass
万方数据
2008年11月欧阳军悔等：聚氨酯泡沫固定产脂肪酶粗状暇丝酵母(Cand／dava／／daT2)细胞的研究·55·
载体密度不同，孔隙率也会不同。由图4可知，
密度为9kg／m3的载体固定细胞量少，而切片镜检
显示载体内仅有少量的菌丝体，可能是由于载体密
度低，内部孑L隙空间较大，可供细胞吸附生长固定
的内部脊壁积小，影响细胞在载体内稳定生长和有
效固定。密度高的40kg／m3载体固定细胞量也少，
可能是载体孔隙小，假丝酵母结团生长的特性易堵
塞载体的外表面，影响了细胞的进人生长。密度为
27kg／m3的载体细胞固定量相对较好。
2．1．4载体加入量对菌体固定化效率的影响
分别加入一定质量(密度为27kg／m3)的聚氨酯
泡沫载体至100mL发酵培养基中培养，考察聚氨酯
泡沫对固定化细胞干质量及细胞酶活的影响。结果
如图5所示。载体质量为0．15g时，载体同定细胞量
及细胞产酶酶活最大，分别为1571ng／g和l415U，
说明适合的载体加入量才能得到较高的细胞固定化
效率。
1
1
1
己1
蛭
髓
图5载体加入量对产酶及固定细胞生物量的影响
Fig．5EffectofPUFamounton helipaseproductionandthe
immobilizedcellbiomass
2．2培养细胞的分布和固定化细胞的稳定性检测
粗状假丝酵母固定发酵完毕后，将发酵液与载
体分离，载体用生理盐水洗涤，洗涤至洗脱细胞数
接近零(血球计数板计数)。离心收集洗脱的细胞，
105oC干燥恒质量。同时，发酵液离心，洗涤，收集
细胞，烘干，称质量。分析结果如图6、图7所示。
l 2 3 4 5 6 7 8
洗涤次数
6洗脱载体中固定不稳定的细胞
6 Eluteheinstableimmobilizedcells
图7细胞在聚氨酯泡沫载体内外的分布
Fig．7DesperationofcellsinoroutPUF
由图6可知，洗涤8次后，洗涤液中的细胞浓度接
近零。剩下的细胞稳定地固定在聚氨酯泡沫内。由图
7可知，聚氨酯泡沫的微孔结构为菌体提供了良好的生
长和固定微环境。固定发酵结束时载体中固定了大约
70．2％生物量，远大于发酵液的细胞生物量。
2．3载体内细胞生长固定方式的微观考察
为r了解粗状假丝酵母在聚氨酯泡沫载体内
的生长固定情况，采用电镜扫描细胞固定化颗粒，
扫描结果如图8所示。
图8聚氨酯泡沫固定粗状假丝酵母菌电镜扫描图
Fig．8SEMphotosofCand／dav ／／da他adheredtothePUFinnersurface
、咖霉酬霉导卜馊匠
∞∞伽∞∞∞册∞∞o咖枷伽瑚咖咖鲫伽瑚。
万方数据
· 56· 生物加工过程 第6卷第6期
从电镜扫描图8(a)、(b)看出，粗状假丝酵母
菌在载体孔隙内缠绕充盈，生长固定良好。游离块
状菌团的出现主要是由于细胞固定化颗粒在扫描
电镜制样干燥过程中，载体孔隙内固定化菌团因脱
水收缩断裂，部分脱落而形成，图8(c)、(d)显示，
菌体在载体内部的脊壁上生长依附牢固，固定结构
稳定。
2．4 固定化细胞酶催化稳定性考察
催化水解反应体系为：4mL桐籽油，8mL磷酸
缓冲液(pH7．0)，固定化细胞1份，在振荡条件下
(120r／min)，40℃水解48h为l批次。连续进行
5批水解反应，分别取样检测每批水解反应桐籽油
的水解率和固定化细胞保留干质量，考察固定化细
胞的稳定性和酶催化活性，并与游离细胞催化活性
相比较，结果如图9、表l所示。
70
60
冰50
旃40
鹱30
*20
lO
O
l 2 3 4 5
水解批次，lI
图9固定细胞的稳定性
Fig．9Stabilityoftheimmobilizedcells
谪
器
划
碧
器
悱
删
画
图lO5批水解反应后固定化细胞电镜扫描图
Fig．10SEMphotosoftheimmobilizedcellsafter
fiverepeathydrolysisreactions
内脊壁上的细胞损失较大，但载体孔隙内固定细胞
保留良好，细胞损失较小。由图10(b)可以看出，反
应后载体内固定菌团的外表面覆盖着一层形似油
状物，这可能是反应过程中残留的未完全水解的少
量底物，在电镜制样过程中因干燥而形成的聚合物。
表1游离细胞与固定化细胞催化桐籽油水解 3 结 论
Table1 Therateoftungoilhydrolysiscatalyzed
byfreeandimmobilizedcells
细胞类型细胞下生物量／(mg·g“)桐籽油水解彩％
由图9可知，经过5批反应，固定细胞催化的桐
籽油水解率由58．2％降至42．5％，相对水解酶活保
持率为73．02％；载体固定细胞量由1571me／g降
至l374mg／g，固定细胞的损失率为12．5％。固定
化细胞颗粒显示出良好的细胞固定稳定性和酶活
保持率。
由表1可知，游离细胞催化桐籽油的水解率不
低于固定化细胞，但游离细胞不易重复使用。图10
为5批水解反应后的固定化颗粒电镜图。
由图10(a)可知，5批水解反应后，固定在载体
聚氨酯泡沫载体固定产脂肪酶粗状假丝酵母
细胞，其优化的固定条件为：聚氨酯泡沫尺寸
8mm×8mm×8mm，密度27ks／m3。经酸碱预处
理，载体与固定培养液的质量体积比为0．15：100
(g／mL)，30℃，固定培养48h，有70．2％的细胞进
入聚氨酯泡沫中生长固定，载体固定细胞量达到
l 571ms／g，细胞的酶活达到每克干细胞l415U。
扫描电镜图片显示粗状假丝酵母细胞(Cand／datab
／daT2)在载体内部的空隙和脊壁上生长固定良好，
结构稳定。固定化细胞具有稳定催化油脂水解的
能力，连续5批次的桐籽油水解反应，固定化细胞的
相对水解酶活保持率达73％，细胞的损失率小于
13％。固定化细胞颗粒显示出良好的细胞固定稳定
性和酶活保持率。聚氨酯泡沫物化性能稳定，价格
低廉，易于处理回收，作为细胞酶固定化载体具有
应用研究的潜力。
∞∞∞卯加卯∞卯
6
5
5
4
4
3
3
2
万方数据
2008年11月欧阳军侮等：聚氨酯泡沫固定产脂肪酶粗状假丝酵母(Cand／da删如缸r12)细胞的研究-57·
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新型工业酶研究获863计划重点支持
为改变缺乏适合国情的鼋大核心生物技术的现状，构建新一代工业生物技术体系，力求在生物能源、生
物基化学品、生物材料等关键技术上取得突破，新一代工业生物技术列入科技部的863计划生物和医药技术
领域2008年度专题课题中，其中，工业酶技术将获得重点支持。
国家发改委预测数据显示，到2020年，生物医药占全球药品的比例将超过1／3，生物质能源占世界能源
消费的比例将达到5％左右，生物基材料将替代10％一20％的化学材料。继信息产业之后，生物产业将逐渐
成为未来全球经济社会发展的又一重要推动力。对于非粮燃料乙醇等新型生物能源，高效、转移的酶催化
技术是其实现产业化的关键环节。但目前我国生物技术还面临着生物材料化学品原料利用率不高、缺乏适
合国情的重大核心生物技术等挑战。开发新一代工业生物技术，构建新的生物产业路线图、生物质加工新
体系和新型生物催化剂体系，就要充分发挥生物催化和生物转化的高效性和高选择性。
(朱宏阳)
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