全 文 ：亚硝化菌株的筛选及其初步鉴定
沈珈琦，方 苹，范伟平!
（南京工业大学 制药与生命科学学院，南京 !"###$） 摘 要：从化工废水和城镇污水生物处理反应器水中取样，用斯凯尔曼亚硝化假单孢杆菌培养基及硅胶平板分离 得到 %株可以利用氨氮生长的菌株，并对其形态和生理生化性状进行分析。初步研究结果表明，它们可能分属硝 化菌、丝状菌和假单孢菌。在溶氧浓度大于 " &’()的液体培养基中，以上菌株能够将氨氮转化为 *+,! ，基本没有 *+,- ，又能将氨氮转化为气态氮，且水中 *+,! 和 *+,- 不再累积，分别保持在小于$ &’()和小于 !.# &’()的水平。
关键词：硝化；反硝化；丝状；假单孢
中图分类号：/"0! 文献标识码：1 文章编号："20! , -203（!##%）#" , ##-# , #4
!"#$%&$’()% ’$* (%"+’&*, ’), -$(.’$(+/ (,*)&(0(*, 0"$ )(&$(0(1’&(") 567* 89:;<9，=1*> ?9@’，=1* AB9;C9@’ （DEFFB’B EG )9GB 5H9B@HB :@I ?J:K&:HL，*:@M9@’ N@9OBKP9QL EG RBHJ@EFE’L，*:@M9@’ !"###$，DJ9@:）
23%&$’1&：=ESK PQK:9@P T9QJ J9’JBK :HQ9O9QL EG :&&E@9: IB’K:I:Q9E@ TBKB 9PEF:QBI T9QJ P9F9H: ’BF CF:QB :@I 5UBK; &:@’P &BI9S& GEK @9QK9G9H:Q9E@ GKE& T:PQBT:QBK QKB:Q&B@Q PLPQB& EG HJB&9H:F CF:@QP :@I QJB QKB:Q&B@Q PLPQB& EG IE&BPQ9H T:PQBT:QBK. RJKES’J :@:FLV9@’ CJLP9EFE’9H:F CKECBKQ9BP，QJB GESK PQK:9@P &:L WB 9IB@Q9G9BI 9@QE !"#$%&
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,-+.%("/$%0"1(具有反硝化酶系与固氮酶系，更具借 鉴意义。 本文从污水中筛选分离得到 %株特殊的脱氮菌 株，通过培养，对其形态、生理生化性质和脱除氨氮 性能进行了研究，为强化生物脱氮过程提供有意义 的微生物学数据。 ! 收稿日期：!##%;#";#% 基金项目：江苏省自然科学基金项目 \[!##!#"$
作者简介：沈珈琦（"$3#;），女，硕士研究生，研究方向：环境工程。 联系人：范伟平教授，7;&:9F：=TCVJS] PEJS. HE& =BWY !##% ·-#· 生 物 加 工 过 程 DJ9@BPB 8ESK@:F EG \9ECKEHBPP 7@’9@BBK9@’ 第 !卷第 "期 !##%年 !月 万方数据 ! 材料与方法 !"! 硝化菌株的分离 !"!"! 培养基 采用斯凯尔曼亚硝化假单孢杆菌液体培养 基［!#］及硅胶平板［!!］，所不同的是在中和、凝结硅酸 钠溶液制作硅胶平板时，本实验中用硫酸溶液取代 盐酸溶液。 !"!"$ 菌株分离
分别从南京炼油厂的污水处理车间隔油池、曝
气池、氧化塘及锁金村城市污水处理厂的活性污泥
池水样取 %# &’，采用斯凯尔曼亚硝化假单孢杆菌
液体培养基（其中（()*）$+,*质量浓度为 #"$-. /0’，
1) 2"$左右）于温度 .# 3，转速为 !$# 40&56摇瓶培
养进行富集。采用格里斯试剂［!$］在白瓷板上检验 (,7$ 是否生成而定取舍。经过多次重复操作后，取
上清液 ! &’涂布于硅胶平板，于 .# 3的培养箱中
培养。挑取单菌落接于斯凯尔曼液体培养基内，于
同样的温度与转速培养。! 周后，检测氨氮的剩余
含量，同时检测亚硝酸根的浓度和硝酸根的浓度，由
此复筛出降解氨氮效果明显的 !2株菌。将上清液
再涂布于琼脂平板上培养和划线分离。经多次重复
分离得到 *株具有硝化能力较强的菌株。
!"$碳源利用实验 对于分离得到的 * 株菌，采用统一的氮源 （()*）$ +,*，进行碳源利用实验
［!.］以鉴别其类属。
碳源分别为质量浓度 $/0’的乙酸钠、苹果酸、葡萄 糖、乙酰胺、甘油、蛋白胨培养基。碳源试验接种培 养（接种量 !#8，下同）.、%、2、9 : 后，测定菌体数 量。重复 .次。 !". 脱氮实验 对所筛分得到的菌株，以 !#8的接种量接种于 斯凯尔曼液体培养基中，（其中氮源采用同样浓度的 （()*）$ +,*）摇床培养。接种后即取样检测其氨氮、
亚硝酸盐氮、硝酸盐氮和总氮含量，作为起始数据。
以后每天取样分别检测氨氮、亚硝酸根、硝酸根和总
氮的含量。分别考察各菌株的硝化、反硝化能力。
!"* 分析方法
!"*"! 氮的定量与定性测定
氨氮、亚硝酸盐氮、硝酸盐氮和总氮的含量分别
采用纳氏试剂光度法［!$］、!;（!;萘基）;乙二胺光度 法［!$］、酚二磺酸光度法［!$］和过硫酸钾氧化;紫外分 光光度法［!$］进行检测，亚硝酸根的定性检测和硝酸
根的定性检测见参考文献［!$］，并应用分光光度计 在 <<# 6&波长位置检测其吸光值以计量菌体生长 相对量。 !"*"$ 菌体形态分析
用接种环挑取平板菌落的菌体，涂抹在载玻片
上，滴加 !0* 滴无菌水，加盖盖玻片，用带拍摄装置
的 ,=>&1?@ A);$型光学显微镜进行显微拍摄。而 对于难以挑取的菌落，采用液体培养之后再显微摄 影为宜。 " 结果与讨论$"! 菌株的形态特征
经十几次富集和分离，最终获得 *株菌株：$、.、 !!、!.号。其菌落特征如下： （!）$ 号菌：透明针尖状，湿润，菌落不易观察
到，易挑取，菌落正反面颜色一致。
（$）.号菌：正面白色，表面干燥，不透明，呈紧 密的丝绒状，似一层白色干粉敷于菌落表面，菌落和 培养基连接紧密，难以挑取；培养后期平板反面为棕 褐色。 （.）!!号菌：红色扁平状，湿润，且较光滑透明， 易挑取，菌落正反面颜色一致，在 BC培养基上菌落 颜色呈亮黄色。 （*）!.号菌：乳白色，表面干燥，不透明，微微隆 起，较易挑取，菌落正反面颜色一致。 由于 .号菌难以挑取，则将菌落表面的白色干 粉接种于液体培养基中培养，挑取肉眼可见的白色 小球染色做显微摄影。* 株菌的显微摄影照片（放 大倍数为 ! ###倍）见图 ! D *。 图 !$号菌
E5/"! +F4G56 ##*年 $月 沈珈琦等：亚硝化菌株的筛选及其初步鉴定 ·.!· 万方数据 图 ! "号菌 #$%&! ’()*$+ " 图 " ,,号菌 #$%&" ’()*$+ ,, 图 - ,"号菌 #$%&- ’()*$+ ," 从照片中可以初步断定 ! 号和 ," 号菌属于球 菌科，,,号菌属于杆菌科，"号菌应属于丝状菌。 -株菌的形态特征分别见表 ,和表 !，生理生化 初步鉴定实验结果如表 "所示。 对照《伯杰氏鉴定细菌学手册》，根据菌株的形 态特征和生理生化特性，初步认为 !号菌可能属于 自养硝化菌 !"#$%&%’%()& &*，其它菌可能属于异养
菌，,,号菌可能属红假单孢菌 +,%$%*&-./%’%()& &*， 根据显微形态、菌丝插片和孢子印迹推测，"号属丝 状菌 01*,%’"2$%3".’ &*，,"号亦可能属于假单孢菌。
表 , -株菌的菌落形态特征
.*/01 , .21 3404+5 32*)*3(1)$6($36 47 (21 748) 6()*$+6 菌株号 ! 9 " 9 ,, 9 ," 9 菌落形状 圆形 圆形 圆形 不规则 大小:;; <=! ! , , 边缘 规则 不规则 不规则 光滑 透明度 透明 不透明 半透明 不透明 表 ! -株菌的菌体显微形态特征 .*/01 ! .21 32*)*3(1)$6($36 47 (21 748) 6()*$+6
菌株号 ! 9 " 9 ,, 9 ," 9
显微镜检菌体形状 近球状 丝状 短杆 球状
有无芽孢 无 无 无 无
菌体大小:!; 直径
<&> ? ,&<
孢子约
,&" @ <&>
,&< ? !&<
@ <&>
直径
,&< ? !&>
表 " 菌的生理生化特性
.*/01 " .21 A256$404%$3*0 *+B /$4321;$3*0 32*)*3(1)$6($36 47 (21
748) 6()*$+6 菌 株 ! 9 " 9 ,, 9 ," 9 好厌氧性 好氧 好氧 好氧 好氧 甲基红实验 C C C C 吲哚实验 D D D D E= F=反应 D D D D GC :GH GH GC GH GC 斯凯尔曼培养基生长情况 生长 生长 生长 生长 高氏一号培养基生长情况 不生长 生长 不生长 不生长 IF培养基生长情况 不生长 不生长 生长 不生长 !&! 碳源利用的比较 -株菌采用统一的氮源（JK-）! ’L-，进行不同碳 源利用实验，考察 M B所得结果如表 -所示。 表 - -菌株在 M种碳源上生长情况比较 .*/01 - .21 %)4N(2 47 (21 748) 6()*$+6 $+38/*(1B 4+ 61O1+ 3*)/4+ 648)316 P*)/4+ 648)316 G)4N(2 47 (21 6()*$+6（45QQ<）
! 9 " 9 ,, 9 ," 9
J* *31(*(1 <&R*0$3 *3$B <&<G083461 <&<T31(*;$B1 <&< <&<,- <&<,! <&<,!<br’833$+*(1 <&<,! <&<,! <& <&G0531)40 <&<"S <&<"- <&<,- <&F1A(4+1 <&<,! <&<," <&·"!· 生物加工过程 第 !卷第 ,期
万方数据
由表 !我们发现，" 号菌基本不能利用有机碳
源；其余 #株菌中，$#号菌的菌体浓度较高，碳源的 利用程度相应也较高些。在培养中，我们发现 #号 菌结成了白色小球，直径大约为$ %%，在培养后期
白色小球中部出现褐色小点，说明可能产生了色素。
$$号菌在含有丁二酸钠的培养基中液体呈现混浊 的绿色，进一步说明其属于假单孢菌。 "&# 氨氮脱除效果 图 ’ ( )分别显示了 !株菌脱氮效果情况。 —!—*+# ,*；—"—*-" ,*；—#—*-# ,*；— .—/0123 * 图 ’ "号菌的脱氮效果图 456&’ /78 8998:1 09 ;51<068; <8%0=23 >? @1<25; " —!—*+# ,*；—"—*-" ,*；—#—*-# ,*；— .—/0123 * 图 A #号菌的脱氮效果图 456&A /78 8998:1 09 ;51<068; <8%0=23 >? @1<25; # 由图中我们可以看到 !个锥形瓶中氨氮含量都 有了不同程度的下降，B+值一直维持在 A&C至 C&" 之间，所以由于吹脱的缘故造成氨氮浓度的下降并 不占主导地位，由此可见 !株菌都具有一定的降氨 氮的能力；其中 #号菌降解氨氮的效果最明显，氨氮 质量浓度从原来的 !’&CC %6DE降至 #&)" %6DE。 !株菌的亚硝酸盐氮含量都处于较低水平（小 于 F %6DE），而且其 *-G" 的质量浓度变化幅度不大， —!—*+# ,*；—"—*-" ,*；—#—*-# ,*；— .—/0123 * 图 C$$ 号菌的脱氮效果图
456&C /78 8998:1 09 ;51<068; <8%0=23 >? @1<25; $$
—!—*+# ,*；—"—*-" ,*；—#—*-# ,*；— .—/0123 *
图 ) $#号菌的脱氮效果图
456&) /78 8998:1 09 ;51<068; <8%0=23 >? @1<25; $#
其中 #号菌的 *-G" 质量浓度最高（)&## %6DE），积累
的也最多。
!株菌的硝酸盐氮含量基本一致，维持在 $&’
%6DE左右，表明菌体在代谢过程中基本没有积累
*-G# 。
总氮都有不同程度的下降，而 #号菌总氮的脱
除量最多，在 C H内脱除近 #I %6DE。其他 #株菌的
脱除量也在 "I %6DE以上。
以上实验检测结果显示总氮含量减少，说明水
中的氮以气态形式脱离了培养液。#号菌的氨氮和
总氮的去除效果最好，亚硝酸盐的积累最多，而培养
液中硝酸根的浓度却和其它菌株的相当。
! 结 论
#&$ 本文分离得到的 !株菌能够有效利用铵盐为
"II!年 "月 沈珈琦等：亚硝化菌株的筛选及其初步鉴定 ·##·
万方数据
能源物质，在溶氧质量浓度大于 ! "#$%和营养缺少
等恶劣条件的液体培养中，能够将氨氮转化为气态
氮。
&’( 结合形态和生理生化特性分析，本文分离得到
的 ) 株菌初步鉴定可能分属于 !"#$%&’()%*’+& ,#，
-,.+/%&%01, ,#，2$%)%#,.+/%&%01, ,# 和 3’4)%,%&%01,
,#。硝化细菌具有自养型、生长速率低等主要特性
决定了它们在污水处理系统的含量较低，因此本实
验分离得到的异养硝化菌在脱除氨氮的工艺过程中
将会有广泛的应用前景。
&’& 至今，已被正式报道的硝化细菌（包括自养菌
和异养菌）大都分属以下 & 类：3’4)%,%&%01, ,#，
-,.+/%&%01, ,# 和 56(16’7.0., ,#。本 文 报 道 的
!"#$%&’()%*’+& ,# 为首次报道的异养型亚硝化微生
物。其亚硝化能力较强，可能是因为其同化代谢和
异化代谢共同利用氨氮的结果。
参考文献：
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