全 文 ：Ｒesolvin D2 对刀豆素 A诱导的小鼠肝损伤的保护作用及机制的
研究
陈明生，曹利军 (解放军第 113 医院 麻醉科，浙江 宁波 315040)
摘要:目的 探讨 Ｒesolvin D2 对刀豆素 A(ConA)诱导的肝损伤的保护作用及作用机制。方法 实验小鼠随机分为三组，每组 8 只。正常
小鼠对照组，ConA诱导的肝损伤模型组，ConA诱导肝损伤小鼠 + Ｒesolvin D2 治疗组。测定血中的 AST、ALT含量;病理切片观察各组肝组
织病理变化;ELISA法测定各组小鼠血中细胞因子 TNF-α、IFN-γ的水平;ＲT-PCＲ测定各组肝组织细胞因子 TNF-α、IFN-γ 的含量。结果
ConA模型组的转氨酶(AST、ALT)及细胞因子(TNF-α、IFN-γ)水平显著高于其他两组，差异具有统计学意义(P ＜ 0． 05) ;而正常组与治疗
组之间差异无统计学意义(P ＞ 0． 05) ;病理切片显示，进行过 Ｒesolvin D2 预处理的小鼠肝脏组织坏死程度较 ConA模型组明显减轻。结论
Ｒesolvin D2 能够明显减轻肝脏损伤，这种保护作用是通过抑制细胞因子 TNF-α、IFN-γ的释放取得的。
关键词:Ｒesolvin D2;刀豆素 A;肝损伤
中图分类号:Ｒ 575 文献标志码:A doi:10． 3969 / j． issn． 1671-3826． 2013． 05． 02 文章编号:1671-3826(2013)05-0444-04
Protective effect of Ｒesolvin D2 against concanavalin A-induced liver injury in mice Chen Ming-sheng，Cao Li-jun
(Department of Anesthesiology，PLA 113rd Hospital，Ningbo Zhejiang 315040，China)
Abstract:Objective To investigate the hepatic protective effect of Ｒesolvin D2 on liver against concanavalin A-induced injury and
its molecular mechanisms． Methods Mice were randomly divided into three groups (n = 8)． Group A was the vehicle control，in
which mice were given saline and PBS without Con A or Ｒesolvin D2 ． In Group B，mice were injected with Con A via tail vein．
Group C was a treatment group，in which mice were given with Ｒesolvin D2 6 hours before challenge with Con A． The contents of
AST and ALT in blood were determined． Pathological changes in damage to liver were observed． ELISA method was used to deter-
mine the levels of TNF-α and IFN-γ in blood． ＲT-PCＲ was used to determine the contents of TNF-α and IFN-γ in liver tissue．
Ｒesults The contents of AST and ALT，as well as the levels of TNF-α and IFN-γ，were significantly higher in Group B than in
any of the other two groups (P ＜ 0． 05) ，while there was no statistical difference between Group A and Group C (P ＞ 0． 05)． The
pathological damage to liver tissue was significantly milder in Group C than in Group B． Conclusion Ｒesolvin D2 can obviously re-
duce liver damage due to the protection via reducing the release of TNF-α and IFN-γ．
Key words:Ｒesolvin D2;concanavalin A;hepatic injury
刀豆素 A(ConA)诱导的小鼠急性肝炎模型被普遍采
用研究人类的肝脏疾病，因为它能显著引起肝脏转氨酶的
升高及炎症免疫反应［1 － 2］，与其他模型不同之处是，这个模
型主要是以肝坏死、T 细胞的激活及免疫炎症因子的过度
产生为主要特点［3 － 4］。研究发现，激活的 CD4 + T 细胞、
NK-T细胞及肝巨噬细胞在这个模型中起重要的作用，这些
细胞及嗜酸粒细胞浸润到肝实质并分泌大量的炎性细胞
因子［5 － 7］，其中 TNF-α、IFN-γ等在直接导致肝损伤中起了
关键的作用［8 － 10］。
Ｒesolvins［溶解相相互作用产物(resolution-phase interac-
tion products) ］是近来发现的能够促进炎症吸收的一类内
源性脂类调节因子，为 ω-3 多不饱和脂肪酸的代谢产物，
Ｒesolvin D2 是其中的一种。研究表明 Ｒesolvin D2能够加强
作者简介:陈明生(1969-) ，男，四川彭州人，副主任医师，发表论文
10 余篇，目前主要从事临床麻醉工作
巨噬细胞对病原菌的吞噬作用，还能显著减少与炎症转归
不良有关的炎性细胞因子的水平，能大幅降低局部和全身
的细菌负荷，减少中性粒细胞聚集，同时增加腹腔单核细
胞和巨噬细胞的吞噬功能。本研究主要观察 Ｒesolvin D2
对 ConA诱导的肝损伤的影响，并初步阐明其机制。
1 材料与方法
1． 1 仪器与试剂
1． 1． 1 动物 C57BL /6 雄性小鼠，年龄 6 ～ 8 周，体质量
20 ～ 25 g，购自第二军医大学实验动物中心。
1． 1． 2 主要仪器 低速离心机(Beckman Coulter 公司，美
国) ，超净无菌工作台(富康生物技术公司，中国) ，细胞流
式机(BD公司，美国)。
1． 1． 3 主要试剂 刀豆素 A(上海雅吉生物公司，中国) ，
Ｒesolvin D2(Cayman chemical 公司，美国) ，ELISA 试剂盒
(Ｒ＆D公司，美国) ，ＲT-PCＲ试剂(TakaＲa公司，日本)。
1． 2 实验方法
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1． 2． 1 实验分组 实验小鼠采用随机数字表法随机分为
三组，每组 8 只。正常小鼠对照组(N 组) ，ConA 诱导的肝
损伤模型组(C 组) ，ConA 诱导肝损伤小鼠 + Ｒesolvin D2
(400 ng /kg)［11］治疗组(Ｒ组)。
1． 2． 2 各组处理 治疗组经小鼠尾静脉注射 400 ng /kg
Ｒesolvin D2，6 h后经小鼠尾静脉注射 ConA 15 mg /kg;模型
组经小鼠尾静脉给予同剂量的生理盐水，6 h 后经小鼠尾
静脉注射 ConA 15 mg /kg;正常对照组经小鼠尾静脉给予
同剂量的生理盐水，6 h后不给予 ConA 注射。各组在注射
ConA 12 h后，处死小鼠，取标本。
1． 2． 3 肝功能 ALT、AST检测 注射 ConA后 12 h，异氟烷
麻醉小鼠，心脏采血，离心收集血浆，送本院检验科检测
ALT、AST。
1． 2． 4 肝脏病理 注射 ConA 后 12 h，异氟烷麻醉小鼠，
取小鼠肝组织，用甲醛固定 8 h以上，固定后的组织用梯度
乙醇脱水，石蜡包埋。切片切成 4 μm 厚度，用二甲苯脱掉
石蜡。切片用苏木精和伊红染色，在光镜下观察。
1． 2． 5 血浆细胞因子 注射 ConA 后 12 h，异氟烷麻醉小
鼠，心脏抽血，离心后收集血浆，ELISA 法测定血浆细胞因
子 TNF-α、IFN-γ浓度。
1． 2． 6 细胞因子 ＲT-PCＲ 注射 ConA 后 12 h，异氟烷麻
醉小鼠，取肝脏，称取 200 mg 组织，放到 1． 5 ml EP 管中，
加入 1 ml Trizol剪碎，震荡 30 s，加 0． 2 ml氯仿，剧烈摇动 30
s，置室温 3 min，12 000 × g，4 ℃ 离心，15 min。吸上层
无色水相，移入另一 EP 管中(约 0 ． 5 ml) ，加等体积异
丙醇，－ 20 ℃，30 min，然后 12 000 × g，4 ℃ 离心，10 min。
在管底部可见微量 ＲNA 沉淀，弃上清，加 75%乙醇 1 ml，
振荡，再 7 500 × g，4 ℃ 离心，10 min;弃上清，用滤纸小
心吸取残留液体，室温干燥 5 ～ 10 min;沉淀溶于 20 μl
二乙基焦磷酰胺(DEPC)水，取 1 μl加入 79 μl DEPC水测
与 N组比较，＊＊P ＜ 0． 01，$ $ P ＞ 0． 05;与 Ｒ组比较，##P ＜ 0． 01
图 1 三组小鼠血 AST、ALT值比较
OD260 /OD280，计算浓度与纯度，－ 70 ℃保存。
1． 2． 7 统计学方法 数据用 SPSS 13． 0 软件进行分析，计
量资料以均数 ±标准差(x ± s)表示，两组间比较用 t检验，
P ＜ 0． 05 为差异具有统计学意义。
2 结果
2． 1 三组转氨酶结果比较 经过 Ｒesolvin D2 预处理的小
鼠 ALT、AST 显著下降。N 组、C 组和 Ｒ 组 AST 比较见图
1。
2． 2 病理改变 Ｒesolvin D2 能够显著减轻肝细胞的坏死。
三组肝病理改变见图 2。
正常组小鼠肝细胞排列正常，ConA模型组肝组织呈现大面积坏
死，Ｒesolvin D2 治疗组肝组织呈局灶性坏死。提示 Ｒesolvin D2
能明显减轻肝组织的坏死
图 2 三组小鼠肝病理改变比较(HE × 200)
2． 3 三组细胞因子水平的比较 Ｒesolvin D2 能够降低肝
·544·临床军医杂志 2013 年 5 月 第 41 卷 第 5 期 Clin J Med Offic，Vol. 41，No. 5，May，2013
损伤血中 TNF-α、IFN-γ 的水平。三组小鼠细胞因子水平
比较见图 3。
2． 4 细胞因子 ＲT-PCＲ 比较 与模型组比较，Ｒesolvin D2
能够显著降低肝脏组织中 TNF-α、IFN-γ 的水平(P ＜ 0． 01)。
三组小鼠肝组织中细胞因子水平比较见图 4。
与 N组比较，＊＊P ＜0． 01，$ $ P ＞0． 05;与 Ｒ组比较，##P ＜0． 01
图 3 三组小鼠血 TNF-α、IFN-γ 值比较
与 N组比较，＊＊P ＜0． 01，$ $ P ＞0． 05;与 Ｒ组比较，##P ＜0． 01
图 4 三组小鼠肝组织中 TNF-α、IFN-γ的 mＲNA表达
3 讨论
在本研究中，我们证实了经 Ｒesolvin D2 预处理的小鼠
对 ConA介导的肝损伤有保护作用，转氨酶 ALT、AST 及肝
脏的坏死显著低于未处理的模型组。从实验结果还可以看
到，正常组与经 Ｒesolvin D2 预处理的治疗组小鼠在各个指
标方面没有明显的改变。许多研究已经证明，TNF-α，IFN-γ
在 ConA诱导的肝损伤模型中起了关键的作用［5 － 7，12］，在 T
细胞介导的渐进性坏死的肝脏疾病的病人身上也有类似的
发现［13 －15］。本实验证实，Ｒesolvin D2 能够显著降低 TNF-α、
IFN-γ的 mＲNA的表达水平，发挥抗炎作用。
Ｒesolvins(溶解相相互作用产物)是促进炎症吸收调节
因子中的一类。它们是从必需 ω-3 多不饱和脂肪酸(PUFA)
中产生的。现在发现有两种不同的分子系列，即二十碳五
烯酸(EPA)衍生的 Ｒesolvin E 系列和二十二碳六烯酸
(DHA)衍生的 Ｒesolvin D 系列。它们在分子结构、生物化
学和药理作用上都有不同的表现［16 － 17］，通过激活特异性
的受体(CMKLＲ1，BLT1，ALX /FPＲ2 和 GPＲ32) ，Ｒesolvins
对白细胞功能具有调节作用，包括:防止失控的中性粒细
胞群游走作用;减少细胞因子、炎症趋化因子和活性氧的
产生，并且能促进凋亡的中性粒细胞从炎症组织的清除。
因此 Ｒesolvins为机体组织提供了一个细胞保护的机制，使
之免受失控的炎症反应所产生的潜在的不利影响［18］。本
实验结果在细胞水平上证实，Ｒesolvin D2 对于 ConA 诱导
的肝损伤具有很好的保护作用，并首次证明其保护作用的
机制是通过抑制细胞因子 TNF-α、IFN-γ 的分泌来发挥抗
炎作用的，这为下一步的研究奠定了基础，也为临床使用
Ｒesolvin D2 治疗肝脏疾病提供了理论依据。
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·644· 临床军医杂志 2013 年 5 月 第 41 卷 第 5 期 Clin J Med Offic，Vol. 41，No. 5，May，2013
优于对照组(P ＜ 0． 05)。由此可见，肺心病加重期患者在
采用依那普利为主综合治疗的同时，给以丹参酮联合治疗，
可有效提高疗效，改善患者心功能以及血流情况，同时无不
良症状的发生。
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