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ChineseJournalofBioprocessEngineering
Vol.10No.3
May2012
doi:10.3969/j.issn.1672-3678.2012.03.001
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:2011-09-22
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:1672-3678(2012)03-0001-05
EfectofcofactorregulationonsuccinateproductioninEscherichiacoli
duringdualphasefermentation
LIURongming,LIANGLiya,WANGGuangming,ZHANGMin,
MAJiangfeng,CHENKequan,JIANGMin,WEIPing
(ColegeofBiotechnologyandPharmaceuticalEngineering,NanjingUniversityofTechnology,Nanjing210009,China)
Abstract:Twostrains,includingE.coliNZN111anditsrecombinantstrainE.coliNZN111/pTrc99a
pncBwereinvestigatedastheproductionofsuccinate.Duringdualphasefermentation,E.coliNZN111
generatedsuccinateasthemainproducts,meanwhile,pyruvatewasaccumulated.Withtheoverex
pressedthenicotinicacidphosphoribosyltransferase,therecombinantstrainloweredtheconcerntrationof
pyruvate,eliminatedthegenerationofacetateandincreasedtheproductionofsuccinateunderdualphase
fermentationTheyieldofsuccinateandtheglucoseconsumptionratewasincreasedby139%,and
20%,respectively.
Keywords:E.coli;nicotinicacid;phosphoribosyltransferase;succinate
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(succinate)
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(U·mg-1)
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(U·mg-1)
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(U·mg-1)
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(μmol·g-1)
c(NADH)/
c(NAD+)
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E.coliNZN111/
pTrc99a pncB 965 043 471 2265 271 012
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。
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:
[1] McKinlayJB,VieileC,ZeikusGJ.Prospectsforabiobased
succinateindustry[J].ApplMicrobiolBiotech,2007,76(4):
727740.
[2] WilkeT,VorlopKD.Industrialbioconversionofrenewablere
sourcesasanalternativetoconventionalchemistry[J].ApplMi
crobiolBiotech,2004,66:131142.
[3] HongSH,LeeSY.Importanceofredoxbalanceontheproduc
tionofsuccinicacidbymetabolicalyengineeredE.coli[J].Appl
MicrobiolBiotech,2002,58:286290.
[4] WuH,LiZM,ZhouL,etal.Improvedsuccinicacidproduction
intheanaerobiccultureofanEscherichiacoliPflBldhAdouble
mutantasaresultofenhancedanapleroticactivitiesinthepre
cedingaerobicculture[J].ApplEnvironMicrobiol,2007,
73(24):78377843.
[5] VemuriGN,EitemanMA,AltmanE.Efectsofgrowthmodeand
pyruvatecarboxylaseonsuccinicacidproductionbymetabolicaly
engineeredstrainsofEscherichiacoli[J].ApplEnvironMicrobi
ol,2002,68(4):17151727.
[6]
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,
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.
Ëz{|=³ú=´KõV
01234
NZN111
:;<=>?@
[J].
M¶Ìo*
,
2011,27(10):110.
[7] SinghA,LynchMD,GilRT.Genesrestoringredoxbalancein
fermentationdeficientE.coliNZN111[J].MetabEng,2009,
11(6):347354.
[8] AusubelFM,BrentR,KingstonRE.Shortprotocolsinmolecular
biology[M].Beijing:SciencePress,1999:240251.
[9] VinitskyA,GrubmeyerC.Anewparadigmforbiochemicalenergy
coupling:Salmonelatyphimurium nicotinatephosphoribosyl
transferase[J].JBiolChem,1993,268(34):2600426010.
[10]
+v
,
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,
§ï.
,
ø
.
CD89QR=ês
NAD+
~
NADH
££æ>v/
[J].
0ùÑÄ
,2008,33(12):
254257.
[11] WubboltsMG,TerpstraP,BeilenJBV,etal.Variationofcofac
torlevelsinEscherichiacoli[J].JBiolChem,1990,265:17665
櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒
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