全 文 ：过量表达自身 !"#$基因的重组大肠杆菌发酵生产
!%氨基乙酰丙酸的研究
赵春晖，林建平，刘晓侠，穆江华，岑沛霖!
（浙江大学 化学工程与生物工程学系生物工程研究所，杭州 &’(()*）
摘 要：研究了优化重组大肠杆菌产 +%氨基乙酰丙酸（$,$）的条件，提高大肠杆菌发酵生产 $,$ 的产量。在测定
重组大肠杆菌 -./0 的生长曲线的基础上，确定诱导时间，优化摇瓶发酵条件。然后，进一步在 + ,发酵罐上进行间
歇和流加发酵研究。摇瓶实验表明，细胞培养最佳初始 12为 3 4+，最佳诱导时间为稳定期前期，最佳接种量为 )5，
过高的葡萄糖浓度对细胞生长和产物合成均有一定的抑制作用。在 + ,发酵罐间歇发酵中，重组菌产 $,$ 能力达
到 /* 40 #6 7 ,。采用流加发酵可以进一步将产物产量提高到 3& 40 #6 7 ,。构建的过量表达自身的 !"#$ 基因的大肠
杆菌具有较高的产 $,$能力，通过发酵条件优化和采用流加发酵可以提高 $,$产量。
关键词：+%氨基乙酰丙酸；重组大肠杆菌；发酵；流加操作
中图分类号：.89) 文献标识码：$ 文章编号：’3*) : &3*0（)((+）(/ : ((&3 : (/
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收稿日期：)((+%(0%)(
基金项目：国家自然科学基金资助（项目批准号：)(&(3()3）
作者简介：赵春晖，男，硕士研究生，研究方向：生物反应工程。
联系人：岑沛霖，J%#D@L：S"?1L^ XU> [ "T> [ S?。
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·&3·
生 物 加 工 过 程
=!@?"M" CG>Q?DL GO P@G1QGS"MM J?6@?""Q@?6
第 & 卷第 / 期
)((+ 年 ’’ 月
万方数据
!"氨基乙酰丙酸（!"#$%&’()*+(%&%, #,%-，简称
./.）广泛存在于生物体中，是生物合成四吡咯的前
体，而四吡咯则可进一步合成一些生物体必不可少
的物质，如血红素、细胞色素、维生素 012等［1］。当两
个 ./.分子在光催化下合成单吡咯时，能够释放出
单重态氧，具有非常活泼的化学性质，因此 ./. 可
作为光动力药物得到广泛应用。1333 年 12 月，美国
45.正式批准 ./. 为治疗皮肤癌前期的光动力药
物，./.在其它表皮癌症治疗方面的应用也倍受关
注［2，6］。此外，./.具有促进作物生长、耐盐、落叶、
杀虫剂和除草等多种功能，而且对人畜无毒性，在环
境中易降解、无残留，因而被认为是一种应用领域广
泛、无公害的绿色农用化学品［6 7 !］。
目前，./.主要通过化学合成方法制备，但化学
合成的反应步骤多、转化率低，使生产成本居高不
下，而且存在着比较严重的环境污染。因此，近年
来，发酵法生产 ./. 在国际上引起广泛的关注，已
有一些研究报道。如，8%9:%;#<# 等经过多年努力，
利用多轮诱变育种使球形红细菌在黑暗环境中异养
发酵的 ./. 的产量有了较大的提高［=，>］；*#& -)?
@)?A 等在 ! " #$%& 中表达球形红细菌的 ./. 合成酶
基因 ’()*，也使大肠杆菌的 ./. 产量有显著的提
高［B］。国内应用发酵法生产 ./. 的研究刚刚起步，
刘秀艳等开展了光照条件下利用红细菌属和红假单
孢菌属微生物生产 ./. 的研究，最高的产量为
22 $C D /［3］；本实验室从污水处理厂的活性污泥中分
离筛选得到一株在黑暗环境中产 ./. 的红细菌，其
初始产量为 > E6! $C D /，经过诱变育种和初步的发酵
条件优化，产量提高到 6B E3 $C D /［1F］。国内尚未见
利用重组微生物生产 ./.的研究报道。
在生物体内存在着两条 ./. 合成途经：碳四途
径和碳五途径。碳四途经中的 ./. 合成酶催化琥
珀酰 G’.和甘氨酸缩合成 ./.；碳五途径则以谷氨
酸为前体，在谷氨酰 HI8. 合成酶催化下使谷氨酸
与相应的 HI8.相连，随后在谷氨酰 HI8. 还原酶催
化 下 将 谷 氨 酰 HI8. 还 原 为 谷 氨 酸"1"半 醛
（C(+H#$#H)"1"9)$%#(-):J-)，KL.），再通过谷氨酸"1"半
醛转氨酶（KL.".M#9)）催化分子内转氨基生成 ./.。
大肠杆菌本身通过碳 ! 途径合成 ./.［11］，但是，由
于大肠杆菌不需要合成叶绿素，仅需要以 ./. 为前
体合成少量的维生素 012等四吡咯类化合物，因此其
天然的 ./.合成能力很弱。研究表明，在大肠杆菌
体内，从谷氨酸到 ./. 的三步反应中，限速步骤为
谷氨酰 HI8. 还原酶催化的谷氨酰 HI8. 还原为
KL.的反应［11，12］。因此，本工作拟采用代谢工程的
方法，构建超量表达谷氨酰 HI8. 还原酶的重组大
肠杆菌，促进 ./.合成，并对培养条件、诱导时间及
表达时间进行初步优化。
! 实验材料与方法
1 E1 实验材料
菌株与质粒：重组大肠杆菌 KMNB 的宿主菌为
大肠 杆 菌 5O! ，含 PQRM2F":)$. 质 粒。质 粒
PQRM2F":)$. 是将大肠杆菌的谷氨酰 HI8. 还原酶
基因 :)$.重组到表达质粒 PQRM2F 中获得的。
培养基：
/0培养基用于种子培养，其组成为（C D /）：胰蛋
白胨 1F，酵母抽提物 !，氯化钠 1F，氨苄青霉素 F E!，
PO = E!；/0固体培养基用于种子斜面保存，其中琼
脂粉 2S。
T0/培养基用于摇瓶发酵，其组成为（C D /）：葡
萄糖 ! EF，酵母膏 6F，胰蛋白胨 2F，磷酸氢二铵 6 E!，
磷酸二氢钾 ! EF，TCLUN·>O2U 1 EF，8#G( 6 EF，微量元
素液 6 EF $/。
1 E2 培养条件及方法
斜面培养：斜面于 6> V下培养箱内培养 12 7
1B :，N V冰箱保存。
种子培养：从新鲜平板用牙签挑取一单菌落接入
/0培养基中，摇床（6> V，2!F ? D $%&）培养 1F 7 12 :。
摇瓶培养：将 !S的种子接入装有 6F $/ T0/
液体培养基的 2!F $/摇瓶，于 6> V、2!F ? D $%& 条件
下摇瓶培养，当发酵进入稳定期即用 WXMK诱导。
间歇培养：以 !S的接种量，将种子液接入到间
歇发酵培养基中，在一定的通气量和搅拌转速下培
养至发酵结束，具体发酵条件根据不同实验有所变
化。培养在 ! /的 Y0M发酵罐中进行。
1 E6 分析方法
./.的测定方法见文献［3，1F］。
葡萄糖的测定采用 58L 法［16］。
菌体浓度以 +,=FF（适当稀释，读数 Z FE6!）表示。
" 结果与讨论
2 E1 菌体的生长曲线
我们在 /0 培养基中测定 KMNB 菌株诱导和非
2FF! 年 11 月 赵春晖等：过量表达自身 :)$.基因的重组大肠杆菌发酵生产 ! [ 氨基乙酰丙酸的研究 ·6>·
万方数据
诱导条件下的生长曲线，如图 ! 所示：菌株经过相对
较长的迟滞期（约 " #）才进入对数生长期，至 !$ #，
菌体 !" 达到 ! %$ 左右，此时加入 &’() 进行诱导，
诱导后的细胞比生长速率明显下降，且后期部分细
胞死亡。说明细胞经诱导后，因外源目标基因开始
表达，加重了细胞的代谢负荷，从而降低了细胞的生
长速率并使细胞死亡加速。
—!— *+,-./, 01 !$ #；—"—+21 *+,-./,
图 ! )(3" 菌株生长曲线
4*5 %! )6271# .-68/ 29 )(3" :160*+
$ %$ 接种量对 ;<;产量的影响
接种量对细胞生长及 ;<; 产量的影响如图 $
所示。从实验结果看，随着接种量的增加，最终的菌
体浓度不仅没有显著的增大，在大接种量下反而略
有下降。;<; 的产量则是先降后增，当接种量为
$=时，;<;的累积量达到较高水平。
图 $ 接种量对细胞生长及 ;<;累积的影响
4*5 %$ >99/.1: 29 *+2.-?01/ 82?-@/ 2+ ./?? 56271# 0+, ;<; A62,-.B
1*2+
$ %C 不同初始 AD值对 ;<;产量的影响
分别在 AD E %E F G %H 范围内，考察菌体生长和
;<;积累的情况。由图 C 可知，AD对细胞生长和产
物积累的影响略有不同：在实验范围内，随着 AD 值
的升高，细胞最终浓度下降，但 ;<; 的产量则呈现
先增后减的趋势，其中以 AD 为 I %E 左右达到最高，
故确定最适初始 AD为 I %E。
—#—;<;；—$—!"
图 C 初始 AD值对 !" 和 ;<;产量的影响
4*5 %C >99/.1: A9 *+*1*0? AD 2+ !" 0+, ;<; A62,-.1*2+
$ %3 不同初始葡萄糖浓度对 ;<;产量的影响
初始葡萄糖浓度对细胞生长和 ;<; 产量的影
响如图 3 所示。实验表明，在 $H @@2? J < 以下，菌体
!" 和 ;<; 的产量都随着葡萄糖浓度的增加而增
加，但增加幅度均比不上葡萄糖浓度的增幅，其原因
可能是：一方面，葡萄糖浓度较高时，产生了较多的
副产物乙酸，抑制了细胞生长；另一方面，由于反应体
系中除葡萄糖外，还存在氨基酸等其他含碳化合物，也
使细胞产量的增幅与葡萄糖浓度的增幅不成正比。
—#—;<;；—$—!"
图 3 初始糖浓度对 !" 和 ;<; 产量的影响
4*5 %3 >99/.1: 29 *+*1*0? 5?-.2:/ .2+./+1601*2+ 2+ !" 0+, ;<; A62B
,-.1*2+
$ %E 诱导时间对 ;<;产量的影响
在对数生长期，细胞快速繁殖，菌群数目倍增，
对养份和溶氧需求量急增，两者成为菌群旺盛代谢
的限制因素。在分批发酵培养过程中，控制在一定
的菌体密度下进行诱导有利于外源蛋白的表达。控
制好合适的诱导时间对于谷氨酰 1KL; 还原酶的表
达有促进作用，最终促进胞外 ;<; 的累积。实验分
别在对数期中期、后期以及稳定期前期进行诱导，测
·C"· 生物加工过程 第 C 卷第 3 期
万方数据
定菌体 !" 和 !"!产量，结果如图 # 所示。
—!—!"!；—"—!"
图 # 诱导时间对 !"!和菌体 !" 的影响
$%& ’# ())*+,- .) %/01+,%./ 2*3%.0 ./ !" 4/0 !"! 23.01+,%./
实验结果表明：随着诱导时间的推后，菌体 !"
呈下降趋势，而 !"!产量则呈上升趋势。在稳定期
前期进行诱导，菌体 !" 为 5 ’6#，!"!的最终产量达
到 76 ’# 8& 9 "。由于产物含量是最主要的考察指标，
所以确定稳定期前期为最佳诱导时间。
: ’; # "发酵罐的间歇发酵
在摇瓶培养过程中难以控制发酵液的 2< 和溶
氧，因此在 # "罐上研究了 # ’ $%&’ =>6? 的间歇发酵
过程。实验中通过调节通气量和转速，控制溶氧不
低于 @AB。实验结果（图 ;）表明，葡萄糖在 @A C 后
基本耗完，但由于复合培养基中各种氮源中碳骨架
物质能够支持菌体的继续生长，经过 @; C 才进入稳
定期，菌体 !" 达到 @6，发酵罐中的 !"! 质量浓度
也在此时达到最高值约 65 ’? 8& 9 "，但随即出现了快
速下降，估计是由于到了发酵后期，培养基中各种营
养成分被消耗殆尽，产物 !"! 和副产物乙酸等被菌
体作为营养物质利用。发酵末期 2< 的上升也印证
了乙酸的消耗。
—#—&D1+.-*；— E —2<；
—$—!"；—%—!"!
图 ; 间歇发酵过程曲线
$%& ’; >%8* +.13-*- .) ,C* F4,+C )*38*/,4,%./
: ’5 # "发酵罐的流加发酵
考虑到上述的间歇发酵中初始葡萄糖质量浓度
较低，而增大葡萄糖质量浓度对细胞生长和产物合
成又均有一定的抑制作用，在间歇发酵的基础上进
一步进行了流加发酵。同样，实验中通过调节通气
量和转速，控制溶氧不低于 @AB。初始发酵体积为
7 "，在葡萄糖质量浓度降至 @ & 9 " 左右后，从 @@ C
起以恒定的速率流加葡萄糖，葡萄糖流加速率相当
于 @ & 9 C。流加发酵过程的 2<、细胞和产物浓度的
变化规律与间歇发酵类似，但细胞生长期和产物合
成期有一定的延长，最终的细胞和产物产量均有了
较大提高，至 @5 小时，细胞 !" 达到 :6 ’#，!"! 产量
达到;7 ’? 8& 9 "（图 5）。
—#—&D1+.-*；—"—2<；
—&—!"；—%—!"!
图 5 间歇发酵过程曲线
$%& ’5 >%8* +.13-*- .) ,C* )*0GF4,+C )*38*/,4,%./
! 结 论
重组菌 # ’ $%&’ =>6? 产 !"!的最佳诱导期为稳
定期前期，摇瓶最佳接种量为 :B，最佳初始 2< 为
; ’#。过高的葡萄糖浓度会抑制细胞生长和产物合
成。合适的 2<和溶氧控制策略是必要的。采用流
加发酵可以减轻葡萄糖效应，从而促进细胞生长和
产物积累。
参考文献：
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（下转第 #7 页）
:AA# 年 @@ 月 赵春晖等：过量表达自身 C*8!基因的重组大肠杆菌发酵生产 # Y 氨基乙酰丙酸的研究 ·7Q·
万方数据
制作用及相应的调控促使莽草酸激酶（!"#$），天冬
氨酸转氨酶（!%&）等途径蛋白分泌表达的增加从而
提高了对底物的转化率。磷酸二果糖醛缩酶（!’(）
和 !&)合成酶（!&)*）作为与合成苯丙氨酸途径有
竞争作用的途径蛋白，其表达量的降低与转入 !+,
-!&基因后体系代谢流变化情况密切相关。蛋白质
合成延伸因子（.(&/ 和 .(&%），磷酸转移酶!（)&,
0!），!1)2和 3)4"都是基本保持不变，这与它们需
要维持基础代谢的重要性有一定关系。分析所得的
结果使我们从整体水平上认识到导入天冬氨酸转氨
酶基因前后大肠杆菌蛋白质组的变化，也在一定程
度上揭示了菌体所作的系统而精细的调控过程。很
多蛋白质点含量较低，尚无法确定，更深入地研究还
需要质谱等手段。
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