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Preparation and quality evaluation of tea polyphenol liposomes by reverse-phase evaporation

逆相蒸发法制备茶多酚脂质体及质量评价



全 文 :第7卷第2期
2009年3月
生 物 加 工 过 程
ChineseJournalofBioprocessEngineering
Vol.7No.2
Mar.2009
收稿日期:2008-08-13
作者简介:任文霞(1983—),女,河南通许人,硕士研究生,研究方向:营养与食品卫生;李建科(联系人),教授,Email:jiankel@snnu.edu.cn
逆相蒸发法制备茶多酚脂质体及质量评价
任文霞,李建科
(陕西师范大学 食品工程与营养科学学院,西安 710062)
摘 要:采用逆相蒸发法制备茶多酚脂质体并进行质量评价。通过二次回归旋转组合设计优化茶多酚脂质体制备
工艺及配方,对其形态、结构、粒径分布等性质进行考察。研究结果表明,最佳配方为 m(大豆卵磷脂)∶
m(胆固醇)=3∶1、茶多酚质量浓度为7mg/mL、V(有机相)∶V(水相)=4∶1、磷酸盐缓冲液浓度15mmoL/L,此条件
下包封率为5037%;所制备的茶多酚脂质体形态呈圆球形或椭球形,为大单室脂质体,有效粒径为1653nm,Zeta
电位为-693mV。逆相蒸发法制备茶多酚脂质体方法简单可行,所制备的脂质体具有一定缓释性。
关键词:脂质体;逆相蒸发;茶多酚
中图分类号:Q946.8    文献标志码:A    文章编号:1672-3678(2009)02-0068-06
Preparationandqualityevaluationofteapolyphenolliposomesby
reversephaseevaporation
RENWenxia,LIJianke
(ColegeofFoodEngineeringandNutritionalScience,ShaanxiNormalUniversity,Xi′an710062)
Abstract:Teapolyphenolliposomeswerepreparedbyreversephaseevaporation.Thequadraticrotation
regressionorthogonalcombinationwasdesignedtooptimizethetechniqueparameters,andtheindicesin
cludingthecharacter,structureandparticledistributionofteapolyphenolsliposomeswereinvestigated.
Theoptimalconditionswereasfolows:ratioofsoybeanphospholipidstocholesterolwas3∶1(m/m),the
concentrationofteapolyphenolswas7mg/mL,theratioofoilphasetoaqueousphasewas4∶1(V/V),the
concentrationofphosphatebufersalinewas15mmol/L.Theencapsulationeficiencywasupto
5037%.Theshapeofthelipsomeswassphericalorelipsoidalandthestructureofthelipsomeswas
largeunilamelarvesicles.Theefectivediameterwas1653nm,andthezetapotentialwas-693mV.
Thepreparationofreversephaseevaporationwassimpleandfeasible.Thepreparedlipsomeshadrelea
singfunctionofteapolyphenols.
Keywords:liposome;reversephaseevaporation;teapolyphenol
  茶多酚(teapolyphenol,TP),是茶叶中所含的
一类多羟基酚类化合物的总称,大多属缩合单宁,
因其大部分溶解于水,所以又称为水溶性单宁,是
茶叶的主要有效成分,占茶叶干质量的 20% ~
30%[1]。茶多酚具有清除自由基、抗衰老、抗肿瘤、
抗辐射、降血脂、降血压等药理功能,还有消炎利
尿、解酒等功效[2]。但茶多酚脂溶性较差,生物利
用度低,易被氧化,从而限制了它在医药和食品等
行业中应用[3]。脂质体作为药物载体,是一种相对
较新的微胶囊化技术,具有有效防止被包裹药物氧
化、提高稳定性、提高生物利用度、使被包裹药物具
有靶向性、天然无毒、生物可降解、无免疫抑制作用
等优点[4-5]。本试验利用脂质体将茶多酚进行包
覆,采用逆相蒸发法制备茶多酚脂质体,通过二次
回归旋转组合设计优化茶多酚脂质体制备工艺及
配方,并对其进行质量评价,为开发茶多酚新剂型、
扩大其在保健食品行业的应用提供一定的理论与
试验依据。
1 材料与方法
11 试验材料
茶多酚(纯度为95%),西安沃尔森生物技术有
限公司;大豆卵磷脂(soybeanphospholipids,SPC),
北京双璇微生物培养基制品厂;胆固醇(cholesterol,
CH),西安舟鼎国生物技术有限公司。三氯甲烷、
Na2HPO4、NaH2PO4、磷钨酸及其他试剂均为国产分
析纯。
12 主要仪器
KQ3200B型超声波清洗器,昆山市超声仪器有
限公司;TU 1810型紫外可见分光光度计,北京普析
通用仪器有限责任公司;MoticBA300型光学显微镜,
北京麦克奥迪显微镜公司;H 600型透射式电子显
微镜,日本日立公司;BI 90Plus型激光粒度仪,美国
布鲁克海文仪器公司;ZetasizerNanoZS型Zeta电位
仪,英国马尔文仪器有限公司;DF 101S型集热式恒
温加热磁力搅拌器,巩义市英峪予华仪器厂。
13 试验方法
131 标准曲线的建立
配制质量浓度为300μg/mL的水溶液作为标准
贮备液。精密移取贮备液0125、025、05、1、15、
2、25和3mL,用蒸馏水定容至25mL即得标准应用
液。以蒸馏水为空白对照,在274nm处用紫外可见
分光光度计测定吸光值 A(y)。以茶多酚质量浓度
为横坐标,吸光值为纵坐标,建立标准曲线。茶多
酚在质量浓度为15~36μg/mL范围内与吸光值
有良好的线性关系,线性方程为:y=00234x+
00011,R2=09999。
132 茶多酚脂质体的制备[6-7]
精密称取一定量的卵磷脂和胆固醇于梨形瓶
中,加入氯仿使其溶解,再加入磷酸盐缓冲茶多酚
溶液,超声3~5min得乳浊液,30℃旋转至干成膜,
加入001mol/LpH65的磷酸盐缓冲溶液(PBS)
40mL,继续旋转使膜溶解并充分水合,过08μm滤
膜,即得茶多酚脂质体。同时以不加入茶多酚,其
他操作同上做空白脂质体。
133 茶多酚脂质体包封率的测定方法
精密吸取等量茶多酚脂质体和空白脂质体于
离心管中,15000r/min离心30min,取上清液;定
容至25mL,以离心后的空白脂质体作为对照,于
274nm处测定其吸光值,代入回归方程,得未包入
脂质体中药物量(ρ游离)。精密吸取等量茶多酚脂质
体和空白脂质体于试管中,分别加适量无水乙醇破
乳,漩涡3min,移至离心管中,然后以15000r/min
离心30min,取上清液,定容至25mL,以离心后的空
白脂质体作为对照,于274nm处测定其吸光值,代
入回归方程,得总药物量(ρ总)。包封率计算为
包封率(%)=(ρ总 -ρ游离)/ρ总 ×100%
134 试验设计
茶多酚脂质体制备配方采用二次回归旋转组
合设计方法[8],试验因子水平及编码见表1,其中,
X1为SPC与CH的质量比、X2为茶多酚质量浓度、X3
为有机相与水相的体积比、X4为磷酸缓冲液的浓度。
表1 试验因素及水平编码
Table1 Factorsandlevelsoftheexperiment
水平
因素
X1
m(SPC)∶
m(CH)
X2
ρ(茶多酚)/
(mg·mL-1)
X3
V(有机相)∶
V(水相)
X4
c(PBS)/
(mmoL·L-1)
-2 1∶1 1 2∶1 5
-1 2∶1 3 3∶1 10
0 3∶1 5 4∶1 15
1 4∶1 7 5∶1 20
2 5∶1 9 6∶1 25
135 光学显微镜下观察实验
取适量茶多酚脂质体于光学显微镜油镜下观
察并拍照。
136 透射电子显微镜下观察实验
采用负染法。取1滴茶多酚脂质体滴于放在滤
纸上的铜网上,晾干,再将铜网置于蜡板上,用2%
的磷钨酸染色3~5min,用滤纸小片从铜网边缘吸
干多余染液,晾干,用透射电子显微镜观察并拍照。
观察其粒径大小和形态。
137 茶多酚脂质体粒度测定
用激光粒度仪测定茶多酚脂质体粒度分布。
96 第2期 任文霞等:逆相蒸发法制备茶多酚脂质体及质量评价
138 茶多酚脂质体Zeta电位的测定
用Zeta电位仪测定茶多酚脂质体电位,以确定
荷电性质。
139 茶多酚脂质体外释放度研究[9-10]
精密移取质量浓度均为665μg/mL的茶多酚溶
液和茶多酚脂质体混悬液6mL,加入已处理好的透
析袋中,悬置于装有 pH为 65的等渗 PBS的
150mL烧杯中,在37℃水浴中磁力搅拌,分别于
05、1、2、3、4、6、8、12、24h取5mL透析外液(同时
补充等量新鲜 PBS),定容至10mL,以蒸馏水作为
对照,于274nm处测定其吸光值。将吸光值代入标
准曲线,计算释放的茶多酚总量,根据下式计算各
时间点的累积释放量(Qn)。
Qn =ρnV0+∑ρiVi
式中:ρn为各时间点的实际药物质量浓度,μg/mL;
V0为溶出介质的总体积,mL;ρi为i时刻各取样点实
测药物质量浓度,μg/mL;Vi为每次取样体积,mL。
累积释放百分率(%)=Qn/ρtV0
式中ρt为总药物质量浓度,μg/mL。
1310 茶多酚脂质体稳定性的测定
脂质体的稳定性是另一个重要的评价指标,它
在一定程度上决定了脂质体存放和使用期限。在
4℃条件下将试样放置0、5、10、15、20、25和30d,
测包封率(Y)的变化。
2 结果与讨论
21 逆相蒸发法制备茶多酚脂质体配方的优化
在预试验的基础上,选用四因素的二次回归旋
转组合设计表进行试验,优化逆相蒸发法制备茶多
酚脂质体的配方,结果见表 2。并运用 DPSv301
分析软件对表2中的试验结果进行统计分析。
211 四元二次回归方程的建立与检验
据表2结果,计算各项回归系数,以这些回归系
数建立茶多酚脂质体包封率(Y)与 SPC与 CH的质
量比(X1)、茶多酚质量浓度(X2)、有机相与水相的
体积比(X3)、磷酸缓冲液的浓度(X4)四因素的数学
回归模型:
Y=4987000-199125X1+257458X2+183208X3-
103792X4-274656X

1-207781X

2-233531X

3-
241281X24 +094437X1X2 +416313X1X3 +
085812X1X4+169813X2X3-030937X2X4+
023438X3X4
表2 试验设计与结果
Table2 Experimentdesignandresults
试验号 X1 X2 X3 X4 Y/%
1 1 1 1 1 4705
2 1 1 1 -1 4898
3 1 1 -1 1 3219
4 1 1 -1 -1 3517
5 1 -1 1 1 3735
6 1 -1 1 -1 4107
7 1 -1 -1 1 3029
8 1 -1 -1 -1 3108
9 -1 1 1 1 4321
10 -1 1 1 -1 4908
11 -1 1 -1 1 4349
12 -1 1 -1 -1 5147
13 -1 -1 1 1 3869
14 -1 -1 1 -1 4158
15 -1 -1 -1 1 4604
16 -1 -1 -1 -1 5245
17 -2 0 0 0 3207
18 2 0 0 0 3959
19 0 -2 0 0 3108
20 0 2 0 0 4593
21 0 0 -2 0 3269
22 0 0 2 0 4226
23 0 0 0 -2 3525
24 0 0 0 2 3908
25 0 0 0 0 4770
26 0 0 0 0 4618
27 0 0 0 0 5172
28 0 0 0 0 5453
29 0 0 0 0 4587
30 0 0 0 0 4801
31 0 0 0 0 5436
32 0 0 0 0 4559
33 0 0 0 0 4684
34 0 0 0 0 5312
35 0 0 0 0 4995
36 0 0 0 0 5457
  由方差分析可知,回归方程的失拟性检验 F1=
2815,其值小于294(F005(10,11)),表现为不显
著,可以认为所选用的二次回归模型是适当的;回
归方程的显著性检验 F2=4274,其值大于 349
07 生 物 加 工 过 程   第7卷 
(F001(14,21)),表现为极显著,说明模型的预测值
与实际值吻合非常好,模型成立。对回归系数显著
性检验,在 α=010显著水平剔除不显著项,得到
优化后的方程为
Y=4987000-199125X1 +257458X2 +
183208X3-274656X

1-207781X

2-
233531X23-241281X

4+416313X1X3
212 脂质体配方的优化
经DPS软件对试验最优工艺参数的统计分析
结果可知,逆向蒸发法制备茶多酚脂质体最佳处方
为:SPC与 CH质量比 3∶1、茶多酚质量浓度
7mg/mL、有机相与水相体积比为4∶1、磷酸缓冲液
的浓度为15mmol/L。在该配方下,数学回归模型预
测的包封率为5037%。在上述配方下,经过试验
验证,茶多酚脂质体的包封率为5142% ,此数值与
理论值较接近,这进一步验证了数学回归模型的合
适性。脂质体的制备方法有逆相蒸发法、薄膜法、
复乳法、注入法[11]等。其中,逆相蒸发法可包裹较
大的水容积,适合包裹水溶性药物、大分子生物活
性物质等[7]。茶多酚为水溶性,故采用逆相蒸发法
来制备,达到了预期试验结果。
22 茶多酚脂质体形态、结构观察结果
光学显微镜下观察结果(图1),由图1可知,茶
多酚脂质体轮廓清晰,呈球形或椭球形。
图1 TP脂质体光学显微镜下图片(10×100)
Fig.1 LightmicroscopepictureofTPliposomes(10×100)
  透射电子显微镜下观察结果如图2所示。由图
2可见,茶多酚脂质体结构为大单层,这与文献[7]
所报道的逆相蒸发法制备脂质体可得到大单层脂
质体的结论相符,达到了预期结果。
23 茶多酚脂质体粒径分布结果
用激光粒度仪测试茶多酚脂质体的粒径分布,
结果如图3所示。由图3可知,脂质体的粒径呈正
态分布,有效粒径为1653nm,多分散系数为
0260,粒径分布均匀。
图2 TP脂质体透射电镜下图片(×10000)
Fig.2 TEM pictureofTPliposomes(×10000)
图3 TP脂质体粒径分布
Fig.3 ParticlesizedistributionofTPliposomes
图4 TP脂质体Zeta电位
Fig.4 ZetapotentialofTPliposomes
24 茶多酚脂质体Zeta电位测定结果
用Zeta电位仪测试茶多酚脂质体电位,结果如
图4所示。由图4可知,脂质体电位为 -693mV。
据文献[12]报道,荷电荷的脂质体能够减少相互间
的聚集和融合,增加稳定性,Zeta电位是衡量电荷多
少的一个重要指标,当Zeta电位大于60mV(或小于
17 第2期 任文霞等:逆相蒸发法制备茶多酚脂质体及质量评价
-60mV),荷电粒子相当稳定;Zeta电位在 30~
60mV(或 -30~ -60mV)时,荷电粒子比较稳
定;当Zeta电位小于30mV(或大于 -30mV)时,荷
电粒子不稳定,容易聚集。本试验制备的茶多酚脂
质体电位为-693mV,表明该脂质体表面荷负电,
且相当稳定。
25 茶多酚脂质体的体外释放度
  茶多酚及茶多酚脂质体体外释放曲线如图5所
示。由图5可知,单纯茶多酚溶液释放较快,8h之
内累积释放度达到9958%;而脂质体中茶多酚释
放较缓慢,在24h时才达到9806%,这说明茶多酚
脂质体对茶多酚有良好的缓释效果,从而延长了茶
多酚作用时间。
图5 TP及TP脂质体体外释放曲线
Fig.5 ThereleasecurveofTPandTPliposomesinvitro
26 茶多酚脂质体稳定性测定结果
茶多酚脂质体包封率随时间的变化结果如图6
所示。由图6可知,茶多酚脂质体包封率随时间延
长有所下降,下降了369%,说明脂质体中的茶多
酚在贮存过程中有一定程度的渗漏。冷冻干燥法
是提高脂质体在贮存期稳定性行之有效的方法,且
适合包裹水溶性药物的脂质体[13]。采用冷冻干燥
法提高脂质体贮存期稳定性尚需进一步研究。
图6 TP脂质体包封率随时间变化曲线
Fig.6 TheencapsulationeficiencychangeofTP
liposomeswithtime
3 结 论
1)获得了逆相蒸发法制备茶多酚脂质体配方
优化数学回归模型:
Y=4987000-199125X1 +257458X2 +
183208X3-274656X

1-207781X

2-
233531X23-241281X

4+416313X1X3
采用此模型在本试验范围内能较准确地预测
茶多酚脂质体的包封率。
2)提出了逆相蒸发法制备茶多酚脂质体的最
佳配方:SPC与CH质量比 3∶1、茶多酚质量浓度为
7mg/mL、有机相与水相体积比为4∶1、磷酸缓冲液
的浓度为15mmol/L。在该配方下,数学回归模型
预测的包封率为5037%。逆相蒸发法制备茶多酚
脂质体操作简便可行。
3)制备的茶多酚脂质体形态呈圆球形或椭球
形,为大单室脂质体,有效粒径为1653nm,多分散
系 数 为 0260,粒 径 分 布 均 匀;Zeta电 位 为
-693mV,脂质体相当稳定。
4)体外缓释性能研究表明,茶多酚溶液释放较
快,8h内累积释放度达到9958%,而茶多酚脂质体
释放较缓慢,在24h时才达到9806%,说明茶多酚
脂质体有良好的缓释效果。
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本发明涉及开发在不降低微生物菌体的品质,而且不存在菌体微粉化问题的情况下,利用廉价的微生
物菌体经加热处理来制造干燥微生物菌体的方法。该制造方法的特征是,将微生物菌体在200~450℃(产
品温度)下加热1~30s即可。
(朱宏阳)
37 第2期 任文霞等:逆相蒸发法制备茶多酚脂质体及质量评价