全 文 ：第 １３卷第 ５期
２０１５年 ９月
生　 物　 加　 工　 过　 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ􀆰 １３ Ｎｏ􀆰 ５
Ｓｅｐ􀆰 ２０１５
ｄｏｉ：１０􀆰 ３９６９ ／ ｊ􀆰 ｉｓｓｎ􀆰 １６７２－３６７８􀆰 ２０１５􀆰 ０５􀆰 ００４
收稿日期：２０１４－０３－１０
基金项目：国家重点基础研究发展计划（９７３计划）（２０１１ＣＢＡ００８０７）
作者简介：张　 凯（１９８７—），女，江苏徐州人，硕士研究生，研究方向：基因工程和发酵工程；蔡 　 恒（联系人），副教授，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｃｈｅｎｇ＠ ｎｊｔｅｃｈ．
ｅｄｕ．ｃｎ
通过 ＤＮＡ改组技术定向进化赖氨酸脱羧酶
基因 ｃａｄＡ和 ｌｄｃ
张　 凯，蔡　 恒，汪　 晨
（南京工业大学 生物与制药工程学院，江苏 南京 ２１１８００）
摘　 要：利用 ＤＮＡ改组技术对赖氨酸脱羧酶野生型基因 ｌｄｃ进行随机突变，在大肠杆菌 Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９中构
建赖氨酸脱羧酶突变体库。 从 Ｅ． ｃｏｌｉ ＪＭ１０９和蜂房哈夫尼菌 Ｈａｆｎｉａ ａｌｖｅｉ ＡＳ１􀆰 １００９中分别克隆出赖氨酸脱羧酶基
因 ｃａｄＡ和 ｌｄｃ。 查询 ＮＣＢＩ数据库得知，二者的同源性为 ７５％。 分别构建重组质粒 ｐＴｒｃ９９ａ ｃａｄＡ和 ｐＴｒｃ９９ａ ｌｄｃ，
以此 ２种质粒为模板，经 ＰＣＲ扩增，获得目的基因片段，分析目的基因片段中存在的限制性酶切位点，用多种限制
性内切酶碎片化 ２种基因，切割成不同大小的片段。 这些小片段进行不同组合，突变体经过 ＬＢＸＬ平板初筛和高效
液相色谱（ＨＰＬＣ）复筛，获得 １ 株酶活性提高的赖氨酸脱羧酶突变体，编号为 ＬＤＣ２ １６，其比酶活为 ４ ８６９􀆰 ８６
Ｕ ／ ｍｇ（以 １ ｍｇ总蛋白计），与 ２种野生型赖氨酸脱羧酶基因表达的酶 ＣａｄＡ（１ ６５２􀆰 ６３ Ｕ ／ ｍｇ）、Ｌｄｃ（２ ３６５􀆰 ９３ Ｕ ／ ｍｇ）
相比，在最适温度 ３７ ℃、ｐＨ ６􀆰 ０时，突变体的比酶活分别是上述野生型酶的 ２􀆰 ９５和 ２􀆰 ０６倍。 摇瓶发酵 ５ ｈ后，目
标产物 １，５ 戊二胺产量从 ４６􀆰 ９提高至 ６３􀆰 ９ ｇ ／ Ｌ，提高了 ３６％。
关键词：ＤＮＡ改组；定向进化；赖氨酸脱羧酶；蜂房哈夫尼菌；大肠杆菌
中图分类号：Ｑ９３　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２－３６７８（２０１５）０５－００２０－０６
Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｂｙ ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ ｏｆ ｌｙｓｉｎｅ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ ｇｅｎｅ ｃａｄＡ ａｎｄ ｌｄｃ
ＺＨＡＮＧ Ｋａｉ，ＣＡＩ Ｈｅｎｇ，ＷＡＮＧ Ｃｈｅｎ
（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｎｅｅｒｉｎｇ，Ｎａｎｊｉｎｇ Ｔｅｃｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ ２１１８００，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｗｅ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｗｏ ｌｙｓｉｎｅ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ（ＬＤＣ） ｃａｄＡ ａｎｄ ｌｄｃ ｂｙ ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ
ｔｈｒｏｕｇｈ ｒａｎｄｏｍ ｍｕｔａｔｉｏｎ． Ｏｎｅ ｌｙｓｉｎｅ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ ｇｅｎｅ ｃａｄＡ ｆｒｏｍ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ ｔｈｅ ｏｔｈｅｒ ｌｄｃ
ｆｒｏｍ Ｈａｆｎｉａ ａｌｖｅｉ ＡＳ１．１００９ ｗｅｒｅ ｌｉｎｋｅｄ ｉｎｔｏ ｖｅｃｔｏｒ ｐＴｒｃ９９ａ． Ｒｅｆｅｒｒｉｎｇ ｔｏ ＮＣＢＩ ｄａｔａｂａｓｅ，ｔｈｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ
ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｈｏｗｅｄ ７５％ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｂｅｔｗｅｅｎ ｃａｄＡ ｇｅｎｅ ａｎｄ ｌｄｃ ｇｅｎｅ． Ｔｈｅｎ，ｗｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｔｈｒｅｅ
ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＴｒｃ９９ａ⁃ｃａｄＡ ａｎｄ ｐＴｒｃ９９ａ⁃ｌｄｃ． Ａｓ ｔｅｍｐｌａｔｅｓ， ｔｗｏ ｐｌａｓｍｉｄｓ ｗｅｒｅ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｂｙ
ｎｏｒｍａｌ ＰＣＲ ｔｏ ｏｂｔａｉｎ ｔｈｅ ｇｅｎｅｓ ｃａｄＡ ａｎｄ ｌｄｃ． Ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ ｓｉｔｅｓ ｐｒｅｓｅｎｔ ｉｎ ｔｈｅ ｔｗｏ
ｇｅｎｅｓ，ｗｅ ｕｓｅｄ ｖａｒｉｅｔｙ ｏｆ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ ｓｉｔｅｓ ｔｏ ｇｅｔ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ． Ｔｈｅｎ， ｔｈｅ ｒａｎｄｏｍ
ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｗｅｒｅ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ａｎｄ ｒｅａｓｓｅｍｂｌｅｄ ｂｙ ＰＣＲ ｗｉｔｈｏｕｔ ｐｒｉｍｅｒｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｗｅｒｅ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｂｙ
ｒｏｕｔｉｎｅ ＰＣＲ． Ｔｈｅｓｅ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｗｅｒｅ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｒｅａｓｓｅｍｂｌｅｄ ｔｏ ｇｅｎｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｓｉｚｅ ａｓ ＬＤＣ． Ｔｈｅ
ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＬＤＣ２⁃１６ ｃａｎ ｒｅａｃｈ ｔｏ ４ ８６９􀆰 ８６ Ｕ ／ ｍｇ ｔｏｔａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ，ｗｈｉｃｈ ｉｓ ２􀆰 ９５ ａｎｄ ２􀆰 ０６ ｔｉｍｅｓ ａｓ ｔｈａｔ ｏｆ
ｔｈｅ ｗｉｄｅ ｔｙｐｅ （ ＣａｄＡ １ ６５２􀆰 ６３ Ｕ ／ ｍｇ、 Ｌｄｃ ２ ３６５􀆰 ９３ Ｕ ／ ｍｇ ） ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ
ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ３７ ℃，ｐＨ ６􀆰 ０． Ａｆｔｅｒ ５ ｈ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ， ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔ ｐｒｏｄｕｃｔ １，５⁃ｄｉａｍｉｎｏｐｅｎｔａｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
ｒｅｓｅａｒｃｈｅｄ ６３􀆰 ９ ｇ ／ Ｌ ｆｒｏｍ ４６􀆰 ９ ｇ ／ Ｌ ｗｉｔｈ ａｎ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｏｆ ３６％．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ； ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ； ｌｙｓｉｎｅ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ； Ｈａｆｎｉａ ａｌｖｅｉ； Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
　 　 赖氨酸脱羧酶（Ｌ ｌｙｓｉｎｅ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ，Ｌｄｃ，ＥＣ
４􀆰 １􀆰 １􀆰 １８）是生物体内可逆地催化 Ｌ 赖氨酸脱羧
生成 １，５ 戊二胺和 ＣＯ２的高度专一性酶［１］。 １，５
戊二胺在农业、医学、化学工业等领域有着广泛的
应用。 作为一种重要的化工原料，１，５ 戊二胺是由
可再生原料衍生得到的生物聚酰胺，可以替代传统
化工方法生产的生物胺———己二胺［２］，能应用于各
种聚酰胺产品、聚氨酯、螯合剂和添加剂等，与二元
酸进行聚合反应可合成优质高分子材料———新型
尼龙［３］。 它是一种环保型的、可持续发展型的、耐
高温的生物塑料，有着广泛的应用前景［４］。
Ｌｄｃ 存 在 于 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ、 尸 胺 杆 菌 （ Ｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｃａｄａｖｅｒｉｓ）和蜂房哈夫尼菌（Ｈａｆｎｉａ ａｌｖｅｉ）等微生物
中，同时也存在于高等植物中，如黄瓜等。 该酶是
诱导性胞内酶，需要磷酸吡哆醛作为辅酶促进脱羧
反应［５］。
酶的体外定向进化，不需要提前对酶的空间结
构以及催化机制进行详细地了解和掌握，只需要通
过人为改变基因突变过程中的反应条件，模拟自然
进化过程（随机突变、重组和自然选择），在体外进
行基因突变、基因重组等操作，进行基因突变体库
的构建，根据不同基因的特性来建立高通量筛选方
法，最终获得理想的突变酶［６］。 ＤＮＡ 改组 （ ＤＮＡ
ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ），又称有性 ＰＣＲ ［７－８］，该方法是将亲本基
因进行尽可能多的组合，最终获得理想突变体。 不
管是从理论角度，还是从实践角度，该方法都比重
复寡核苷酸引导进行的诱变及易错 ＰＣＲ 的方法等
更有利于获得有意义突变，其可使同源性较高的同
功能酶进行改组，大大提高基因突变率。
本课题组前期在 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ＪＭ１０９ 中（以 ｐＴｒｃ９９ａ
为载体）分别单独克隆表达 ｃａｄＡ、 ｌｄｃＣ （来自于
Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ）和 ｌｄｃ（来自于 Ｈ􀆰 ａｌｖｅｉ）３ 种典型赖氨酸脱羧
酶基因，ＣａｄＡ 和 ＬｄｃＣ 的比酶活分别为 １ ６５２ 和
１ ３２９ Ｕ ／ ｍｇ；Ｌｄｃ 比酶活为 ２ ３６６ Ｕ ／ ｍｇ（数据未发
表）。 因此，本研究中，笔者选择 ２ 个酶活较高的赖
氨酸脱羧酶基因 ｃａｄＡ和 ｌｄｃ 作为研究对象，分别构
建重组质粒 ｐＴｒｃ９９ａ ｃａｄＡ 和 ｐＴｒｃ９９ａ ｌｄｃ，以此 ２
种质粒为模板，经 ＰＣＲ扩增，获得基因片段，继而利
用 ＤＮＡ改组等体外分子定向进化技术，对赖氨酸脱
羧酶基因 ｌｄｃ 进行分子改良，以期获得酶活力提高
或酶学性质改善的优良突变菌。
１　 材料和方法
１􀆰 １　 材料
１􀆰 １􀆰 １　 菌株和质粒
Ｈ􀆰 ａｌｖｅｉ ＡＳ１􀆰 １００９由天津北洋百川生物技术有
限公司惠赠。 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ＪＭ１０９、质粒 ｐＴｒｃ９９ａ 保存于笔
者所在实验室，含赖氨酸脱羧酶基因的重组质粒
ｐＴｒｃ９９ａ ｃａｄＡ 和 ｐＴｒｃ９９ａ ｌｄｃ 由笔者所在课题组
成员构建。
１􀆰 １􀆰 ２　 酶和试剂
限制性内切酶、Ｔ４ ＤＮＡ连接酶、ｒＴａｑ ＤＮＡ聚合
酶等，均购自 ＴａＫａＲａ 公司。 其他化学试剂为市售
国产或进口分析纯。
１􀆰 １􀆰 ３　 培养基
液体 ＬＢ培养基（ｇ ／ Ｌ）：蛋白胨 １０，酵母浸粉 ５，
ＮａＣｌ １０。 １２１ ℃湿热灭菌 ３０ ｍｉｎ。
固体鉴别培养基 ＬＢＸＬ：在液体 ＬＢ 培养基的基
础上添加 ０􀆰 ５％（质量分数）Ｌ 赖氨酸和 ０􀆰 ０１％（质
量分数）溴甲酚紫，并添加终浓度为 ０􀆰 ３ ｍｍｏｌ ／ Ｌ 的
ＩＰＴＧ对重组质粒进行诱导表达，ｐＨ ６􀆰 ０。
１􀆰 １􀆰 ４　 赖氨酸脱羧酶基因引物设计
根据 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ＪＭ１０９ 中赖氨酸脱羧酶基因 ｃａｄＡ
序列和 Ｈ􀆰 ａｌｖｅｉ ＡＳ１􀆰 １００９ 中赖氨酸脱羧酶基因 ｌｄｃ
序列，使用 Ｐｒｉｍｅｒ Ｐｒｅｍｉｅｒ５􀆰 ０ 软件辅助设计 ２ 个基
因序列的上下游引物。 分别在引物的 ５′端增加 ２～３
个保护碱基（划线字母），引入限制内切酶酶切位点
（加粗斜体字母）ＢａｍＨⅠ和 Ｈｉｎｄ Ⅲ，以便后期的克
隆与表达。 引物由南京金斯瑞生物科技有限公司
合成。
ｃａｄＡ １：５′ ＣＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＡＡＣＧＴＴＡＴＴＧＣ⁃
ＡＡＴＡＴＴＧ ３′；ｃａｄＡ ２：５′ ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＴＴＡＴＴＴＴ⁃
ＴＴＧＣＴＴＴＣＴＴＣＴＴＴＣ ３′；ｌｄｃ １：５′ ＣＧＧＧＡＴＣＣＡ⁃
ＴＧＡＡＴＡＴＣＡＴＴＧＣＣＡＴＣＡＴＧＡＡＣＧ ３′；ｌｄｃ ２：５′
ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＴＴＡＴＧＡＣＴＴＣＴＴＣＧＣＣＧＣＴＧＡＴ ３′。
１􀆰 ２　 方法
１􀆰 ２􀆰 １　 ＰＣＲ扩增 ｃａｄＡ和 ｌｄｃ基因
分别以 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ＪＭ１０９ 和 Ｈ􀆰 ａｌｖｅｉ ＡＳ１􀆰 １００９ 的基
１２　 第 ５期 张　 凯等：通过 ＤＮＡ改组技术定向进化赖氨酸脱羧酶基因 ｃａｄＡ和 ｌｄｃ
因组 ＤＮＡ为模板，进行 ＰＣＲ反应。 反应体系：模板
ＤＮＡ３ μＬ、上游引物 ２ μＬ、下游引物 ２ μＬ、１０×Ｂｕｆｆｅｒ
５ μＬ、ＭｇＣｌ２（２􀆰 ５ ｍｍｏｌ ／ Ｌ） ４ μＬ、ｄＮＴＰｓ ４ μＬ、ｒＴａｑ
ＤＮＡ聚合酶 ０􀆰 ５ μＬ、加重蒸水至 ５０ μＬ。 反应条
件：９５ ℃５ ｍｉｎ；９５ ℃１ ｍｉｎ，５８ ℃３０ ｓ，７２ ℃ ３ ｍｉｎ，
循环 ３０次；７２ ℃１０ ｍｉｎ。
ＰＣＲ结果用 １􀆰 ０％（质量分数）琼脂糖凝胶电泳
进行检测，之后用 ＤＮＡ 回收试剂盒（北京庄盟国际
生物基因科技公司）回收纯化 ＰＣＲ 产物，并经过
ＢａｍＨⅠ和 Ｈｉｎｄ Ⅲ双酶切（３７ ℃、２􀆰 ５ ｈ），分别连接
到 ｐＴｒｃ９９ａ 载体上，重组质粒 ｐＴｒｃ９９ａ ｃａｄＡ 和
ｐＴｒｃ９９ａ ｌｄｃ 利用 ＣａＣｌ２转化法转化至大肠杆菌
ＪＭ１０９，构建随机突变体库。
１􀆰 ２􀆰 ２　 ＤＮＡ改组
１）限制性内切酶法降解 ＤＮＡ 及回收小片段　
以构建获得的重组质粒 ｐＴｒｃ９９ａ ｃａｄＡ和 ｐＴｒｃ９９ａ
ｌｄｃ为模板，分别用限制性内切酶 ＢａｍＨⅠ和 Ｈｉｎｄ
Ⅲ对 ２个重组质粒进行双酶切，回收 ｃａｄＡ 和 ｌｄｃ 基
因片段。 分别选择限制性内切酶①ＸｈｏⅠ、②ＥｃｏＲ
Ⅰ、③ＰｓｔⅠ、④ＣｌａⅠ对 ｃａｄＡ 基因片段进行酶切，
⑤ＳａｃⅠ、⑥ＣｌａⅠ、⑦ＰｖｕⅠ、⑧ＥｃｏＲⅠ对 ｌｄｃ 基因片
段进行酶切［９］，１􀆰 ５％琼脂糖凝胶电泳。
２）无引物 ＰＣＲ　 上步获得的 ８ 种酶切片段分
别两两组合作为模板进行一次无引物 ＰＣＲ，即①
⑤、①⑥、①⑦、①⑧、②⑤、②⑥、②⑦、②⑧、③⑤、
③⑥、③⑦、③⑧、④⑤、④⑥、④⑦和④⑧。 反应体
系：模板 ＤＮＡ ３ μＬ、 １０ × Ｂｕｆｆｅｒ ５ μＬ、 ＭｇＣｌ２ （ ２􀆰 ５
ｍｍｏｌ ／ Ｌ） ４ μＬ、ｄＮＴＰｓ ４ μＬ、 ｒＴａｑ ＤＮＡ 聚合酶 ０􀆰 ５
μＬ、加重蒸水至 ５０ μＬ。 反应条件：９５ ℃２ ｍｉｎ； ９５
℃３０ ｓ，５８ ℃１５ ｓ，７２ ℃ ２􀆰 ５ ｍｉｎ，循环 ４０ 次；７２ ℃
１０ ｍｉｎ。 １􀆰 ５％琼脂糖凝胶电泳。 再以上步无引物
ＰＣＲ产物混合为 １ 管作为模板，进行 ２ 次无引物
ＰＣＲ（反应体系同上步），１􀆰 ５％琼脂糖凝胶电泳。
３）有引物 ＰＣＲ　 以上一步二次无引物 ＰＣＲ产物
作为模板，进行有引物 ＰＣＲ，获得大小正确的目的条
带，１􀆰 ５％琼脂糖凝胶电泳。 用 ＤＮＡ 回收试剂盒（北
京庄盟国际生物基因科技公司）回收纯化 ＰＣＲ产物，
并经过 ＢａｍＨⅠ和 Ｈｉｎｄ Ⅲ双酶切，分别连接到 ｐＴｒｃ９９ａ
载体上，重组质粒 ｐＴｒｃ９９ａ ＬＤＣ利用 ＣａＣｌ２转化法转
化至大肠杆菌 ＪＭ１０９，构建随机突变体库。
１􀆰 ２􀆰 ３　 高通量筛选
大量抽提突变文库中重组质粒，ＣａＣｌ２ 转化法
转化至大肠杆菌 ＪＭ１０９，涂布于 ＬＢ抗性平板。 溴甲
酚紫是一种酸碱指示剂，其变色范围是 ｐＨ ５􀆰 ２（黄
色） ～６􀆰 ８（紫色）。 １，５ 戊二胺是一种具有生物活
性的含氮碱，将 ＬＢ 抗性平板上长出的菌落点于
ＬＢＸＬ平板上，培养 １２ ｈ，菌体产生的目的产物 １，５
戊二胺会使得菌体周围的 ＬＢＸＬ培养基（黄绿色）变
成紫色透明圈，观察紫色透明圈大小，挑取透明圈
比野生型大的 ３２ 个突变株进行比酶活测定。 测定
上述两轮突变体的酶活，进行进一步验证。 经第二
轮进化后，获得最佳突变体 ＬＤＣ２ １６。
１􀆰 ２􀆰 ４　 赖氨酸脱羧酶酶活力测定
酶活具体方法参照文献［５，１０－１１］进行。
１􀆰 ２􀆰 ５　 温度和 ｐＨ对赖氨酸脱羧酶活性的影响
在不同温度（２３、３０、３７、４４ 和 ５１ ℃）下测定酶
活力，以未处理的野生型酶液活力为 １００％，计算各
组酶的相对活力。 在不同 ｐＨ（３􀆰 ０、４􀆰 ０、５􀆰 ０、６􀆰 ０、
７􀆰 ０和 ８􀆰 ０）缓冲液（５０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ 乙酸钠）配制的 ５０
ｇ ／ Ｌ赖氨酸底物下，测定酶活力，以未处理的野生型
酶液活力为 １００％，计算各组酶的相对活力。
１􀆰 ２􀆰 ６　 赖氨酸脱羧酶的温度稳定性和 ｐＨ稳定性
在 ｐＨ６􀆰 ０ 条件下，将酶液在不同的温度（２３、
３０、３７、４４和 ５１ ℃）下保温 ２ ｈ，测定酶活力，以未处
理的野生型酶液活力为 １００％，计算各组酶的相对
活力。 酶液与上述不同 ｐＨ（３􀆰 ０、４􀆰 ０、５􀆰 ０、６􀆰 ０、７􀆰 ０
和 ８􀆰 ０）缓冲液（５０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ 乙酸钠）于 ３０ ℃保温
２ ｈ，测定酶活力，以未处理的野生型酶液活力为
１００％，计算各组酶的相对活力。
２　 结果与讨论
２􀆰 １　 ＰＣＲ扩增 ｃａｄＡ和 ｌｄｃ基因结果
首先通过常规 ＰＣＲ 扩增方法获得了 ２ 个赖氨
酸脱羧酶基因： ｃａｄＡ （ ２ １４２ ｂｐ，来自于 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ
ＪＭ１０９）和 ｌｄｃ（２ １９９ ｂｐ，来自于 Ｈ􀆰 ａｌｖｅｉ ＡＳ１􀆰 １００９）
的基因片段，琼脂糖凝胶电泳分析结果见图 １。 查
询 ＮＣＢＩ数据库得知，２种基因的同源性为 ７５％。 胶
回收试剂盒回收 ｃａｄＡ和 ｌｄｃ基因片段的 ＰＣＲ产物，
并经过 ＢａｍＨⅠ和 Ｈｉｎｄ Ⅲ双酶切、纯化，连接到
ｐＴｒｃ９９ａ载体上，获得重组质粒 ｐＴｒｃ９９ａ ｃａｄＡ 和
ｐＴｒｃ９９ａ ｌｄｃ。
２􀆰 ２　 ＤＮＡ改组结果及鉴定
１）限制性内切酶法降解 ＤＮＡ 及回收小片段结
果　 分别用限制性内切酶①ＸｈｏⅠ、②ＥｃｏＲⅠ、③ＰｓｔⅠ、
④ＣｌａⅠ对 ｃａｄＡ 基因片段进行酶切，用⑤ ＳａｃⅠ、
⑥ＣｌａⅠ、⑦ＰｖｕⅠ、⑧ＥｃｏＲⅠ对 ｌｄｃ基因片段进行酶切，
２２ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷　
Ｍ—λ ＥｃｏＴ１４ Ｉ ｄｉｇｅｓｔ ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ；
１—ｃａｄＡ基因片段；２—ｌｄｃ基因片段
图 １　 目的基因 ＰＣＲ扩增产物
Ｆｉｇ􀆰 １　 ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｔｗｏ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔ
琼脂糖凝胶电泳分析，结果见图 ２。
２）无引物 ＰＣＲ 扩增结果　 将由限制性内切酶
获得的 ＤＮＡ小片段分别两两组合作为模板进行一
次无引物 ＰＣＲ，结果进行琼脂糖凝胶电泳分析，结
　 　 　 　 　 　
１～４分别为限制性内切酶①ＸｈｏⅠ、②ＥｃｏＲⅠ、③ＰｓｔⅠ、
④ＣｌａⅠ对 ｃａｄＡ基因片段进行酶切结果；
５～８分别为限制性内切酶⑤ＳａｃⅠ、⑥ＣｌａⅠ、⑦ＰｖｕⅠ、
⑧ＥｃｏＲⅠ对 ｌｄｃ基因片段进行酶切结果；Ｍ为 ＤＬ ２０００ ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ
图 ２　 限制性内切酶酶切 ｃａｄＡ和 ｌｄｃ基因片段
Ｆｉｇ􀆰 ２　 Ｔｈｅ ｒｅｓｔｒｉｃｔ ｅｎｚｙｍｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｄＡ ａｎｄ ｌｄｃ
果见图 ３。 再以上步无引物 ＰＣＲ产物混合为 １管作
为模板，进行二次无引物 ＰＣＲ，琼脂糖凝胶电泳分
析，结果见图 ４。
Ｍ为 λ ＥｃｏＴ１４ Ｉ ｄｉｇｅｓｔ ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ；１～１６为限制性内切酶获得的 ＤＮＡ小片段分别两两组合作为模板进行
一次无引物 ＰＣＲ，即①⑤、①⑥、①⑦、①⑧、②⑤、②⑥、②⑦、②⑧、③⑤、③⑥、③⑦、③⑧、④⑤、④⑥、④⑦、④⑧，
１􀆰 ０％琼脂糖凝胶电泳检测 ＰＣＲ结果
图 ３　 一次无引物 ＰＣＲ
Ｆｉｇ􀆰 ３　 Ｐｒｉｍｅｒｌｅｓｓ ＰＣＲ ｆｏｒ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｔｉｍｅ
　 　 ３）有引物 ＰＣＲ 扩增结果　 以上一步二次无引
物 ＰＣＲ 产物作为模板，进行有引物 ＰＣＲ，获得大小
正确的 ２ ２００ ｂｐ 的目的条带（图 ５），琼脂糖凝胶
电泳。
２􀆰 ３　 ＤＮＡ改组突变体库构建
上述 ＤＮＡ 改组产物克隆、连接到 ｐＴｒｃ９９ａ 表达
载体上，获得重组质粒 ｐＴｒｃ９９ａ ＬＤＣ，利用 ＣａＣｌ２ 转
化法转化至大肠杆菌 ＪＭ１０９，构建了库容约为５ ０００
的初级突变体库。 ＰＣＲ 和双酶切结果验证重组
ｐＴｒｃ９９ａ ＬＤＣ构建成功（图 ６）。
经过 ２轮 ＤＮＡ改组，改组结果较为成功。 经过
ＬＢＸＬ板初筛和高效液相色谱（ＨＰＬＣ）复筛，成功构
３２　 第 ５期 张　 凯等：通过 ＤＮＡ改组技术定向进化赖氨酸脱羧酶基因 ｃａｄＡ和 ｌｄｃ
Ｍ为 λ ＥｃｏＴ１４ Ｉ ｄｉｇｅｓｔ ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ；
１为以上一步一次无引物 ＰＣＲ产物混合为 １管作为
模板进行二次无引物 ＰＣＲ
图 ４　 二次无引物 ＰＣＲ
Ｆｉｇ􀆰 ４　 Ｐｒｉｍｅｒｌｅｓｓ ＰＣＲ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｅｃｏｎｄ ｔｉｍｅ
Ｍ为 λ ＥｃｏＴ１４ Ｉ ｄｉｇｅｓｔ ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ；
１为以上一步二次无引物 ＰＣＲ产物作为模板进行有引物 ＰＣＲ
图 ５　 有引物 ＰＣＲ
Ｆｉｇ􀆰 ５　 ＰＣＲ ｗｉｔｈ ｐｒｉｍｅｒｓ
建了赖氨酸脱羧酶突变体库，建立了高通量筛选方
法，共获得了 ５ ０００多个突变体，获得 １株酶活性提高
的赖氨酸脱羧酶突变体：ＬＤＣ２ １６，其比酶活测定为
４ ８６９􀆰 ８６ Ｕ ／ ｍｇ（以 １ ｍｇ总蛋白计），与 ２种野生型赖
氨酸脱羧酶 ＣａｄＡ（１ ６５２􀆰 ６３ Ｕ ／ ｍｇ）、Ｌｄｃ（２ ３６５􀆰 ９３
Ｕ ／ ｍｇ）相比，在最适温度 ３７ ℃、ｐＨ ６􀆰 ０时，突变体的
比酶活分别是上述野生型酶的 ２􀆰 ９５ 和 ２􀆰 ０６ 倍。 摇
瓶发酵 ５ ｈ后，目标产物 １，５ 戊二胺产量从 ４６􀆰 ９ ｇ ／ Ｌ
达到了 ６３􀆰 ９ ｇ ／ Ｌ，提高了 ３６％。 Ｔａｋａｒａｓｈｉ 等［１２］利用
Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ＪＭ１０９过表达 ｃａｄＡ基因，通过补料、ｐＨ调控等
操作，１５ ｈ后发酵产量达 ６９ ｇ ／ Ｌ；Ｍａｒｔｉｎ 等［１３］以也以
Ｃ􀆰 ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ作为 １，５ 戊二胺生产菌株进行实验，
整个过程经过发酵、ｐＨ调控、热处理、萃取、蒸馏纯化
等步骤，８０ ｈ后１，５ 戊二胺产量达到 ７２ ｇ ／ Ｌ，是目前
Ｍ为 λ ＥｃｏＴ１４ Ｉ ｄｉｇｅｓｔ ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ；
１为双酶切重组质粒 ｐＴｒｃ９９ａ ＬＤＣ
图 ６　 双酶切鉴定重组质粒 ｐＴｒｃ９９ａ ＬＤＣ
Ｆｉｇ􀆰 ６　 Ｄｏｕｂｌｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ
ｐＴｒｃ９９ａ⁃ＬＤＣ
研究报道中的最高生产水平。
图 ７　 野生型酶 ＣａｄＡ、Ｌｄｃ和突变体的酶 ＬＤＣ２ １６的
最适温度和温度稳定性
Ｆｉｇ􀆰 ７　 Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ａｎｄ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ
ｏｆ ｗｉｌｄ⁃ｔｙｐｅ ＣａｄＡ， Ｌｄｃ ａｎｄ ｍｕｔａｎｔ ＬＤＣ２⁃１６
２􀆰 ４　 野生型 ＣａｄＡ、Ｌｄｃ 和突变体的酶 ＬＤＣ２ １６
的最适温度和温度稳定性
　 　 图 ７ 为野生型 ＣａｄＡ 和 Ｌｄｃ 和突变体的酶
ＬＤＣ２ １６的最适温度及其温度稳定性。 由图 ７（ａ）
可知：野生型酶的最适温度均为 ３７ ℃，突变体的酶
ＬＤＣ２ １６的最适温度为 ３０ ℃，同时突变体的酶在
４５ ℃时的相对酶活力依旧维持在 ８０％ ～ ９０％，而野
生型酶在该温度下活性已呈现下降趋势。 由图 ７
（ｂ）可知：野生型酶在 ３０～４５ ℃稳定性较好，突变体
的酶在 ２８～４５ ℃稳定性较好，但在相对较低的温度
４２ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷　
下，野生型酶的稳定性要稍差于突变体的酶。
２􀆰 ５　 野生型 ＣａｄＡ、Ｌｄｃ 和突变体的酶 ＬＤＣ２ １６
的最适 ｐＨ和 ｐＨ稳定性
　 　 图 ８ 为野生型 ＣａｄＡ 和 Ｌｄｃ 及突变体的酶
ＬＤＣ２ １６的最适 ｐＨ及 ｐＨ稳定性结果。 由图 ８（ａ）
可知：野生型酶的最适 ｐＨ 均为 ７􀆰 ０，突变体的酶
ＬＤＣ２ １６ 的最适 ｐＨ 为 ６􀆰 ０ ～ ７􀆰 ０，ｐＨ 范围稍宽。
由图 ８（ｂ）可知：在 ｐＨ ８􀆰 ０时，野生型酶活性迅速下
降，突变体的酶相对酶活力还维持在 ５０％ ～ ６０％。
无论是 ｐＨ范围还是 ｐＨ稳定性，突变体的酶都优于
野生型酶。
图 ８　 野生型酶 ＣａｄＡ、Ｌｄｃ和突变体的酶 ＬＤＣ２ １６的
最适 ｐＨ和 ｐＨ稳定性
Ｆｉｇ􀆰 ８　 Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｐＨ ａｎｄ ｐＨ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｗｉｌｄ⁃ｔｙｐｅ
ＣａｄＡ， Ｌｄｃ ａｎｄ ｍｕｔａｎｔ ＬＤＣ２⁃１６
３　 结论
通过体外定向进化技术对赖氨酸脱羧酶进行
了分子改造，获得 １ 株酶活性提高的赖氨酸脱羧酶
突变体，编号为 ＬＤＣ２ １６，其比酶活为 ４ ８６９􀆰 ８６
Ｕ ／ ｍｇ（以 １ ｍｇ总蛋白计），与 ２ 种野生型赖氨酸脱
羧酶基因表达的酶 ＣａｄＡ （ １ ６５２􀆰 ６３ Ｕ ／ ｍｇ）、 Ｌｄｃ
（２ ３６５􀆰 ９３ Ｕ ／ ｍｇ）相比，在最适温度 ３７ ℃、ｐＨ ６􀆰 ０
时，突变体的比酶活分别是上述野生型酶的 ２􀆰 ９５ 和
　 　 　 　 　
２􀆰 ０６倍。 摇瓶发酵 ５ ｈ后，目标产物 １，５ 戊二胺产
量从 ４６􀆰 ９提高至 ６３􀆰 ９ ｇ ／ Ｌ，提高了 ３６％。 后续实验
可以利用基因测序、定点突变等方法来具体研究氨
基酸突变点对此酶活的影响，进而为解释其蛋白质
结构与功能之间的关系奠定坚实的基础。
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ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ １， ５⁃ｄｉａｍｉｎｏｐｅｎｔａｎｅ： ＵＳ， ２０１００２９２４２９ ［ Ｐ ］． ２０１０⁃
０７⁃２２．
（责任编辑　 荀志金）
５２　 第 ５期 张　 凯等：通过 ＤＮＡ改组技术定向进化赖氨酸脱羧酶基因 ｃａｄＡ和 ｌｄｃ