全 文 ：May2008
·68·
生物加工过程
ChineseJournalofBioproeessEngineering
第6卷第3期
2008年5月
白地霉ch-3脂肪酶I基因在大肠杆菌中的表达
付建红1一，姚 斌3，杨浩萌3，欧阳平凯1，石玉瑚1，2
(1．南京工业大学制药与生命科学学院，南京210009；
2．新疆农业科学院 微生物应用研究所，乌鲁木齐830000；
3．中国农业科学院 饲料研究所，北京100081)
摘要：构建了白地霉脂肪酶1的基因工程菌，为进一步进行蛋白质工程改造和脂肪酶应用奠定了基础。从新疆
昌吉市油脂化工厂含油冻土中分离得到l株低温脂肪酶产生茵．白地霉eh-3。该茵发酵上清液中的脂肪酶最适作
用温度为35℃，在0℃仍可保持66％的相对酶活力。应用PCR技术从白地霉ch-3基因组DNA中克隆得到脂肪
酶I基因lipl，将该基因与原核表达质粒载体pET-22b(+)连接，构建重组质粒pET·却1，转化EcoliBL21(DE3)，
酶切鉴定，筛选得到重组茵。十二烷基磺酸钠-聚丙希酰胺(SDS．PAGE)显示重组脂肪酶I的相对分子质量约为
5．8×104，酶活为2．73U／mL，表明却l基因的表达产物具有正常的生物学活性。白地霉ch-3脂肪酶I基因tipl能
够在大肠杆菌中有效地表达。
关键词：大肠杆菌；白地霉ch-3；脂肪酶；基因克隆
中图分类号：Q812 文献标识码：A 文章编号：1672—3678(2008)03—0068—06
ExpressionoflipaseIgenefromGeotrichumcandidumch-3inEscherichiacoli
FUJian．hon91’2，YAOBin3，YANGHao．men93，OUYANGPing．kail，SHIYu．hul’2
(1．CollegeofLifeScienceandPharmaceuticalEngineering，N锄jingUniversityofTechnology，N叫ing210009，China；
2．AppliedMicrobiologyResearchInstitute，XinjiangAcademyofAsriculturalSciences，Urumqi830000，China；
3．InstituteofFeed，AcademyofChineseAgriculturalScience，Beijing100080，China)
Abstract：Aold--adaptedli ase·-producingstrainGeotrichumcandidumch·-3wasisolatedfromfrozensoil
containingoila dfat．Theoptimaltemperatureofthelipaseintheculturesupematantwas35℃．Itre—
mined66％activityat0℃．LipaseIgeneliplfromG．candidumch-3WasamplifiedbyPCRandin-
sertedintopET-22b(+)togeneraterecombinantpET—lipl．pET·liplwastransformedintoE．coliBL21
(DE3)．TheM，oftheexpressionpr ductwas5．8×104bySDS—PAGE．ThelipaseactivityWas
2．73U／mL，whichindicatedthclonedDNAfragmentencodedalipase．LipasegeneliplofG．candi—
dumch-3WasefficientlyxpressedinE．coli．
Keywords：E．coli；Geotrichumcandidum；lipase；genecloning
脂肪酶(又名甘油酯水解酶，Lipase，EC3．1．
1．3)是专门在异相系统或水不溶系统的油(脂)水
界面上分解脂肪的酶。脂肪酶能在有机溶剂中进
行催化酯合、酯交换等一系列反应，因而在食品、
收稿日期：2007-09-29
基金项目：新疆雏吾尔自治区自然科学基金资助项目(200421109)；新疆特殊环境微生物资源重点实验室资助项目(xJYS0203—2004—06)
作者简介：付建红(1970一)，女，河南平真人，副研究员，博士，研究方向：徽生物发酵与基因工程。
联系人：石玉瑚。研究员．博士生导师，E-mail：0h_719@163．com
万方数据
2008年5月 付建红等：白地霉eh-3脂肪酶I基因在大肠杆菌中的表达 ·69·
皮革、造纸、有机合成、油脂化工工业，以及洗涤
剂、化妆品、医疗医药等方面具有应用和潜在的应
用前景¨-4]。国内外已对多种脂肪酶的结构、作
用机理、基因序列、表达等做了较深人的研
究H。]。国外已克隆、鉴定了多个白地霉菌株脂
肪酶基因，其中白地霉ATCC34614和CMICC
335426的脂肪酶基因分别在酿酒酵母和毕赤酵母
中进行了表达¨0。¨J。国内对白地霉脂肪酶的研
究主要集中在菌种选育、酶学特性、发酵特性，有
关白地霉脂肪酶基因克隆的报道较少。据文献[4
—6]报道，一个白地霉菌株通常产生2个胞外脂
肪酶，而来源于不同白地霉菌株的脂肪酶虽基因
同源性较高，酶学性质和理化性质却不相同，目前
尚未有白地霉产生低温脂肪酶的文献报
道"-6,12-13]。本文报道了l株从低温环境中分离
的脂肪酶产生菌．白地霉eh-3，经酶学性质测定该
菌发酵液上清中的脂肪酶是低温脂肪酶。运用
PCR技术成功克隆了白地霉ch一3中的脂肪酶I基
因lipl，分析了坳1基因的结构。通过脂肪酶基因
lipl在原核细胞中的表达，验证了基因的功能。
1材料与方法
1．1 材料
1．1．1菌种与质粒
白地霉Geotrichumcandidumch-3为本实验室从
含油冻土中分离的菌株。大肠杆菌BL21(DE3)、质
粒pET-22b(+)和pGEM—Teasy载体均购自Promega
公司。
1．1．2培养基与培养条件
白地霉oh-3的保存和繁殖培养基为麦芽汁培
养基。
白地霉ch-3的摇瓶发酵培养基：可溶性淀粉质
量分数1．O％，豆油质量分数1．O％，玉米浆质量分
数2．0％，(NH。)2SO。质量分数0．1％，K2HPO。质量
分数0．5％，MgSO。质量分数0．1％，FeSO。质量分数
O．1％，pH8．0，于20℃下振荡培养48h。
重组大肠杆菌用LB培养，并添加100I上g／mL
的氨苄青霉素，培养温度为37cC。
1．1．3酶与试剂
RNase、TaqDNA聚合酶和pfuTaqDNA聚合酶均
购自清华天为时代公司；异丙基硫代够．D一半乳糖苷
(IPTG)、T4DNA连接酶购自Promega公司；限制性
内切酶和DNA胶回收试剂盒购自TakaRa公司；橄
榄油为中国医药集团上海化学试剂公司产品；聚乙
烯醇PVA，聚合度1750±50为天津市化学试剂三
厂产品，其他化学试剂均为国产或进口分析纯。
1．2方法
1．2．1PCR引物
根据酵母脂肪酶基因的保守区设计了1对简并
引物：c危却2(5’一CTCCCCGTSMTKKTBTGGAT-3’)
和chlip3(5’．CTYKCCGrITGTASGTGTYGTC．3’)用
于扩增白地霉ch-3的脂肪酶基因片段。
根据同源性比较结果，设计特异性引物：lipl—f
(5’一CAGTCGACCAGGCCCCCACGGCCGTTCTrAA一
3’)和却l—r(5’．GCCAGCGGCCCCTllAAC．
CGAAGAGAGTAACGTCAGACTG一3’)，用于扩增完
整脂肪酶基因lipl。在lipl—f中引入SalI酶切位
点，lipl-r中引入NotI酶切位点，用于构建大肠杆
菌重组质粒pET一洳l。以上引物均由上海生工生物
工程公司合成。
1．2．2白地霉ch-3基因组DNA的提取
以文献[14]方法提取基因组，用1．0％琼脂糖
凝胶电泳检测。
1．2．3PCR扩增脂肪酶基因片段
以抽提的G．candidumch-3基因组DNA为模
板，chlip2和chlip3为引物，进行PCR扩增。PCR反
应条件为94℃变性30s，54℃复性30s，72℃延伸
2min，32个循环。将PCR扩增得到的约300bp的
DNA片段连接到pGEM—T载体上进行测序。
l。2．4脂肪酶基因lipl的克隆
根据已获得的脂肪酶基因lipl的部分序列和
GenBank已报道的白地霉脂肪酶基因序列，设计了
一对特异性引物却l—f和坤l—r，采用高保真的
pfuTaq酶进行PCR扩增。PCR反应条件为95℃变
性3min，1个循环；94℃变性30s，6oC复性30s，
72℃延伸3min，30个循环，最后72℃延伸10min。
1．2．5重组质粒的构建
脂肪酶基因lipl的PCR产物经琼脂糖凝胶电
泳回收、纯化后用SalI／NotI双酶切，酶切片段纯
化后与同样双酶切的大肠杆菌表达载体pET．22b
(+)连接，获得重组质粒pET—lipl，转化大肠杆菌
BL21。通过酶切鉴定重组质粒pET一却l，从而筛选
出阳性克隆子。
1．2．6脂肪酶的诱导表达
含有pET—lipl和pET-22b(+)空质粒的重组大
万方数据
·70· 生物加工过程 第6卷第3期
肠杆菌分别在37℃振荡培养过液，以体积分数1％
接种量转接于8mL含Amp的LB培养基中，
200r／min培养至0D600在0．6—0．8，加入IPTG至终
浓度为0．4mmol／L，继续诱导培养4h后，离心收集
菌体和上清液。上清液用于酶活性测定，菌体用25
mmol／L磷酸缓冲液悬浮，进行超声波破碎。破碎后
的菌体上清液分别用于酶活性测定和SDS-PAGE电
泳分析。
1．2．7表达产物的酶活力测定
分别测定重组大肠杆菌的培养液上清和超声
波破碎后的大肠杆菌细胞周质中的脂肪酶活力。
以橄榄油为底物，采用NaOH滴定法测定酶活。酶
活单位定义为：在反应条件下，每min水解脂肪产生
1 l山mol脂肪酸的酶量为一个脂肪酶国际单位(U)。
2结果与讨论
2．I G，candidumch-3粗酶液酶学性质的测定
白地霉ch一3经摇瓶培养48h，离心取发酵液上
清分析酶的性质。由温度一酶活力曲线(图1)和pH．
酶活力曲线(图2)可以看到白地霉ch-3的发酵上
清液中脂肪酶最适作用温度为35℃，在0℃仍可保
持66％的相对酶活力，对热较敏感，最适作用pH为
8，表明G．candidumch-3产生的脂肪酶是低温脂
肪酶。
2．2 G．candidumch-3脂肪酶基因却1的克隆
以chlip2和chlip3为引物，从G．candidumch-3
基因组DNA中PCR扩增得到300bp左右的DNA
片段。测序结果表明，该扩增片段确为脂肪酶基因
片段，且包含2个脂肪酶基因的部分序列，其中如1
基因片段上含有单一XhoI酶切位点。
按方法1．2．4扩增脂肪酶基因t／p1，经质量分
数1．0％琼脂糖凝胶电泳检测，在1．6kb处可清晰
地见到特异性的条带(图3)。用SalI和NotI双酶
切PCR产物和pET一22b(+)，构建的重组质粒pET．
1ipl再转入E．coliBL21中。经重组质粒的酶切鉴
定筛选出阳性克隆子，再进行测序。测序结果表
明，得到的1．6kb扩增片段确为脂肪酶基因如1
(GenBank登录号：EF033077)。 ．
用XhoI酶切1．6kb的PCR产物，结果该特异
性片段被切成2个片段，见图4，表明却l基因序列
中含有1个XhoI酶切位点。因为z啦基因序列中
不含有XhoI酶切位点，所以该实验可用于区分脂肪
图l 温度对白地霉ch-3发酵液中的脂肪酶活力的影响
Fig．1Effectof emperatureonthelipaseactivityin
theculturesupematantofG．candidumch-3
pH
图2 pH对白地霉eh-3发酵液中的脂肪酶活力的影响
Fig．2EffectofpHonthelipaseactivityintheculture
supematantofG．candidumeh-3
l—PCRproduct；M一1kbDNAmolecularmarkers
圈3 PCR扩增白地霉eh-3的脂肪酶基因
却1的琼脂糖凝胶电泳
Fig．3Agarosegelelectrophoresisofamplified却lgene
encodinglipasefrom&candidumch-3byPCR
酶基因lipl和lip2。
2．3脂肪酶I与其他白地霉脂肪酶氨基酸序列的比较
脂肪酶基因全序列测定结果显示：lipl全长
1 635bp，无内含子，编码544个氨基酸，理论相对分
万方数据
2008年5月 付建红等：白地霉ch一3脂肪酶I基因在大肠杆菌中的表达 ·71·
1一却lgenedigestedbyXhoI；M—lkbDNAmolecularⅢ畦∞
图4 XhoI酶切脂肪酶基因lipl的琼脂糖凝胶电泳
Fig．4Agarosegelelectrophoresisoftiplgeneof
G．candidumch-3byXhoIdigestion
子质量为5．94×104。用SignalP服务器对已推导出
的氨基酸序列进行信号肽预测分析，结果脂肪酶基因
lipl中未发现信号肽序列。将lipl序列在NCBI进行
了blast比对，结果表明该序列和G．candidumNRCC
205002的脂肪酶基因序列的同源性最高。核苷酸序
列的同源性为99．6％，仅有6个核苷酸的差异：即
T72川，1rBl_C，A獬_T，C228_+A，A540_G，∥一A。
翻译后氨基酸序列的同源性为99．6％，仅有2个氨
基酸的差异：即171_+F，Sm_N。位于氨基酸序列的
215-219位的G．x．s—x．G在许多脂肪酶中有很高的保
守性，也是丝氨酸水解酶中最保守的序列。通过与白
地霉脂肪酶氨基酸序列的比对，推测Ser217一His463一
Glu354组成脂肪酶I的三联体催化中心(triad)。这个
triad的上方被“帽子”状的d．螺旋环状结构(Cys61-
Serl00)覆盖。脂肪酶I中含有5个Cys，可以形成两个
二硫键。位于“帽子”下方的残基Tyrl嚣-Ser”7可能参
与形成氧离子洞，它与脂类底物的结合有关。此外，
LIPl的氨基酸序列中有3个潜在的Ⅳ．糖基化位点：
Asn2昭，Asn364和缸n437。
lipl与6种白地霉脂肪酶的氨基酸序列进行联
配比较，结果表明这7种脂肪酶的氨基酸残基完全
相同的有520个，占95．6％。G．candidumch一3的
脂肪酶基因姊1与G．candidumNRCC205002、G．
candidumNRRLY-553、Glactomycesgeotrichum
BTl07、G．candidumATCC34614、G．candidu,mNR—
RLY-552以及G．candidumtriacyglyceml的脂肪酶
基因的同源性分别为99％、98％、98％、97％、97％
以及97％。同源性比较说明，来源于白地霉脂肪酶
基因的同源性较高。通过酶蛋白一级结构的比较，
还可以看出这7种脂肪酶具有以下共同点：催化活
性中心三联体都是Ser217、His463、Glu354；都含有4个
以上的Cys残基，至少可以形成2个二硫键；至少有
一个潜在的糖基化位点。这些共同点反映了来源
于白地霉脂肪酶的保守性和生物活性相似性的分
子基础。
2．4重组表达质粒的构建和重组子的鉴定
将脂肪酶基因lipl以正确的阅读框克隆到原核
表达载体pET-22b(+)上的信号肽编码序列pelB
之后，获得重组质粒pET—lipl(图5)。pET-lipl转化
E．coliBL21(DE3)，挑选转化子单菌落，提取质粒
DNA，经＆ZI／NotI双酶切得到与pET-22b(+)以
及目的基因tipl大小相符的片段(图6)，说明脂肪
酶基因tipl已插入到原核表达载体pET．
22b(+)上。
图5重组质粒pET—lipl的物理图谱
Fig．5Genemapofrecombinantpl smidpET-却l
1--RecombinantplasmidpET-／／pI；2，3一pEr-咖ldigestedb)rS越Ⅳ
NotI：M一1kbDNAmolecularm日rke玛
图6重组表达质粒的酶切鉴定
Fig．6Identificationofrecombinantpl smidsby
restrictionendonueleasedigestion
万方数据
· 72· 生物加工过程 第6卷第3期
2．5脂肪酶基因如1的诱导表达及SDS—PAGE分析
重组质粒pET一却1转化E．coliBL21，筛选出的
阳性克隆在IPTG诱导下表达脂肪酶lipl。12％
SDS—PAGE电泳结果显示，脂肪酶基因lipl的表达
产物在大约5．8×104处有明显的特异性表达蛋白
条带；而经诱导、含有空质粒pET-22b(+)的对照菌
在同一位置没有相应的条带(图7)，说明脂肪酶基
因lipl在大肠杆菌中得到了有效表达。分别测定重
组菌培养液上清和超声波破碎后细胞周质中的脂
肪酶活力，均为2．73U／mL，带空质粒的对照菌未测
到酶活，表明脂肪酶基因却1的表达产物具有正常
的生物学活性。通过酶活性测定和十二烷基磺酸
钠一聚丙烯酰胺(SDS—PAGE)电泳分析，可以确定
lipl的表达产物以可溶性的形式分别存在于重组大
肠杆菌的培养液上清和细胞周质中。
l—pmteinmarkers；2--thesupematantofcon rolharboringpET-22b
(+)afterinductionwithIPTG；3一tllesup matantofE．coliBL21
cellsharboringpET—ffplafterinductionw thWIG
图7脂肪酶tipl在EcoliBL21(DE3)中表达的
SDS—PAGE分析
Fig．7SDS·PAGEanalysisofthexpressionprotein
of如19eneinEcoliB121(DE3)
3结论
成功克隆了白地霉G．candidumch一3的脂肪酶
基因lipl，该基因含有1635个碱基，无内含子，编码
544个氨基酸，理论相对分子质量为5．94×104。
lipl的理化性质与其他白地霉脂肪酶有明显的不
同。lipl的理论相对分子质量较G．candidumATCC
34614的脂肪酶I和Ⅱ以及G．candidumCMICC
335426的脂肪酶A低，后面3种脂肪酶的相对分子
质量均为6．20×104；但高于CMICC335426的脂肪
酶B的相对分子质量(5．83×104)。lipl的等电点
为5．3，比白地霉ATCC34614和CMICC335426的
脂肪酶都要高u51。
根据白地霉脂肪酶三维结构分析的报
道‘卜6·10f16。173和一级结构的比较，可以预测G．can．
didumch-3的脂肪酶I立体结构中位于“帽子”结构
下方、参与氧离子洞形成的肽环Tyrl29_Ser”7上每一
个小的突变可能导致白地霉ch-3的两个脂肪酶I
和Ⅱ在底物特异性上不同。
实现了脂肪酶基因lipl在大肠杆菌中的有效表
达，重组菌酶活力为2．73U／mL。因此，脂肪酶基因
的表达量不是很高，可能的原因是原核细胞表达真
核基因的蛋白时，由于原核细胞的转录和翻译过程
是耦联的，表达过快使多数蛋白来不及折叠而形成
没有活性的包涵体。
经SDS—PAGE分析表明在大约5．8×104处有
明显的表达蛋白条带，lipl基因在大肠杆菌中的有
效表达为下一步基因的定点饱和突变，提高表达量
以及基因工程菌的工业应用打下了基础。
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壳牌拟研究新型生物汽油
壳牌石油公司将联合美国维仁特能源系统公司，共同研究将非粮植物糖分直接转变成生物汽油或汽油
调和组分。这种新型生物汽油可以高比例地加入到车用汽油中使用，而且不需要为此更改汽车发动机的设
计和制造专门的汽油调和设备。此次两家公司将研究使用催化剂直接将植物糖分转换成生物汽油，并在未
来实现商业化生产。这种新型生物汽油比传统的乙醇汽油具有更高能效，并且能够用于任何普通汽车或乙
醇汽油汽车。
日拟7a后实现低价生物燃料量产
日本经济产业省、新日本石油公司、丰田汽车公司和东京大学等产官学机构联合议定，拟于2015年前在
日本实现年产16．8万t低价生物燃料的量产目标。
生产生物燃料所使用的原料将以禾本科植物和柳树为主。在半径7km的土地上种植禾本科植物每年
可收获130万t原料，能生产8．4万一16．8万t生物燃料，未使用的农业用地也可得到有效利用。由于原料
栽培种植的费用很低，日本生物燃料的成本将大大降低，与进口乙醇相比具有很强的竞争力。
英国建造全球最大生物质能发电厂以木屑为发电燃料
全球最大的清洁能源发电厂在英国开始建造。这个电厂计划发电能力为350MW，将使用可再生能
源——木屑作为发电燃料，发电厂建在威尔士南部塔尔波特港废弃的海港上，投入使用后可为广大区域内
的用户提供绿色电力，这有助于英国可再生能源政策的成功推广，该电厂每年可以减少350万t的CO：排
量，电厂所使用的木屑全部来自美国、俄罗斯和乌克兰的可持续林场。英国能源大臣约翰·赫顿指出：“这
将是世界上最大的生物质能发电厂，其所产生的电量可为威尔士50％的家庭提供充足的清洁电力。”
(张春鹏)
万方数据