全 文 ：众珏g．20湃
· lO-
生物加工过程
Chinese如urn蠢of8ioproeessEn西neering
第5卷第3襄
2007年8月
基因敲除技术及其在微生物代谢工程方面的应用
谢承佳，何冰芳，李霜
(鬻京王监大学翻褥与生命科学学院，赛京2l∞游)
摘要：应用基因工程技术对微生物细胞内的代谢遇量进行重新设计，是获得高产高效的工业菌株的蜜薅手段之
一。基因敲除是20世纪80年代发展起来的一项羲要的分子生物学技术，利用基因敲除技术可阻断细胞的代谢旁
路，或通过；l入突变位点改变爨瓣产耱的产量或餍羹而达到蹋节代谢浚，优化伐爨途径戆骛戆。麓单余绍了基霉
敲除技术的撩稚过程，重点讨论基因敲除技术的敲除策略及在擞生物代谢工程方面魏应用，并展望了糯关技术在
诸多领域的发展趋势。
关键词：基因敲除；代谢工程；同源重组
中匿分类号：Q784 文献橡识码：A 文章编号：1672—3678(2007}03—00lO—05
Geneknockoutandi sapplicatioI塔inmicrobemetabolicen西I心ering
XlEClleng-jia，HEBing—f矗ng，王』Shuang
(c。llegeof酝feseienceandp聿18瑚ace砸cal&器nce她，援a啄illgu嫩ve璐i每《Teeh确。帮，Nanjin92l∞∞，Ch泌a)
Abst髓ct：ApplicationofgeneticengineeringtechnoIo韶intheredesigningoft11emetabolicnuxisoneof
themostimpo蛾antp王a硅．oHntechnologyfors拄a派improvement．Ahomologous黼eomKnationbased，h遮h一
匆e夔eie珏t黼olee娃lar巍痰ogy跑ehn薤ogy把fmed‘ge艇羹noeko挂t’蠢asbee堇ld斟ekpedsinee|9鞠s。鸭e
technologycanregulatemetabolic壬luxbyinserting，deleting，cloningorsub8titutinggenomicDNAse—
quencesatanydesiredposition，Theprinciple8andoperationpIueedureofgeneknocko咀twerebrienyin—
troduced，anditsapplicationsinmetabolicengineeringweredi8cussed．
薹西ywo砖s：嚣eneknoe蠡ou量；黼e￡abl辽e珏番魏e蘸魏g；囊。璐obgo狂s羚eo璩bi珏奎io魏
微生物种类繁多，数量庞大，是大自然提供的
天然宝藏。随着科技的发展，发酵工业与生物催化
向人们提盘了更熹鲍要求，进一步提高目的产物懿
产量、纯度及开发有价值薪化合物等都是有待解决
的问题，因此微生物应用的难题集中到如何对菌种
进行改造，以获得高产高效的工业菌株。传统的育
种手段存在工作鬟大，效率低，遗传稳定性差等缺
点。随着对微生物代谢橇理认识鹃不断加深，隧着
生物化学、细胞生物学、应用分子生物学、遗传工程
的发展，定向操纵遗传变化成为可能，代谢工程应
运而生。
代澍工程的概念涎生于1991年Hl，具体丽言，
代谢工程就是科用重组DNA及其谴技术，有目的遗
改变生物中已有的代谢和表达调控网络，以更好地
理解细胞的代谢途径，并用于化学转化、能量转移
及大分子装配过程口』。对于工业微生物育种来说，
从野生爨发菌株习高效生产菌株，需要经过代翁分
析一设计策略一遗传修饰一代谢分析这一流程，不
收藕日期：2006-ll-28
基金饔妥：禽家巍然蟹学基金资鼢磺醛(2鼯3国10)
{筝者篱介：谢承镳(1982一)，女，江苏赢京人，硕士辑究擞，研究方向：生物偬嚣。
联系人：何冰劳，教授，博士生导师，E—mail：bin出ngbe@njut．edu．cn
万方数据
2007年8月 谢承佳等：基因敲除技术及其在微生物代谢工程方面的应用 ·11·
断的循环调整，对宿主进行遗传修饰为其中的重要
一环，包括DNAshufning，genomeshufning及基因敲
除技术，这些DNA重组手段可以快速改变分散在基
因组不同位置上的一个或数个基因，从而改变相应
的细胞表型，快速优化代谢途径，极大地促进代谢
工程的进一步发展和应用．
基因敲除是20世纪80年代发展起来的一项重
要的分子生物学技术，利用微生物体内的同源重组
系统，在一定选择压力下使体外改造的某功能基因
与受体细胞染色体上的功能基因之间发生同源重
组，从而改变细胞的遗传特性。利用基因敲除技术
可阻断细胞的代谢旁路，或通过引入突变位点改变
目的产物的产量或质量，从而达到微生物育种的
目的。
1基因敲除的操作步骤
基因敲除的一般流程见图1，基本程序是：用
PcR技术扩增目的基因序列，在体外插入卡拉霉
素、四环素等受体菌原先不具有的抗性标记，使目
的基因失活，再将失活的目的基因构建至一环状载
体上，用电转化、显微注射等方法将构建好的载体
转化入受体细胞内，以抗性标记初步筛选阳性菌或
进行目的基因功能的失活检测，再以PCR，south咖
杂交等做进一步验证。现在，为了更好地区别单交
换与双交换造成的重组，通常使用两个抗性标记，
在发生单交换时，阴性和阳性抗性标记都会整合至
基因组，而发生双交换时，第二次同源重组会导致
基因回复至野生型或敲除目的基因，在前一种情况
下，两种标记都不存在；在后一种情况下，基因组上
只有阳性标记，因此这样的敲除子可以通过正负筛
选鉴别出。但如果载体构建时在同源序列内部引
入一些突变，就不会回复至野生型，这样，既能实现
基因的失活，基因组上又不会带有抗性标记，这对
构建“食品级”的安全菌株是有益的。
在了解微生物代谢途径相关基因的基础上，通
过构建合适的敲除载体，利用微生物原有原因与构
建的同源重组系统发生交换，进行代谢旁路的阻
断，防止副产物或有毒产物的形成，促进目的产物
积累，从而达到调节代谢流，优化代谢途径的目的。
基因敲除技术既对敲除载体的要求不高可用于原
核细胞，也可用于真核细胞，用途广泛。
图l基因敲除流程
Fig．1Flowchartofgeneknockout
2敲除策略的选择
基因敲除过程中，敲除载体的设计及构建是非
常重要的。同时，在载体构建的过程中要考虑建立
合理、可靠的筛选方法。同源重组的效率较低，故
对重组子的筛选和检测是基因敲除的关键步骤。
目前根据不同的目的和要求，基因敲除的策略主要
有以下几种。
2．1 非复制型质粒载体敲除法
对野生菌做基因敲除，可以先考虑用非复制型
载体。由于构建好的敲除载体在受体菌中是不复
制的，因此转化之后，在选择压力下，未发生重组的
转化子由于敲除载体不能复制随着菌体生长而被
稀释。丁晓明等旧1利用在地中海拟无枝菌酸菌中
不复制的敲除质粒PDKll0，成功地用仅一淀粉酶基
因取代了地中海拟无枝菌酸菌u32染色体上的3．
氨基-5．羟基苯甲酸合成酶基因。此法的主要缺点
是整合几率低，需要数千碱基的同源序列，且对受
体菌的感受态效率要求较高。
2．2不稳定型质粒载体敲除法
若受体菌感受态较难制备，可考虑采用不稳定
型敲除载体。例如：2一酮基一￡一古龙酸(2-KLG)是维
生素c合成的重要前体，但发现存在高水平的2一酮
万方数据
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基醛糖还原酶(2-KR)活力。由于2-KR能够利用
NADPH或NADH辅酶将V，生产菌代谢中重要的
中间产物2，5．二酮基-D一葡萄糖酸(2，5-DKG)及2．
KLG转化为其他副产物，陈芳等H1将失活的2-KR
基因构建到pBR322衍生质粒上，这种质粒在受体
菌中分配不稳定，在无压力选择或低磷条件下培养
5～10代会出现很多质粒丢失的细胞。因此转化后
可先控制培养条件使敲除载体随细胞复制以增加
转化子的数目，然后再在无压力选择或低磷条件下
让质粒丢失，最后在选择压力下筛选敲除子。目前
已成功敲除2一KR基因。
2．3温度敏感型(Ts型)质粒载体敲除法
1993年，Biswas等"1利用Ts型质粒建立了革
兰氏阳性菌高效的基因敲除系统。Biswas所用质粒
pG+host5在37℃时不复制，而28℃时以滚环模
式进行复制。因此转化后在选择压力下37℃培养
会导致第一次同源重组SCO(single—crossover)，之后
将温度降至28℃，会促使质粒发生滚环复制，这种
复制机制会导致发生第二次重组dco(double．cross—
over)。重组后，目的基因或是被敲除，或是回复成
野生型。由于使用了Ts型质粒，因此转化后可先在
复制温度下培养促进转化子的生长及繁殖。即使
外界无抗性选择压力重组机率也会增加。该技术
可避免使用抗生素抗性标记，可用于构建“食品安
全级”的菌株。由于质粒是以滚环机制复制，重组
效率高。Biswas的研究表明在有抗性选择压力时，
50％以上的菌发生了替换重组；无抗性选择压力时，
替换重组的效率为1％一40％。此外，Ts型质粒宿
主谱广，可在很多革兰氏阳性菌中使用。
2．4线形转化敲除法
1998年，Murphy等Mo报道了利用入噬菌体的
线性Red同源重组系统获得高重组率。Red系统主
要包含3种蛋白质分子，分别称为Exo、Beta和
Gam。Exo蛋白具有DNA外切核酸酶活性，从双链
DNA末端按5’一3’的方向消化单链DNA。Beta蛋
白可结合在由Exo消化产生的3’单链DNA末端，
促进该单链DNA末端与互补链退火和体内重组。
Gam抑制宿主菌的重组蛋白RecBCD的线性双链
DNA外切酶活性，协助Exo和Beta完成同源重组。
Red系统相对于宿主菌来说是一个外来的功能单
位，因此必须对其表达进行调控。Yu等"{将部分入
噬菌体的基因整合至E．coli染色体上，exo，beta和
gam3个基因受C2857阻遏蛋白的调控表达；Dat—
senko等旧1将Red系统构建在一个以arac—ParaB为
启动子的Ts型质粒上，在阿拉伯糖的诱导下可进行
有效表达，而在温度控制下可快速去除此质粒。王
恒棵等∽1利用此类质粒快速敲除了痢疾杆菌中的
asd基因，之后又利用编码FLP重组酶的Ts型辅助
质粒去除了抗性基因，为Red系统在E．coli以外的
微生物中的应用进行了尝试。
利用入噬菌体的Red同源重组在大肠杆菌中
做基因敲除的优点在于其所需的同源序列只需30～
50bp，如此短的核酸序列完全可以人工合成，从而
避免了繁琐的酶切及连接过程。通过PCR产生的
两端带有同源臂的DNA片段即可在Red系统指导
下快速实现基因敲除。
在链霉菌中，廖军等¨叫利用含缺口的变性双链
DNA敲除了葡萄糖异构酶的基因，推测可能是单链
DNA的构型有利于其与链霉菌染色体序列的同源
重组，而碱变性后的双链DNA中的部分氢键的断
裂，造成部分单链区域成为同源重组的较佳底物。
在酿酒酵母中，由于双链DNA缺口修复途径十
分有效，也可直接用由PCR产生的两端带同源序列
的线形DNA转化，Baudin等u川通过同源重组用酵
母筛选标记基因(如HIS3)替换酵母中的目的基因，
可快速产生大量的基因缺失突变体。
采用线形基因不需采用特定的载体，这使构建
过程得以简化，并且可以避免采用环形载体时非同
源片段的干扰。
2．5结合转化敲除法
芮贤良等¨2。131利用宿主一载体平衡致死系统筛
选致贺氏3价疫苗候选株。首先使目的基因体外失
活，将其克隆到“自杀转移载体”pXL275上获得质
粒pXL312，转化大肠杆菌受体菌SMlohpir。以
SMlohpir为供体菌，与受体菌T32进行固相滤膜交
配，由于重组质粒pXL312含有RK2的mob位点和
特殊的R6K复制子，不仅可被供体菌内的RP4系统
诱导转移至受体菌T32，而且在T32菌内不能复制，
是一自杀型质粒。因此，当用载体的抗生素抗性进
行选择时，可筛选到转移质粒和染色体发生同源重
组形成的共整合结合子。因此，如果要进行基因敲
除的目标菌不易制备感受态或感受态效率很低，则
可以通过寻找“中介菌”来完成基因转移的过程。
3基因敲除在代谢工程中的应用
代谢工程的难题就是如何使微生物的代谢主
万方数据
2007年8月 谢承佳等：基因敲除技术及其在微生物代谢工程方面的应用 ·13·
流流经理想载流途径。在发酵生产中，为了达到这
一目的，从营养物质进入细胞到产物产生通常需要
从三个方面加以控制¨4|，即：使来自上游和各个注
入分支的碳架物质能畅通地流向目的产物；阻塞或
去除与目的产物的形成无关或关系不大的代谢支
流，使碳架物质相对集中地流向目的产物；消除或
削弱目的产物进一步代谢的途径。在上述各过程
中，起关键作用的无疑是酶，而基因敲除技术的出
现使快速失活成为现实，从而达到调节代谢流，优
化代谢途径的目的。以下例子论述基因敲除技术
在代谢工程方面的应用。
3．1降低能耗
长链二元酸是合成工程塑料、香料、液晶等物
质的一种重要的化工原料，目前主要利用热带假丝
酵母转化烷烃进行生产。在热带假丝酵母代谢烷
烃的过程中，烷烃的口一氧化过程，既是细胞生命活
动所必需，但也存在原料的无益消耗。高弘等¨纠将
在脂肪酸向口．氧化转运过程中起到关键作用的肉
毒碱乙酰基转移酶(CAT)单拷贝敲除，减少卢一氧化
过程中脂肪酸的无谓消耗，经过初步检测，重组菌
的CAT酶活降低了43％，十三碳二元酸的产量与摩
尔转化率分别提高了13．0％和11．8％。
3．2 阻断或降低副产物的合成
乙酸是大肠杆菌代谢的末端产物，乙酸累积抑
制菌体生长和外源蛋白的表达，目前一般采用改变
发酵温度和限制补料速率等方法控制发酵液中乙
酸的浓度，近年来用代谢工程方法降低乙酸的累积
获得成功。主要思路包括：阻断乙酸产生的主要途
径，限制糖酵解途径中的碳代谢流，转换过量的丙
酮酸为其他低毒性的副产物以及分流碳代谢流等
几个方面¨6|。在大肠杆菌磷酸转移酶系统中，葡萄
糖主要由ptsG基因编码的酶转运人细胞。降低葡
萄糖的摄取速率，减少了乙酸累积，有利于菌体生
长。韩聪等¨71利用基因敲除技术构建ptsG基因缺
陷株，净化葡萄糖的摄取速率，减少了乙酸累积，有
利于菌体生长。在含有葡萄糖的LB培养基中，
ptsG基因缺陷株最高菌密度分别是原始菌的3．47
倍和4．25倍，在大肠杆菌高密度发酵研究方面具有
良好的应用前景。
3．3去除重组菌的抗性
碱性蛋白酶(Alkalineprotease)是指在pH碱性
的条件下水解蛋白质肽键的酶类，广泛应用于各种
洗涤剂。唐雪明等¨引构建了带卡那霉素和碱性蛋
白酶基因的质粒，通过逐步提高培养液中卡拉霉素
的水平，促进载体不断整合至染色体上，从而实现
碱性蛋白酶基因在宿主染色体的扩增。但是，带多
拷贝卡拉霉素基因的构建菌可能会给环境造成转
基因污染，故又构建载体敲除了卡拉霉素基因¨9|，
筛选得到了11株不含抗性基因的整合型碱性蛋白
酶工程菌，并使产酶水平保持稳定。
3．4提高产物纯度
乳酸在食品、医药、化工、环保等领域有广泛的
用途。乳酸菌LactobacillushelveticusCNRZ32既有
Kyla—D一乳酸脱氢酶基因(厶施L)，又含￡哥L酸脱氢酶
基因(1dhD)等ⅢJ。用基因替代的方式构建了2株
菌GRL86和RL89，其中GRL86菌株缺失了ldhD
的启动子区域；GRL89菌株中用另一个IdhL基因替
代了ldhD基因，新增加的IdhL在原来ldhD启动子
的调控下表达．敲除后，两株菌都只生产￡哥L酸，且
L．LDH的最高活性分别比原始菌株高出53％
和93％。
3．5 降低或阻断骨骼代谢
奎尼酸是一种具有光学活性的环状多羟基化
合物，可广泛用于合成抗肿瘤制剂、免疫抑制剂，助
溶剂及光学材料等。在大肠杆菌中，奎尼酸的前体
化合物是莽草酸途径的中间代谢产物，是由糖酵解
和磷酸戊糖途径分别产生的磷酸烯醇式丙酮酸和
赤鲜糖4．磷酸缩合而来，这是决定芳香化合物合成
速率及产量的关键。Berry等心川将糖酵解途径中的
限速酶——丙酮酸激酶的2个同工酶基因都敲除
后，DAHP的产量增加了3倍。后来又采取扩增
DAHP合成酶基因roG和编码转酮酶A的tktA基
因，同时失活两个丙酮酸激酶同工酶，DAHP产量
明显提高¨“。
在微生物芳香族氨基酸的生物合成中，至少有
17种酶参与，且具有复杂的调控机制。在大肠杆菌
中，发现了苯丙氨酸合成的中心代谢途径及其他生理
特性的调控因子——贮碳因子(CarbonStorageRegu·
latorA，CsrA)，敲除CsrA可增强糖质新生，降低糖
酵解，因此提高了芳香族氨基酸的前体物质——磷酸
烯醇式丙酮酸的量，整体水平上实现对芳香族氨基酸
的中心代谢途径的调控，敲除CsrA并优化条件后苯
丙氨酸的产量是出发菌株的两倍口3|。
4展望
作为一项新兴的微生物育种技术，基因敲除克
万方数据
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服了传统诱变方法的盲銎性颡馁然性，敲除后被改
变的基因会随染色体DNA进行复制，改良的菌种可
稳定地用于后续的研究和生产。
隧蔫大量模式生物及耋要功麓微生物全基因
组的解明以及功麓基因的定位，人们从基因水平上
更加清楚的认识微生物代谢的规律，同时敲除载体
及穗关技术的完善可送一步推动代谢工程的广泛
应用，通过基因敲除手段改变微生物细胞的代谢流
向，阻断有害代谢产物积累，可望降低成本，大幅度
提高生产水平及产晶纯度。
除了微生物代谢工程，基因敲除技术还可用于
基因结构与功能研究mj、细胞生活周期调控机裁
研究、无毒活体疫苗的制备研究以及遗传病的基因
治疗等诸多方面。随着人类基因组计划的完成以
及疾病分子机理的鳃明，基因敲除技术还可有效用
于遗传瘸及癌症的基因治疗。该技术可望在发酵，
医药，轻工食品等多项领域作出重大贡献。
参考文献：
[1]BaileyJ E．Towardscienceofmetabolicengineering[J]．sci—
eJlee，1991，252(5013)：1668-1675．
[2]李鬟，帮嚣安．皴垒物霞谢王翟：绘镪缨魏工f”静蓝圈[羁．纯
工学报，2004，55(10)：1573·1580．
[3]丁烧明，张霓．田永强，等．利用澜源重组建立地中海拟无枝蘸
酸蘩U32染色漆懿蘩嚣受挟，巾凝系统【l】．蹩物互程学摄，
2002，18(4)：431-437．
[4]陈芳，陈策实，李越，等．欧文氏黼2一酮基醛糖还原酶基因敲除
的研究￡J】。微生携学报，2000，40(5)：475-480．
[5]Biswasl，Gru sA，EhrlichSD，eta1．High-efficiencygeneinacti—
rationa dreplacementsystemforgram—positivebacteria[J]．J
Bacteriol，1993，175(11)：3628-3635。
[6】MurphyKC，CampetloneKG，Poteete矗R．PCR—mediatedgen
replacementinEscherichiacoli[J]．Gene，2000，246(1／2)：
321-330．
[7]YuD，EllisHM，LeeEC，etal。Anefficientr combinationsystem
forchromosomeengineeringinEscherichiacoli[j]．ProcNatl
AcadSciUSA，2000，97(11)：5678-5983．
[8]DatsenkoKA，WannerBL．One．stePinactivationofchromosomal
genesinEscherichiacoliK一12usingPCRproducts[J】。ProcNatl
AeadSciUSA，2000，97(12)：6640-6645。
[9]王恒襟，冯尔玲，史兆兴，等．用Red系统快速敲除痢疾杆菌
asd基因[J]．军事医学科学院院刊，2002，26(3)：172—175．
[10】廖军，徐狰，扬永爨，等．变。陡双链法实域葡萄糖异构憋基因敲
除的研究[j]，遗传学报，2000，27(5)：449-454。
[1 ]BaudinA，Offer—KalogeropoulosO，DenouelA，eta1．Asimple
andefficientme hodf rirectgenedeletioninS．cerevisiaefj1．
NucleicAcidsRes，1993，21(|4)：3329-3330。
[12]芮贤良，徐永强，王红，等．稳定，无抗药的痢疾福氏2a宋内双
价菌苗候选株的构建[J]．生物工稷学报，1996，12(2)：
134一139。
[13]芮贤良，徐永强，吴翘东，等．剩用宿主一载体平衡致死系统构
建志贺氏3价疫苗候选株[J]．中国科学，1997，27(1)：83-88．
[14]张星元．微生物生物工程的3个基本观[J】．无锡轻工大学学
攘，2001，20(4)：436-439。
[15]高弘，张剑，华玉涛，等．肉毒碱乙酰转移酶基因敲除对长链二
元酸生产代谢过程的影响[J]．微生物学报，2005，45(1)：
102一105。
[16]唐功和，陈海寰．代谢工程研究进展[j]．有机化学，2000，20
(5)：634-640．
[17】韩聪，张惟攒，游松，等．大脑杆菌ptsG繁因敲除及冀缺陷株生
长特性研究[j】．生耪王穗学摄，2004，20(1>：16-20．
[18]唐雪明，邵蔚蓝，王正祥，等．第三届全围发酵工程学术讨论会
论文集[c]．北京：中国辍工出版社，2002．
￡19】褒雪瞩，露§蕤滚，王歪祥，嚣．整合型碱瞧器鑫酶基匿王程蘧中
抗性基因的敲除[J]．徽擞物学通报，2003，30(3)：l巧．
[20]KylaNikkilaK，HujanenM，LeisolaM，eta1．Metabolicengi—
neeringofLactobaciIlushelvetwuscnrz32forproductionofpureL一
(+)一lacticacid[jj．ApplEnvironMicrobiol，2000，66(9)：
3835-3841．
[21]BerryA．Improvingproductionofaromaticcompoundsi Esche-
richiaco／ibymetabolicengineering[1】。TrendsBiotechnol，1996，
14：250-256．
[22]BerryA，DodgeTC，PepsinM，eta1．Applicationofmetabolic
engineeringtoimproveboththeproductionanduseofbiotechindi一
驴[j]．jIndMierobiolBioteehnol，2002，28(3)：127—133．
[23]TatarkoM，RomeoT．Disruptionofaglobalregulatorygenetocn—
hancee ntralc rbonfluxintophenylalaninebiosynthesisinEsche-
richiacoli[J]。CurMicrobiology，2001，43(1)：26-32。
[24]BanasJA，ViekermanMM．Glucan—bindingproteinsoftheoral
Streptococci[J]．CritRevOralBiolMed，2003，14(2)：89-99．
万方数据