全 文 ：第７卷第４期
２００９年７月
生 物 加 工 过 程
ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｐｒｏｃｅｓｓＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ．７Ｎｏ．４
Ｊｕｌｙ２００９
ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１７６２－３６７８．２００９．０４．０１４
收稿日期：２００８－０４－２９
基金项目：国家自然科学基金资助项目（２０５０６０３７＆２０６７２０３７）；华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室开放课题资助项目（２００８００４）
作者简介：何玉财（１９７９—），男，辽宁开原人，助理研究员，博士，研究方向：生物催化；许建和（联系人），教授，博士生导师，Ｅｍａｉｌ：ｊｉａｎｈｅｘｕ＠
ｅｃｕｓｔ．ｅｄｕ．ｃｎ
产碱杆菌 ＥＣＵ０４０１催化拆分
扁桃酸及其衍生物
何玉财１，２，许建和１
（１．华东理工大学 生物反应器工程国家重点实验室 生物催化研究室，上海 ２００２３７；
２．中国科学院 青岛生物能源与过程研究所，青岛 ２６６０７１）
摘 要：从土壤中分离的１株产碱杆菌ＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｓｐＥＣＵ０４０１具有扁桃酸脱氢酶活性，可以以扁桃酸、苯甲酰甲酸或
苯甲酸为唯一Ｃ源生长，并且具有较高的脱氢酶活力。以外消旋扁桃酸为Ｃ源，采用分批补料策略培养（或反应）
９９ｈ，扁桃酸累计投入量为３０４ｇ／Ｌ，（Ｓ）（＋）扁桃酸被完全降解，（Ｒ）（－）扁桃酸回收产率为３２８％，对映体过量
值（ｅｅ）＞９９９％。利用静息细胞作为催化剂不对称降解外消旋扁桃酸的氯代衍生物，制备获得光学活性的
（Ｒ）（－）邻氯扁桃酸、（Ｓ）（＋）间氯扁桃酸和（Ｓ）（＋）对氯扁桃酸，光学纯度均超过９９９％ ｅｅ。
关键词：产碱杆菌；（Ｓ）扁桃酸脱氢酶；对映选择性降解
中图分类号：Ｑ８１４ 文献标志码：Ａ 文章编号：１６７２－３６７８（２００９）０４－００６５－０７
Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆ（Ｒ）（）ｍａｎｄｅｌｉｃａｃｉｄａｎｄｉｔｓｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓｆｒｏｍ
ｒａｃｅｍａｔｅｓｂｙｅｎａｎｔｉｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｗｉｔｈｓｔｒａｉｎＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｓｐ．ＥＣＵ０４０１
ＨＥＹｕｃａｉ１，２，ＸＵＪｉａｎｈｅ１
（１．ＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＢｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓａｎｄＢｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，ＳｔａｔｅＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＢｉｏｒｅａｃｔｏｒＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，
ＥａｓｔＣｈｉｎａＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ２００２３７，Ｃｈｉｎａ；
２．ＱｉｎｇｄａｏＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＢｉｏｅｎｅｒｇｙａｎｄＢｉｏｐｒｏｃｅｓｓＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｑｉｎｇｄａｏ２６６０７１，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａｎｅｎａｎｔｉｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ（Ｓ）ｍａｎｄｅｌａｔｅｄｅｇｒａｄｉｎｇｂａｃｔｅｒｉｕｍ，Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｓｐ．ＥＣＵ０４０１，ｗａｓ
ｎｅｗｌｙｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｓｏｉｌ．Ｔｈｅｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｏｆｍａｎｄｅｌｉｃａｃｉｄ，ｂｅｎｚｏｙｌｆｏｒｍｉｃａｃｉｄｏｒｂｅｎｚｏｉｃａｃｉｄｔｏｔｈｅ
ｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉｕｍａｓａｓｏｌｅｃａｒｂｏｎｓｏｕｒｃｅｅｎｈａｎｃｅｄｔｈｅｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｔｈｅｂａｃｔｅｒｉａｌｃｅｌｓ．Ｂｙｆｅｄ
ｂａｔｃｈｃｕｌｔｕｒｅ，（Ｒ）（）ｍａｎｄｅｌｉｃａｃｉｄｗａｓｐｒｅｐａｒｅｄｉｎａ５Ｌｆｅｒｍｅｎｔｅｒｗｉｔｈ３２．８％ ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ
ｆｏｒ９９ｈ．（Ｒ）Ｍａｎｄｅｌｉｃａｃｉｄｗａｓｒｅｃｏｖｅｒｅｄｉｎａｎｉｓｏｌａｔｅｄｙｉｅｌｄｏｆ３２．８％ ａｎｄａｎｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｉｃｅｘｃｅｓ
ｓｅｓ（ｅ．ｅ．）＞９９．９％ ｆｒｏｍｔｏｔａｌｙ３０４ｇ／Ｌｏｆｒａｃｅｍｉｃｍａｎｄｅｌｉｃａｃｉｄ．ＵｓｉｎｇｔｈｅｒｅｓｔｉｎｇｃｅｌＡｌｃａｌｉ
ｇｅｎｅｓｓｐ．ＥＣＵ０４０１ａｓａｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔ，（Ｒ）（）ｏｃｈｌｏｒｏｍａｎｄｅｌｉｃａｃｉｄ，（Ｓ）（＋）ｍｃｈｌｏｒｏｍａｎｄｅｌｉｃ
ａｃｉｄａｎｄ（Ｓ）（＋）ｐｃｈｌｏｒｏｍａｎｄｅｌｉｃａｃｉｄｗｅｒｅｐｒｅｐａｒｅｄｗｉｔｈｈｉｇｈｙｉｅｌｄｓａｎｄｅｘｃｅｌｅｎｔｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｉｃｅｘ
ｃｅｓｓｅｓ（＞９９９％ ｅ．ｅ．）．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｓｐ．；（Ｓ）ｍａｎｄｅｌｉｃａｃｉｄｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ；ｅｎａｎｔｉｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ
（Ｒ）（－）扁桃酸是一类重要的手性砌块，大量
用于半合成青霉素、头孢菌素类抗生素、抗肿瘤药
物和抗衰老药物中，还广泛用作光学拆分剂［１－２］，每
年的产量达数百吨规模［３］。尽管人们已开发了许
多技术用于合成（Ｒ）（－）扁桃酸［４］，但由于还原试
剂比较昂贵及物理化学方法在技术上比较困难，而
一些生物化学方法涉及辅酶再生，许多生产（Ｒ）
（－）扁桃酸的方法并不经济。另一方面，外消旋扁
桃酸可以采用化学方法以较低的价格大批量合
成［５］。因此，从外消旋扁桃酸中有效地分离（Ｒ）
（－）扁桃酸是一条比较经济的途径。利用（Ｓ）扁
桃酸脱氢酶不对称降解扁桃酸外消旋混合物，可以
直接回收获得（Ｒ）（－）扁桃酸。经典的动力学拆
分法［６］可以得到５０％的理论产率，已经报道 Ａｌｃａｌｉ
ｇｅｎｅｓｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃｕｓ［７］、Ａｓｐｅｒｇｉｌｕｓｎｉｇｅｒ［８］和 Ｐｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓｐｏｌｙｃｏｌｏｒ［９］等微生物菌株含有对映选择性的
（Ｒ）或（Ｓ）扁桃酸脱氢酶。
近年来，生物催化剂在医药合成中获得广泛的
应用［１０－１２］。笔者从土壤中筛选分离出１株腈水解
酶产生菌ＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｓｐＥＣＵ０４０１，它可以催化外消
旋扁桃腈的水解合成（Ｒ）（－）扁桃酸（＞９９９％
ｅｅ）［１］，但是产率较低，原因是 Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｓｐ
ＥＣＵ０４０１细胞中还含有（Ｓ）扁桃酸脱氢酶。利用
其静息细胞选择性降解外消旋的扁桃酸时，（Ｓ）
（－）扁桃酸可以完全降解，而（Ｒ）（－）扁桃酸则以
较高的对映体过量值（ｅｅ）保留在反应体系中。本
文考察生长细胞和静息细胞对外消旋扁桃酸的选
择性降解特性。在此基础上，考察静息细胞对扁桃
酸氯代衍生物的选择性降解，并以此制备高光学纯
度的邻、间、对 氯代扁桃酸。
１ 材料与方法
１１ 材料
外消旋扁桃酸、邻氯扁桃酸、间氯扁桃酸和对
氯扁桃酸 安徽广德化工有限公司，分析纯；甲醇 上
海试剂一厂，色谱纯；其他试剂为国产分析纯。
１２ 菌株
ＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｓｐＥＣＵ０４０１，以乙腈为唯一 Ｎ源从
土壤中筛选获得［１］，现保存于中国普通微生物菌种
保藏中心，编号ＣＧＭＣＣＮｏ２００９。
１３ 培养基
斜面培养基：甘油１５０ｇ，蛋白胨１００ｇ，酵母
膏５０ｇ，ＫＨ２ＰＯ４２０ｇ，ＮａＣｌ１０ｇ，ＭｇＳＯ４０２ｇ，
ＦｅＳＯ４·７Ｈ２Ｏ００３ｇ，琼脂１５０ｇ，自来水１０００ｍＬ，
ｐＨ７２；
发酵培养基１：甘油１５０ｇ，蛋白胨１００ｇ，酵母
膏５０ｇ，ＫＨ２ＰＯ４２０ｇ，ＮａＣｌ１０ｇ，ＭｇＳＯ４０２ｇ，
ＦｅＳＯ４·７Ｈ２Ｏ００３ｇ，自来水１０００ｍＬ，ｐＨ７２；
发酵培养基２：外消旋扁桃酸６０８ｇ／Ｌ，蛋白胨
１００ｇ，酵母膏 ５０ｇ，ＫＨ２ＰＯ４２０ｇ，ＮａＣｌ１０ｇ，
ＭｇＳＯ４０２ｇ，ＦｅＳＯ４·７Ｈ２Ｏ００３ｇ，自来水１０００
ｍＬ，ｐＨ７２；
基础培养基：蛋白胨１００ｇ，酵母膏５０ｇ，ＫＨ２ＰＯ４
２０ｇ，ＮａＣｌ１０ｇ，ＭｇＳＯ４０２ｇ，ＦｅＳＯ４·７Ｈ２Ｏ００３ｇ，自
来水１０００ｍＬ，ｐＨ７２。
１４ 培养条件
取斜面保存的 ＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｓｐＥＣＵ０４０１菌种，
转接至５０ｍＬ发酵培养基１中，在３０℃、１６０ｒ／ｍｉｎ
的恒温摇床培养１５ｈ，取５ｍＬ发酵液作为种子液接
种到装液１９５ｍＬ发酵培养基１的１０００ｍＬ摇瓶中，
在３０℃、１６０ｒ／ｍｉｎ的恒温摇床上培养４８ｈ。离心
收获细胞（１００００ｒ／ｍｉｎ，１０ｍｉｎ，４℃）。
（Ｒ）（－）扁桃酸的分批补料制备在５Ｌ发酵
罐（上海国强工程公司）中进行。先将 Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ
ｓｐＥＣＵ０４０１种子液在装有１５０ｍＬ发酵培养基 １
培养的１０００ｍＬ摇瓶（３０°Ｃ和１６０ｒ／ｍｉｎ）预培养
１５ｈ，再将该培养液接种到装有３Ｌ发酵培养基２的
５Ｌ发酵罐中。在发酵罐操作过程中，调整搅拌速
度和空气流速以保持溶氧（ＤＯ）在饱和度 ３０％以
上，温度恒定于３０°Ｃ，通过流加２ｍｏｌ／ＬＨ２ＳＯ４或２
ｍｏｌ／ＬＮａＯＨ使 ｐＨ保持于 ７２，另加入体积分数
００３％的泡敌防止泡沫产生。
１５ 静息细胞生物转化
将发酵得到的产碱杆菌ＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｓｐＥＣＵ０４０１
细胞离心（１００００ｒ／ｍｉｎ、１０ｍｉｎ、４℃），并利用生理
盐水洗涤３次，然后取２０ｇ湿细胞重新悬浮于２０
ｍＬ磷酸缓冲溶液（ｐＨ６５，１００ｍｍｏｌ／Ｌ）中，加入外
消旋扁桃酸至终浓度２０ｍｍｏｌ／Ｌ，在３０℃、１６０ｒ／ｍｉｎ
的摇床上振荡反应。反应过程中定时取样４００μＬ，立
即加入１００μＬ的２ｍｏｌ／ＬＨＣｌ终止反应，充分振荡混
匀后离心取上清液，经微孔滤膜（０４５μｍ）过滤
后，用ＨＰＬＣ分析剩余底物及产物的浓度。
１６ 分析方法
细胞的生物量利用ＵＶ Ｖｉｓ分光光度计（Ｕｎｉｃｏ
ＵＶ ２１００，上海）通过浊度 ＯＤ６００测定。扁桃酸、苯
甲酰甲酸和苯甲酸的浓度利用ＨＰＬＣ（Ｃ１８柱，Ｓｈｉｍ
６６ 生 物 加 工 过 程 第７卷
ｐａｃｋＶＰ ＯＤＳ，ＳｈｉｍａｄｚｕＣｏ．，Ｊａｐａｎ）分析测定，流
动相为 １０ｍｍｏｌ／ＬＫＨ２ＰＯ４ＣＨ３ＯＨ（体积比 ８７∶
１３），流速为０８ｍＬ／ｍｉｎ，波长为２１５ｎｍ。扁桃酸、
苯甲酰甲酸和苯甲酸的停留时间分别为８８、１３９
和４９４ｍｉｎ。用手性色谱柱（ＣｈｉｒａｌｃｅｌＯＤ Ｈ，日本
Ｄａｉｃｅｌ公司）测定产物扁桃酸的对映体过量值
（ｅｅ，％），流动相组成 Ｖ（正己烷）∶Ｖ（异丙醇）∶
Ｖ（三氟乙酸）＝９０∶１０∶０２，流速为０８ｍＬ／ｍｉｎ，检
测波长为２２８ｎｍ。（Ｓ）扁桃酸和（Ｒ）扁桃酸保留
时间分别为１１２ｍｉｎ和１２９ｍｉｎ。
生物转化中剩余的底物及反应中间体的分子结
构利用ＥＳＩ ＭＳ（ＭｉｃｒｏｍａｓｓＬＣＴＴＭ）和１ＨＮＭＲ（３００
ＭＨＺ，Ｂｒｕｋｅｒ公司）进行确认。
１７ （Ｓ）（＋）扁桃酸降解活性分析
静息细胞中（Ｓ）（＋）扁桃酸降解活性通过测
定（Ｓ）（＋）扁桃酸含量的减少速度来分析。取
０１ｇ湿静息细胞悬浮于１ｍＬ磷酸缓冲溶液（ｐＨ
６５、１００ｍｍｏｌ／Ｌ）中，加入外消旋扁桃酸至终浓度
２０ｍｍｏｌ／Ｌ，在 ３０℃、１１００ｒ／ｍｉｎ的微型摇床
（ＴｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒＣｏｍｐａｃｔ，Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ）上振
荡反应 １ｈ，取样 １８０μＬ立即与 ２０μＬ２ｍｏｌ／Ｌ
ＨＣｌ振荡混合以终止反应，离心除去细胞后，取上
清液用 ＨＰＬＣ分析（Ｓ）（＋）扁桃酸的含量，所有
的分析做３次平行反应。一个单位（Ｕ）的降解酶
活定义为：在３０℃、ｐＨ６５反应体系中，每分钟降
解１０μｍｏｌ／Ｌ（Ｓ） （＋） 扁桃酸所需要的细胞
（酶）量。
２ 结果与讨论
２１ ＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｓｐＥＣＵ０４０１细胞中扁桃酸脱氢
酶的发现
在以甘油为 Ｃ源培养收获的 Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｓｐ
ＥＣＵ０４０１静息细胞催化水解外消旋扁桃腈制备
（Ｒ）（－）扁桃酸时，意外发现反应中有苯甲酸生
成，提示 ＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｓｐＥＣＵ０４０１菌株中可能含有
扁桃酸脱氢酶，导致产物扁桃酸降解（氧化 ＋脱羧）
而生成苯甲酸。为证实上述猜想，设计如下实验：
将０１ｇ（湿质量）细胞重新悬浮于２ｍＬ磷酸钾缓
冲液（ｐＨ６５，１００ｍｍｏｌ／Ｌ）中，外部加入外消旋扁
桃酸至终浓度为２０ｍｍｏｌ／Ｌ，在３０℃和１６０ｒ／ｍｉｎ
摇床中反应，同时利用手性色谱柱监测扁桃酸的变
化，如图１所示，在１２ｈ反应期间，（Ｓ）（＋）扁桃酸
被逐渐降解，而（Ｒ）（－）扁桃酸的浓度并无明显的
变化。由此可见，以甘油为 Ｃ源培养收获的 Ａｌｃａｌｉ
ｇｅｎｅｓｓｐＥＣＵ０４０１菌体中含有较高活性的（Ｓ）（＋）
扁桃酸脱氢酶。下面的研究主要利用 Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ
ｓｐＥＣＵ０４０１的扁桃酸对映选择性降解特征，制备
单一对映体扁桃酸及其衍生物。
图１ 以手性液相色谱柱（ＣｈｉｒａｌｃｅｌＯＤ Ｈ）监测（Ｓ）扁桃酸的变化进程
Ｆｉｇ．１ Ｔｉｍｅｃｏｕｒｓｅｏｆ（Ｓ）
!
ｍａｎｄｅｌｉｃａｃｉｄｂｉｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｍｏｒｎｉｔｏｒｅｄｂｙＨＰＬＣｕｓｉｎｇａｃｈｉｒａｌｃｏｌｕｍｎ
２２ 培养基Ｃ源对扁桃酸脱氢酶活力的影响
ＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｓｐＥＣＵ０４０１能以外消旋扁桃酸、苯
甲酰甲酸或苯甲酸为唯一 Ｃ源／能源生长。在基础
培养基中分别加入４０ｇ／Ｌ的甘油、外消旋扁桃酸、
苯甲酰甲酸和苯甲酸，在摇瓶中培养４８ｈ后测定细
胞的ＯＤ６００，离心（１００００ｒ／ｍｉｎ，１０ｍｉｎ）收集细胞
测定扁桃酸的降解酶活性。如图２所示，当以甘油、
外消旋扁桃酸、苯甲酰甲酸和苯甲酸分别作为 Ｃ源
（或能源），（Ｓ）（＋）扁桃酸脱氢酶的活性明显提高
（与空白做对照），以外消旋扁桃酸为 Ｃ源时，（Ｒ）
（－） 扁桃酸被保留在培养体系中，回收产率达
４０５％，光学纯度＞９９９％。
２３ 分批补料发酵法制备（Ｒ）（－）扁桃酸
在上述实验中发现 ＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｓｐＥＣＵ０４０１能
以外消旋扁桃酸为唯一 Ｃ源生长。为提高细菌转
化扁桃酸的浓度，增强制备的效率，采取分批补加
７６ 第４期 何玉财等：产碱杆菌ＥＣＵ０４０１催化拆分扁桃酸及其衍生物
图２ 不同Ｃ源对ＥＣＵ０４０１生长及扁桃酸
脱氢酶活力的影响
Ｆｉｇ．２ Ｅｆｅｃｔｓｏｆ（±）ＭＡ，ｂｅｎｚｏｙｌｆｏｒｍｉｃａｃｉｄｏｒｂｅｎ
ｚｏｉｃａｃｉｄｏｎｃｅｌｇｒｏｗｔｈａｎｄｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆ（Ｓ）
（＋）ＭＡｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｉｎＥＣＵ０４０１
底物的方法，在加入底物的同时调节转化液的 ｐＨ，
使其维持在一个相对稳定的水平上。
具体的操作过程是，将预培养１５ｈ的种子液接
种到３Ｌ培养基２中（装于５Ｌ发酵罐），接种量为
体积分数６％。定时取样分析发酵液 ＯＤ６００值和残
留扁桃酸含量，结果如图３所示。由图３可知，利用
ＥＣＵ０４０１生长细胞，在培养过程中采用分批补料的
方式进行扁桃酸的降解，（Ｓ）（＋）扁桃酸可以作为
图３ 采用分批补料进行发酵法制备（Ｒ）
（－）扁桃酸反应进程曲线。
Ｆｉｇ．３ Ｔｉｍｅｃｏｕｒｓｅｐｒｏｆｉｌｅｓｆｏｒｔｈｅｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆ（Ｒ）
ＭＡｗｉｔｈｓｅｑｕｅｎｔｉａｌａｄｄｉｔｉｏｎｏｆｒａｃｅｍｉｃｓｕｂ
ｓｔｒａｔｅ［（±）ＭＡ］ｄｕｒｉｎｇｔｈｅｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎｏｆＡｌ
ｃａｌｉｇｅｎｅｓｓｐＥＣＵ０４０１
Ｃ源和能源而被降解，而（Ｒ）（－）扁桃酸则大部分
保留在发酵液中。分批补料培养至９９ｈ时，累积加
入的外消旋扁桃酸质量浓度为３０４ｇ／Ｌ，在整个过
程中由于维持 ｐＨ７２，细胞保持了旺盛的酶活力，
（Ｓ）（＋）扁桃酸被完全降解，（Ｒ）（－）扁桃酸的
回收产率为３２８％，光学纯度 ＞９９９％，而且在培
养后期，细胞的活性仍然比较高，细胞量也比较高，
这说明还可以继续补加扁桃酸，得到更高浓度的
（Ｒ）扁桃酸，使制备效能进一步提高。
２４ ｐＨ和温度对静息细胞（Ｓ）扁桃酸降解活性
的影响
ｐＨ对ＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｓｐＥＣＵ０４０１静息细胞扁桃酸
脱氢酶的活性是有影响的。本文选择了柠檬酸钠
柠檬酸（ｐＨ３０～６０，１００ｍｍｏｌ／Ｌ）和 Ｋ２ＨＰＯ４－
ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ６０～８０，１００ｍｍｏｌ／Ｌ）２种缓冲溶液
体系，０１ｇ（湿质量）细胞悬浮于 ２ｍＬ缓冲溶液
中，外消旋扁桃酸的浓度为２０ｍｍｏｌ／Ｌ，在 ３０℃和
１６０ｒ／ｍｉｎ摇床上反应１ｈ后，加入０１ｍＬ２ｍｏｌ／Ｌ
ＨＣｌ终止反应，取样分析。实验结果如图 ４所示。
从图４可以看出，细胞内的酶在 ｐＨ３０～６５时，酶
活随着ｐＨ增大而逐渐增大，当ｐＨ为６５时酶活达
到最大值，继续增加ｐＨ则酶活开始下降，可见反应
的最适ｐＨ为６５。
图４ 反应ｐＨ对静息细胞脱氢酶活性的影响
Ｆｉｇ．４ ＥｆｅｃｔｏｆｐＨｏｎｔｈｅ（Ｓ）（＋）ＭＡ
ｄｅｇｒａｄｉｎｇａｃｔｉｖｉｔｙ
考察温度对 ＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｓｐＥＣＵ０４０１静息细胞
扁桃酸脱氢酶活性的影响。将０１ｇ（湿质量）细胞
重新悬浮于 ２ｍＬ磷酸钾缓冲液（ｐＨ６５，１００
ｍｍｏｌ／Ｌ）中，外消旋扁桃酸的浓度为２０ｍｍｏｌ／Ｌ，在
３０℃、１６０ｒ／ｍｉｎ摇床条件下反应１ｈ后，加入０１
ｍＬ２ｍｏｌ／ＬＨＣｌ终止反应，取样分析。实验结果如
图５所示。从图５可以发现，在２０～３０℃的条件
下，随着温度上升，酶活逐渐增大，当温度为３０℃时
酶活达到最大值，继续升高反应温度时酶活开始下
降，可能由于温度较高导致热失活。由此可见，生
物转化的最适温度为３０℃。在下面的研究中分别
采用ｐＨ６５、反应温度３０℃进行反应。
２５ 扁桃酸对映选择性生物降解的可能途径
利用ＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｓｐＥＣＵ０４０１静息细胞考察了外
消旋扁桃酸［（±） ＭＡ］对映选择性降解的过程，底物
８６ 生 物 加 工 过 程 第７卷
图５ 反应温度对静息细胞脱氢酶活性的影响
Ｆｉｇ．５ Ｅｆｅｃｔｏｆｒｅａｃｔｉｏｎｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｏｎｔｈｅ（Ｓ）（＋）
ＭＡｄｅｇｒａｄｉｎｇａｃｔｉｖｉｔｙ
和中间产物的浓度变化如图６所示。由图６可知：反
应１２ｈ后，（Ｓ）－（＋）扁桃酸被彻底氧化生成苯甲酰
甲酸和苯甲酸。而（Ｒ）（－）扁桃酸在１６ｈ内只有少
量的降解，残留扁桃酸的浓度为８６ｍｍｏｌ／Ｌ（产率
４３０％；ｅｅ＞９９９％）。从反应混合物中分离所得
的２个关键中间体（苯甲酰甲酸和苯甲酸）的分子结
构经过 ＭＳ ＥＳＩ和１Ｈ ＮＭＲ确认无误（数据未列
出）。反应过程中另一个可能的中间体———苯甲醛
没有被检测到，ＨＰＬＣ只检测到扁桃酸、苯甲酰甲酸和
苯甲酸这３种物质（数据未列出），苯甲酰甲酸和苯甲
酸达到最大浓度的时间分别为１０ｈ和１８ｈ。
图６ 利用ＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｓｐＥＣＵ０４０１静息细胞对映选择
性降解（±）扁桃酸
Ｆｉｇ．６ Ｐｒｏｆｉｌｅｏｆｅｎａｎｔｉｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｏｆ（±）
ＭＡｂｙｒｅｓｔｉｎｇｃｅｌｓｏｆＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｓｐＥＣＵ０４０１
在反应过程中，苯甲酰甲酸大部分被氧化生成苯
甲酸，推测可能的降解途径如图７所示，（Ｓ）（＋）扁
桃酸首先在脱氢酶的作用下生成苯甲酰甲酸，苯
甲酰甲酸在脱羧酶的作用下进一步降解生成苯
甲酸。
图７ Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｓｐ．ＥＣＵ０４０１降解扁桃酸的可能途径
Ｆｉｇ．７ ＡｐｒｅｓｕｍｅｄｐａｔｈｗａｙｏｆｍａｎｄｅｌａｔｅｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｂｙＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｓｐＥＣＵ０４０１
２６ 利用静息细胞制备光学纯扁桃酸及其衍生物
称取湿质量１０ｇ的ＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｓｐＥＣＵ０４０１静
息细胞，以表１中的外消旋扁桃酸及其衍生物为底
物，浓度分别为１０、２５和５０ｍｍｏｌ／Ｌ，反应体积１００
ｍＬ，在 ３０℃、１６０ｒ／ｍｉｎ的恒温摇床上反应２４～
４８ｈ，取样分析，残留底物的绝对构型根据文献
［１３］所述方法确定。这４种外消旋的扁桃酸及其
衍生物经过静息细胞生物转化后生成了光学活性
的（Ｒ）（－）扁桃酸及其衍生物（Ｒ）（－）邻氯扁桃
酸、（Ｓ）（＋）间氯扁桃酸和（Ｓ）（＋）对氯扁桃酸，ｅ．ｅ．
值均＞９９９％。ＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｓｐＥＣＵ０４０１静息细胞不
对称降解扁桃酸及其衍生物（１～４），可获得不同立体
构型的光学活性α 羟基酸，具体的原因尚不清楚，可
能的原因是苯环上Ｃｌ原子的取代位置不同导致了扁
桃酸脱氢酶降解对映体的选择性改变，因而所得的氯
代扁桃酸产物的立体构型也不尽一致。
９６ 第４期 何玉财等：产碱杆菌ＥＣＵ０４０１催化拆分扁桃酸及其衍生物
表１ 利用ＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｓｐＥＣＵ０４０１静息细胞不对称降解扁桃酸及其衍生物（１～４）制备光学活性的α 羟基酸（５～８）
Ｔａｂｌｅ１ Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｏｆｒａｃｅｍｉｃｍａｎｄｅｌｉｃａｃｉｄａｎｄｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓｔｈｅｒｅｏｆ（１～４）ｗｉｔｈ
ｒｅｓｔｉｎｇｃｅｌｓｏｆＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｓｐ．ＥＣＵ０４０１，ｙｉｅｌｄｉｎｇｏｐｔｉｃａｌｙａｃｔｉｖｅαｈｙｄｒｏｘｙａｃｉｄｓ（５～８）
底物 ｃ／（ｍｍｏｌ·Ｌ－１） ｔ／ｈ 产率／％ 构型 ｅｅ／％ Ｅ
（±）－１
１０ ２４ ３０３ Ｒ ＞９９９
２５ ４８ ３５９ Ｒ ＞９９９
５０ ４８ ４８８ Ｒ ６５７
１５７
（±）－２
１０ ２４ ４６４ Ｒ ＞９９９
２５ ４８ ２０３ Ｒ ＞９９９
５０ ４８ ５４９ Ｒ ３３３
３２
（±）－３
１０ ２４ ２１７ Ｓ ＞９９９
２５ ４８ ２７６ Ｓ ＞９９９
５０ ４８ ８０２ － ０
４３
（±）－４
１０ ２４ １９３ Ｓ ＞９９９
２５ ４８ １９２ Ｓ ＞９９９
５０ ４８ ９０３ － ０
３８
Ｅ为对映体选择率（Ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｉｃｒａｔｉｏ）［１４］
３ 结 论
笔者筛选得到的 ＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｓｐＥＣＵ０４０１不仅
具有腈水解酶的活性，而且利用甘油、扁桃酸、苯甲
酰甲酸、苯甲酸作为Ｃ源培养得到的细胞还含有扁
桃酸脱氢酶。利用静息细胞作为催化剂不对称降
解外消旋扁桃酸及其氯取代的衍生物，可制备光学
活性（Ｒ）（－）扁桃酸及其衍生物（Ｒ）（－）邻氯扁
桃酸、（Ｓ）（＋）间氯扁桃酸和（Ｓ）（＋）对氯扁桃
酸，光学纯度均十分理想（＞９９９％ ｅ．ｅ．）。与文献
［６～８］报道的扁桃酸脱氢酶产生菌的催化性能相
比，ＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｓｐＥＣＵ０４０１扁桃酸脱氢酶不仅对外
消旋扁桃酸的活性、底物耐受性和对映选择性与文
献报道的相当，并且利用 ＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｓｐＥＣＵ０４０１
静息细胞不对称降解扁桃酸衍生物（２～４）可获得
不同立体构型的手性 α 羟基酸。以外消旋扁桃酸
为Ｃ源，利用分批补料技术培养反应９９ｈ，累计扁
桃酸质量浓度为３０４ｇ／Ｌ，（Ｓ）（＋）扁桃酸完全被
降解，（Ｒ） （－） 扁桃酸的回收产率为 ３２８％，
ｅ．ｅ．值＞９９９％ ｅ．ｅ．。
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６６７６７０．
国外动态
科学家完成牛基因组测序
一个国际科学家团队２００９年４月２３日说，他们已完成了牛的基因组测序工作，这一成果将有助于生产
质量更好的牛肉和牛奶。
在美国农业研究局和贝勒医学院的领导下，来自２５个国家的３００多位科学家以海福特牛为样品牛，历
经６年完成了基因组测序工作。２４日出版的新一期美国《科学》杂志刊登相关论文介绍这项成果。研究人
员发现，牛至少有２２万个基因，其中８０％与人类共享。牛在遗传上与人类的相似性远远超过老鼠。这也
意味着，牛可以替代实验鼠作为研究人类疾病的动物模型。研究人员还认为，通过将人类基因组与牛等动
物的基因组进行比较，可以更好地理解人类疾病的基因基础。
同一期《科学》杂志还刊登了另一个研究小组的研究论文，这篇论文比较了海福特牛与６种其他牛的
ＤＮＡ差别，并对１９种地理及生物学上完全不同的４９７头牛进行了研究。他们希望牛基因组测序工作的完
成能够有助于培育出肉质更好或产奶量更多的新品种牛。
美国农业部长汤姆·维尔萨克说：“这一成果对产值达４９０亿美元的美国养牛业非常重要。了解牛基
因组并完成对其测序将有助于认识牛类疾病的遗传基础，从而可以帮助减少养牛业对抗生素的依赖，并生
产出质量更好的牛肉和牛奶。”
（朱宏阳）
１７ 第４期 何玉财等：产碱杆菌ＥＣＵ０４０１催化拆分扁桃酸及其衍生物