全 文 ：!"#$%&’!杂化凝胶固定化多酶体系
催化 (’!转化甲醇研究
许松伟，陆 杨，苑伟康，吴 洪，姜忠义!
（天津大学 化工学院，天津 )***+,）
摘 要：采用甲酸脱氢酶（-./012）、甲醛脱氢酶（-.3412）和醇脱氢酶（!12）) 种脱氢酶为催化剂，以原型烟酰胺腺嘌
呤二核甙酸（5!12）作为电子供体，通过 ) 步连串反应将 (’,转化为甲醇。采用正硅酸甲酯原位水解方法将二氧化
硅掺杂于海藻酸（!"#）溶胶中，通过双交联制备出新型 !"#$%&’,杂化凝胶。与 !"# 凝胶相比，!"#$%&’,结构更加紧
密，酶的泄漏率大大降低，酶活性得以很好保持。将酶包埋于 !"#$%&’,后，存放 6* 4 以后或重复使用 7* 次以上，酶
活性都能保持 8*9以上，与之相比，包埋于 !"#凝胶中的酶活性几乎完全丧失。
关键词：海藻酸；二氧化硅；杂化；固定化；二氧化碳；甲醇
中图分类号：:87; 文献标识码：! 文章编号：76+, < )6+8（,**=）*) < **6; < *=
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(’,是温室气体的主要成分，主要源自化石燃料 燃烧排放。在现代工业迅速发展的今天，人类向大气
! 收稿日期：,**=$*8$*,
基金项目：国家自然科学基金（5@^,*7+6*)_）。
作者简介：许松伟（7_+_$），男，博士研究生，从事固定化酶研究。
联系人：姜忠义，O$N.&3 WJKR&.AB‘ /RU ^ 04U ^ LA
!UB Y ,**=
·6;·
生 物 加 工 过 程
(J&A0T0 G@UPA.3 @M a&@VP@L0TT OAB&A00P&AB
第 ) 卷第 ) 期
,**= 年 8 月
万方数据
中排放的 !"#正以每年 $%的速度递增。因此，如何
有效地利用 !"#正引起世界的关注。目前在化学方
面，科研工作者把精力集中在将 !"#作为替代碳源来
合成有用的化学品，如 &#还原 !"#制备甲醇、!"#和
!&$制合成气和烃、!"#与甲醇反应合成碳酸二甲酯
等。其中，!"#转化为甲醇被认为是 !"#利用的最有
效途径［’］。然而 !"#是自然界中最稳定的小分子，其
标准生成热（! (）为 )*+,)$ -. / 012，对其进行活化转化
还非常困难，因此目前 !"#的活化和转化是当今一个
世界性的热点和难题。非均相催化 !"#加氢制甲醇
过程具有高温、高压、能耗高以及污染严重等缺点。
而采用生物方法转化 !"#合成甲醇具有反应条件温
和、选择性高等显著优点。本研究采用甲酸脱氢酶
（34567&）、甲醛脱氢酶（34287&）和醇脱氢酶（97&）) 种
脱氢酶为催化剂，以原型烟酰胺腺嘌呤二核甙酸
（:97&）作为电子供体，通过 )步连串反应进行 !"#转
化为甲醇的探索（图 ’）。与 !"#其它转化方法相比，
本研究的过程在常温、低压、接近中性 ;& 条件下进
行，并且该过程从原料到反应过程对环境无污染，符
合绿色化学要求［#］。为避免酶与反应物（底物）和产
物之间的分离以及酶对环境的可能性污染，提高酶的
热、贮存和操作稳定性，并且能够实现酶的重复利用
和反应过程连续化，需要寻求酶的适宜固定化方
法［)，$］。本研究采用正硅酸甲酯（<=">）在海藻酸
（42?@A456，9BC）溶液中水解缩聚，然后由 !4# D 引发海
藻酸形成凝胶，从而制备出新的海藻酸 E 二氧化硅
（9BCF>@"#）杂化凝胶用作酶的固定化载体，以延长
!"# 转化甲醇的催化剂的寿命。
图 ’ !"#到甲醇转化过程示意图
3@? ,’ >GH606 1( 6AIJ045@G G1AK6LM@1A 1( G4LN1A 8@1O@86 51 065H4A12
! 实验过程
’ ,’ 仪器与试剂
固定化过程中酶的泄漏用紫外 E可见分光光度
计（&@54GH@，.4;4A，型号，PF#+QQ）检测。生成的甲醇
采用 &RS+*Q 型气相色谱仪进行分析。甲酸脱氨酶
（’ ,$ P / 0?）、甲醛脱氢酶（$ ,$ P / 0?）、醇脱氢酶（)*)
P / 0?）和电子供体 :97&（!*+ ,Q%）均购自 >@?04公
司。正硅酸甲酯购自武汉大学（含量!*S ,Q%）。海
藻酸钠购自上海天莲精细化工有限公司（含量!
** ,Q%，粘均相对分子质量为 S ,#T U ’QV）。其他试
剂均为分析纯。
’ ,# 9BC凝胶固定化酶
海藻酸溶液由干燥好的海藻酸钠溶于二次蒸馏
水配制得到，将甲酸脱氢酶（$,V 0?）、甲醛脱氢酶
（’,Q 0?）和 醇 脱 氢 酶（ ’,Q 0?）溶 解 于 ’ 0B
Q,QV 012 / B，;& T,Q
比为 #%。将溶解好的海藻酸 E酶混合液用 V号针头
滴加到#Q 0B Q,# 012 / B !4!2#溶液中，凝胶化 Q,V H
后，取出凝胶（!凝胶）经过二次蒸馏水洗涤后过滤备
用。
将溶解有甲酸脱氢酶（ $ ,V 0?）的 Q ,) 0B
Q ,QV 012 / B，;& T ,Q
甲酸脱氢酶的 9BC 凝胶。按照同样的方法制备含
甲醛脱氢酶凝胶和醇脱氢酶的 9BC 凝胶。并采用
紫外 E 可见分光光度计分别检测 ) 种酶的泄漏。将
所得 ) 种含单酶的 9BC凝胶总称为"凝胶。
’ ,) 9BCF>@"#凝胶固定化酶
取正硅酸甲酯 ’ ,$T 0B 与 9BC 溶液 $ 0B 剧烈
搅拌 V 0@A，然后迅速加入 ’ 0B三酶混合液（甲酸脱
氢酶 $ ,V 0?、甲醛脱氢酶 ’ ,Q 0?和醇脱氢酶’ ,Q 0?）
搅拌均匀后滴加入 #Q 0B Q ,# 012 / B !4!2#溶液中，凝
胶化 Q ,V H 后，取出凝胶（#凝胶）经过二次蒸馏水
洗涤后过滤备用。
将 甲 酸 脱 氢 酶（ $ ,V 0?）溶 解 于 Q ,) 0B
Q ,QV 012 / B，;& T ,Q
节中所配制的海藻酸溶液剧烈搅拌 V 0@A，迅速加入
甲酸脱氢酶溶液搅拌均匀，然后滴加入 #Q 0B
Q ,# 012 / B !4!2#溶液中，凝胶化 Q ,V H 后，即可制得
含酸脱氢酶的杂化凝胶，按照同样的方法制备得到
含甲醛脱氢酶和醇脱氢酶的杂化凝胶。并采用紫外
E可见分光光度计分别检测 ) 种酶的泄漏。将此 )
种含有单酶的凝胶总称为$凝胶。
’ ,$ 酶催化 !"#转化甲醇反应
将甲酸脱氢酶（$ ,V 0?）、甲醛脱氢酶（’ ,Q 0?）
和醇脱氢酶（’ ,Q 0?）溶于 # ,V 0B Q ,QV 012 / B
#QQV 年 + 月 许松伟等：9BCF>@"#杂化凝胶固定化多酶体系催化 !"#转化甲醇研究 ·SV·
万方数据
!"#!$%& ’ (。将含酶溶液加入密闭反应器中，通入
)*+并保持压力为 # ,- ./0，反应 1 2。取样用气相色
谱采用内标法分析甲醇含量。
将上述制得的 " 类凝胶加入至密闭反应器中，
按照上述游离酶酶促反应条件进行反应，用气相色
谱分析甲醇含量。
! 结果讨论
+ ,3 酶固定化过程
4(5是从褐藻中提取的一类直链高分子多糖，
由古罗糖醛酸（5段）和甘露糖醛酸（. 段）以!（36"）
糖苷链接而成，以二价金属离子，比如 )0+ 7、)8+ 7、
90+ 7、:;+ 7等引发即可得到 4(5凝胶。由于 4(5凝
胶生物相容性好、制备方便、成本低廉、固定化酶的
初始活性较高、底物和产物在其中的有效扩散系数
较大，因而是应用非常广泛的固定化载体。但是
4(5在酶包埋过程中存在在如下的缺陷［- < 1］：（3）
4(5多为水溶性高分子，水分子在高分子网络中传
递速度快而容易将溶于其中的酶洗脱造成酶的泄
漏；（+）4(5容易发生溶胀，加剧了酶分子的泄漏，同
时降低了凝胶的机械强度。针对上述问题，目前学
者采用不同方法对 4(5 凝胶进行改造，主要包
括［! < 33］：（3）与壳聚糖、聚丙烯酸等交联；（+）在 4(5
凝胶表面涂覆聚 !6赖氨酸、戊二醛等。但是这些方
法用于酶固定化后往往导致酶活性丧失［3+］。因此
本研究采用原位水解缩聚得到的二氧化硅对 4(5
凝胶进行修饰，通过有机 = 无机杂化凝胶来改善凝
胶结构，提高酶的包埋率和活性。
正硅酸甲酯在酸、碱或盐的催化作用下经过水
解而形成硅醇（>*6?@!），硅醇经过聚合而形成纳米
级的三维凝胶网络。而在本研究中，在没有另外加
入酸、碱等催化剂的条件下，二氧化硅在 4(5 溶液
中在很短时间内（ A +# $@;）经水解缩聚即可形成凝
胶网络。我们推测 4(5 分子对正硅酸甲酯的水解
和缩聚起到催化作用，因为通常正硅酸甲酯在没有
催化剂作用时需要若干天才能凝胶化。在正硅酸甲
酯水解过程，4(5 分子链上的古罗糖醛酸根和甘露
糖醛酸根可以水解为6)**>（B"0 分别为 C ,D- 和
C ,C1），而6)**>通过与正硅酸甲酯形成五元化合物
而与二氧化硅交联，促进正硅酸甲酯的水解。另外，
经过水解得到的硅醇会以 4(5为模板，依附 4(5链
形成纳米级的二氧化硅颗粒。将 4(5 与正硅酸甲
酯水解的混合物滴加入 )0)&+溶液中，)0+ 7与古罗糖
醛酸交联，即可形成三维凝胶网络。4(56?@*+杂化
凝胶的形成示意如图 + 所示。
图 + 4(56?@*+杂化凝胶形成示意图
E@F ,+ ?G2H$0I@GJ %K 4(56?@*+ L@%G%$B%J@IH K%M$0I@%;
+ ,+ 酶分子在 4(5凝胶中的泄漏
由于 4(5凝胶松散的结构和较大的网络孔径
（- < +## ;$），固定在 4(5凝胶中的酶分子经常发生
泄漏，泄漏率在 CCN < O#N之间［- < 1，3C］。将 4(5 溶
胶滴入 )0)&+溶液中后，)0+ 7 迅速与 4(5 表面的 .
段结合而在颗粒表面形成凝胶壳层。随着凝胶化过
程的进行，)0+ 7不断通过液膜和壳层扩散进入未反
应的内核与 4(5结合。随着凝胶化进程，凝胶颗粒
体积不断减小，凝胶中的水分子就会被排出凝胶颗
粒。由于酶分子三维尺寸大都小于凝胶孔径而被水
带出凝胶。所以，4(5 凝胶中水分子的泄漏直接影
响酶分子的泄漏。本研究中，通过比较凝胶化过程
中不同时刻凝胶颗粒的质量，测得在 4(5 和 4(56
?@*+中，水的泄漏率分别为 -! ,CN和 CD ,ON，这说明
在 4(56?@*+杂化凝胶中水泄漏率比在空白凝胶中有
明显降低，因而，由于水流失而导致的酶泄漏也大大
降低。另外，在 4(56?@*+杂化凝胶中，酶分子可能位
于 4(5凝胶网络和二氧化硅的界面处，或被包埋于
二氧化硅部分当中，因而难以发生泄漏，因此，C 种
脱氢酶在 4(56?@*+杂化凝胶中的泄漏率比 4(5 和
凝胶中低（图 C）。
·DD· 生物加工过程 第 C 卷第 C 期
万方数据
图 ! ! 种酶在 "#$和 "#$%&’()中的泄漏率
*’+ ,! #-./.+- 01 234-- -5678-1408 "#$ .59 "#$%&’() :’0;08%
<0=’2-=
) ,! 酶促催化 >()转化甲醇反应
采用游离酶和固定化酶作为生物催化剂能实现
>()到甲醇的转化，反应收率以 ?"@A用量为基准进
行计算。当收率为 BCCD时，每生成 B 80E 甲醇，需
消耗 ! 80E ?"@A，因此：
甲醇收率（D）F ! G 生成甲醇的量（80E）H ?"@A 加
入量（80E）G BCCD
图 I 脱氢酶酶催化 >()转化为甲醇的收率
*’+ ,I J’-E9= 01 8-23.50E 1408 >() ;.2.E67-9 2340K+3 9-36940+-%
5.=-=
从图 I 可以看出，游离酶和固定化酶都能成功
催化 >()到甲醇的转化，并且具有较高的甲醇收率。
游离酶催化 >() 转化为甲醇收率最高，达到了
LM ,MD，再次证明了酶催化剂的高效性。与游离酶
相比，固定化酶催化 >()转化为甲醇收率都有所降
低，这是由于酶泄漏，以及由于酶空间构象的微小变
化和空阻效应导致酶活降低所致。同时，与包埋于
"#$凝胶中的酶相比（!凝胶和"凝胶），包埋于
"#$%&’()凝胶（#凝胶和$凝胶）中的 ! 种酶具有更
高的催化活性和甲醇收率。这可能是由于包埋于
"#$%&’()凝胶中酶的泄漏率大大低于 "#$ 凝胶中
的；另外，"#$%&’()的凝胶环境更适于酶活性保持。
此外，对比!凝胶和"凝胶，以及#凝胶和$凝
胶时发现，将 ! 种脱氢酶混合后共同包埋于同一凝
胶（!凝胶和#凝胶）的酶活比将 ! 种脱氢酶分别包
埋的活性要高，这是因为将酶共同包埋后，! 种脱氢
酶极有可能被包埋于同一凝胶颗粒中，酶促反应的
中间产物（甲醛和甲酸）只需在同一凝胶颗粒中扩散
就能与连串反应中的下一种脱氢酶接触而发生下一
步反应，因此，中间产物的扩散路径大大缩短，更有
利于酶促反应发生。
本研究同时还考察了固定化酶的最适反应温度
和最适反应
适反应温度为 !N O，最适反应 结果表明，固定于 "#$凝胶和 "#$%&’()凝胶中的酶
促反应最适温度为 !N O（图 P），最适反应
反应条件能够得以保持。
—!—R5 "#$%&’()；—"—R5 "#$
图 P 温度对固定化酶催化转化甲醇收率的影响
*’+ ,P S-8<-4.2K4- -11-;2 05 23- 6’-E9= 01 8-23.50E ;.2.E67-9 :6
’880:’E’7-9 -5768-=
—!—R5 "#$%&’()；—"—R5 "#$
图 Q
将酶存放于 C ,CP 80E H #、E 溶液中
于 I O下保存，通过定期测定酶促反应甲醇的收率
)CCP 年 M 月 许松伟等："#$%&’()杂化凝胶固定化多酶体系催化 >()转化甲醇研究 ·QN·
万方数据
来确定酶活性的保持。由图 ! 可以看出，随着存放
时间增长，包埋于 "#$凝胶和 "#$%&’()凝胶的酶活
性都有所降低。尤其在存放的初始阶段，酶活降低
较快，这可能是酶与固定化载体以及反应底物 *产物
间的相互作用导致酶失活所致。随着存放时间增长
这种作用达到平衡，酶活能够在一定程度上得以稳
定保持。对于包埋于 "#$凝胶中的酶，使用过程中
酶泄漏是导致酶活持续降低的另一个主要原因。
—!—+, "#$%&’()；—"—+, "#$
图 ! 固定化酶存放活性
-’. /! &0123.4 5036’7’08 19 ’::16’7’;4< 4,;8:45
另外，随着重复使用次数的增加，酶活性也逐渐
减低，结果如图 = 所示。重复使用 >? 次，包埋于
"#$%&’()凝胶中的酶促催化 @()转化为甲醇的收率
仍然能达到 =?A以上，而固定于 "#$凝胶中的酶促
催化活性几乎降低为零。
—!—+, "#$%&’()；—"—+, "#$
图 = 固定化酶活性随使用次数变化
-’. /= "B0’C’08 19 ’::16’7’;4< 4,;8:45 C5 B8B74 ,D:642 ’, 0E244
F2101B175
! 结论
采用原位水解方法将二氧化硅通掺杂于 "#$溶
胶中，通过双交联制备出 "#$%&’()杂化凝胶，成功实
现了固定化 G 种脱氢酶催化 @() 到甲醇的转化。与
"#$凝胶相比，"#$%&’()结构更加紧密，酶的泄漏率
大大降低，酶活性得以很好保持。包埋于 "#$%&’()杂
化凝胶中的酶，存放 H? <以后或重复使用 >?次以上，
酶活性都能保持 =?A以上，与之相比，包埋于 "#$ 凝
胶中的酶活性几乎降低为零。将 G 种脱氢酶共同固
定于并实现 @() 到甲醇的转化，是 @()资源化的新工
艺、新探索；"#$%&’()杂化凝胶将作为一种简便、温
和、酶活保持率高的新型的固定化载体，用于酶和其
他生物大分子的固定化，能够应用于生物催化、生物
传感以及生物医学等领域。
参考文献：
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D: 37.’,304 .47 B3F5D745［J］I T,;8:4 Y’B216 V4BE，)???，)!：G>[%G)L I
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_’0E’, B37B’D: 37.’,304 .47 B3F5D745［ J］I U21B455 W’1BE4:，)??>，GH：
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37.’,304 643<5 B21557’,]4< _’0E @3) Z 3,< W3) Z ’1,5［ J］I b43B0 -D,B0
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［[］ c3,<4,642. $P，\21740 @，&B100 &#，40 37 I -3B0125 3994B0’,. F2104’, 24%
74354 921: 37.’,304%BE’0153, B13B42C304 :’B21B3F5D745
G?! I
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［>)］-23,B45B1 @，R’B173 V，J499248 "QI V1_32<5 3 9D778%58,0E40’B 5D650’0D04
19 37.’,304：<4C471F:4,0 19 3 ,4_ F21B455 D5’,. 0E42:37 .4730’1, 3,<
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［>G］&44:3 &W，&04C4, QR I +::16’7’;30’1, 19 7’F354 D5’,. E8<21FE’7’B F178%
:425 ’, 0E4 912: 19 E8<21.47 643<5［J］I W’1:3042’375，)??)，)G：G H)!%
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第 G 卷第 G 期
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生 物 加 工 过 程
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