全 文 ：技术与方法
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 12期
改进酶稳定性的定向进化技术
程峰 董俐住 柳志强 郑裕国
(浙江工业大学生物工程研究所,杭州 310014)
摘 要: 酶作为一种生物催化剂, 以其独特的优良特性, 在 绿色化学!和 清洁生产!中得到了广泛的应用。随着酶定
向进化技术的建立和发展,通过定向进化改进酶稳定性的研究越来越多。详细综述了各种定向进化方法的特点及在提高酶
稳定性方面的应用, 并从结构和功能的角度进一步解释了相关机理。
关键词: 酶的稳定性 定向进化 DNA改组
D irected Evolution for Improvement of Enzyme Stability
Cheng F eng Dong L izhu L iu Zhiqiang Zheng Yuguo
( Institute of Bioeng ineering, Zhej iang University of T echnology, H angzhou 310014)
Abstrac:t As a biolog ica l cata lyst, enzymes w ith unique exce llent properties, have been w ide ly used in green chem istry! and
c leaner production!. W ith the eme rgence and developm ent o f d irected evo lution techno logy, there are a la rge number o f stud ies on
im provements of enzym e stab ility through directed evo lution. This paper elaborated the cha racte ristics o f va rious m ethods of directed e
vo lution and the ir app lication to im prove enzym e stab ility, fu rther explained them echan ism on the leve l of structurefunction re lation
sh ip.
Key words: Enzym e stab ility Directed evo lution DNA shu ffling
收稿日期: 20100817
基金项目:国家高技术研究发展计划 ( 2008AA02Z247)
作者简介:程峰,男,硕士,研究方向:生物催化与生物转化; Em ai:l cfon line102@ 163. com
通讯作者:郑裕国,男,教授,博士,博士生导师,研究方向:生物催化与生物转化; Em ai:l zh engyg@ z jut. edu. cn
随着石油等化石资源日益枯竭、环境加剧恶化,
工业等领域更多地要求进行 绿色生产!, 生物催化
剂以其催化效率高、立体和区域选择性强、反应条件
温和、操作简单、环境友好等优点正广泛应用于精细
化学品的生产中 [ 1 - 4 ]。然而, 虽然通过自然选择产
生了大自然中各种各样能催化一系列化学反应的
酶,但是很少有可以直接应用于工业生产的天然酶。
但由于天然酶的不稳定性等缺点, 围绕着天然酶设
计的反应也可能处于亚适合状态 [ 5]。酶的稳定性
是指酶分子抵抗各种不利因素影响, 维持一定空间
结构, 保持催化活性相对稳定的能力, 包括热稳定
性、pH稳定性、抗氧化性和耐有机溶剂等方面。作
为生物催化剂的一个重要性质,从上世纪 90年代就
被人们所研究 [ 6] , 主要有以下 3方面的原因:有重要
的工业应用价值;相对容易筛选;有与酶稳定性相关
的分子生物学理论基础, 所以酶稳定性的研究具有
商业和科研双重价值。通过定向进化、分子改造,筛
选、开发出高效、稳定的新型生物催化剂已成为生物
化工领域的热点。
酶的定向进化技术是一种不需事先了解酶的
空间结构和催化机制, 人为地创造特殊的进化条
件,模拟自然进化机制, 在体外改造酶基因, 并定
向选择或筛选出所需性能更加优良的酶或创造出
自然界所没有的且优良性质的新酶的方法。近年
来,随着定向进化技术的建立与发展, 通过它提高
酶稳定性的研究越来越多, 其中通过定向进化改
进酶稳定性的文章有近千篇 (表 1 ) ;维普、万方等
中文数据库中关于酶的稳定性的文献也有 1 240
篇。本文通过介绍易错 PCR、传统的 DNA改组、
新型的 DNA改组技术等不同的定向进化策略及其
在酶稳定性方面的应用, 从而综述定向进化在改
进酶稳定性方面的试验进展。
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 12期
表 1 2000- 2010年发表的关于蛋白质 /酶稳定性的文献数量
搜索条目 在 Wed of S cien ce中搜索 文献数量 (文章 /综述 )
Protein stab ilizat ion
Enzym e stab il ization
S tab ili* , protein engineering
Directed evolu tion, S tab ili*
DNA shu ffl ing, Stab ili*
Protein, computat iona,l Pred iction, Stabili*
T itle/Ab stract /Keyw ord s
T itle/Ab stract /Keyw ord s
T itle/Ab stract /Keyw ord s
T itle/Ab stract /Keyw ord s
T itle/Ab stract /Keyw ord s
T itle/Ab stract /Keyw ord s
11145 /436
3301 /91
1451 /33
809 /88
78 /5
217 /3
1 定向进化的方法
对定向进化最常规、最简单的技术无疑是通过
诱变产生多样性的易错 PCR ( epPCR )技术。由 Le
ung等于 1985年首次设计并报道, 由 C ladw ell和
Joyce
[ 7]对其进行完善。其原理是 Taq DNA聚合酶
没有的体外校正活性,在 非最佳 !的条件下扩增目
的基因, 通过加入 Mn2+、增加 Mg2+浓度、使用浓度
不一样的核苷酸或者使用三磷酸核苷类似物, 可使
发生出错的机率显著提高,多轮易错 PCR后突变库
逐步积累,直到获得所需的突变酶。这种方法虽然
简单方便,但基因密码子保守特性的限制使每个密
码子突变仅能产生 5- 7个氨基酸取代,大大限制了
多样性的产生能力。另外, 终止密码子的限制使可
接受的突变率大大下降 [ 8]。
定向进化现代化开始的标志是 1994年 Stem
mer
[ 9]发明了 DNA改组技术。DNA改组 ( DNA shu ff
ling)又称有性 PCR ( sexua lPCR)或分子育种 (mo lecu
lar breeding)技术,相比诱变的方法采用了大片段交
换,适用的靶序列长度宽, 而且具有可反复筛选和无
义突变少等优点。同时, DNA改组并不是针对蛋白
质的某一种特异性进化, 而是可以实现目的蛋白的
多种特异性共同进化。
11 传统 DNA改组方法
最初的 DNA改组是在随机诱变的基础上发展
来的, 经多次改组、筛选后得到理想的突变体, 主要
有以下几个步骤 (图 1): ( 1)利用多种同源核苷酸序
列作为模板,通过易错 PCR建立初级文库。 ( 2)先用
物理方法或 DNase I将起始 DNA分子随机剪切成
100- 200 bp的片段。 ( 3)以自身为引物扩增 DNA
链,进行 40- 60个循环的 PCR重组。 ( 4)在下一个
PCR循环中扩增片段分离, 并在退火后再次以自身
为引物增长, 常常与前一个循环到达不同的位置。
( 5)产物序列接近目的基因长度时加入两侧引物,
通过传统的 PCR循环和凝胶纯化扩增突变体,得到
全长产物并克隆到目标载体中。
Stemmer以 b内酰胺酶模式系统作为试验对
象, 运用定向进化技术, 经过 3轮 DNA改组和 2次
回交最终得到一新菌株, 其头孢噻肟 ( cefo tax ime)的
最低抑制浓度是原始菌株的 32 000倍, 远高于 ep
PCR的突变筛选结果 ( 16倍 )。
111 交错延伸方法 ( StEP) A rno ld和 Zhao[ 10]
等 [ 8]对 DNA改组进一步发展后提出并建立了交错
延伸方法。具体步骤如下: ( 1)在同一 PCR反应中
以具有一定同源性的若干亲本基因作为模板, 进行
PCR扩增反应; ( 2)将退火 /延伸的时间大大缩短以
使得每一循环中延伸产物能和不同的模板退火并进
一步延伸; ( 3)进行多次循环反应,直到全长杂合基
因形成; ( 4)最后应用两端引物扩增, 最终获得完整
的目的大小的杂合基因。由于模板转换,形成的子
链中大多数包含了不同亲本链的序列信息, 从而具
有了新的遗传特性。交错延伸方法的关键在于找到
一个可以使引物退火但又能减少延伸温度或降低聚
合酶反应速率的反应条件, 使得片段可以随机杂交
到包含不同突变的模板上。由此可见, 与最初的
DNA改组相比, S tEP省去了 DNA酶切这一步骤, 从
而简化了改组步骤,缩短了反应时间。
试验中,他们以成熟的枯草芽孢杆菌蛋白酶 E
基因为试验对象, 利用模板转换原理, 巧妙设计
PCR程序, 筛选得到 5个在 65∀ 半衰期为野生型
3- 8倍的突变株后,再以这 5个突变株为模板等量
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2010年第 12期 程峰等:改进酶稳定性的定向进化技术
图 1 传统的 DNA改组与 DNA家族改组的原理与流程图
混合建立文库进行改组, 最后得到约 8 000个在
75∀ 下稳定的突变株, 其中 1个最稳定的突变株在
65∀ 半衰期为野生型的 50倍。
112 DNA家族改组 ( DNA fam ily shu ffling ) 经
典 DNA改组方法虽然能达到定向进化的目的, 但其
随机产生的多为点突变,且有益突变频率较低,导致
筛选工作艰巨且进展缓慢。 Crameri等 [ 11]提出了
DNA家族改组技术, 原理、流程见图 1。他们将 4个
来自不同菌属具有 58% - 82%同源性,都编码头孢
菌素 C酶的基因进行家族改组试验, 并与单个基因
改组的试验结果进行对比。结果发现, 经过多轮改
组进化单个基因改组获得的克隆对头孢菌素 C的
抗性只提高了 8倍, 而家族基因改组得到的最终菌
株对头孢菌素 C的抗性提高了 270- 540倍,比使用
单个基因改组的方法提高约 34- 68倍,进化速率大
幅提高。同时,基因家族改组得到的最高抗性菌株
对其他 内酰胺类抗生素抗性也有变化, 这对于单
个基因改组技术是难以想象的。此外,与原始 DNA
改组相比,由于基因家族改组的快交换特性,突变率
大大提高。在 3次普通 DNA改组后, 内酰胺酶基
因只得到了 4个氨基酸的突变株。而 4个头孢菌素
c酶基因在 1次基因家族改组后就得到了有 102 -
196个氨基酸突变的菌株, 与柠檬酸杆菌属、肠杆菌
属、克雷白杆菌属、耶尔森氏杆菌属相比分别突变了
102、142、181和 196个氨基酸。正是由于 DNA家族
改组的高效性, 使其很快成为 DNA 改组的主要
方法。
12 新型 DNA改组技术
与分子育种相比, DNA改组具有可反复筛选和
无义突变少等优点,但是有两个主要的缺点:非改组
背景克隆子恢复成亲本克隆子; 亲本基因序列的同
源性要求较高 [ 12]。不同于双链 DNA作为改组模板
的 DNA重组技术,近年来,科学家尝试在 DNA家族
改组技术中改变酶切过程、作用模板提高目标嵌合
体的比例。下面介绍几种使用单链 DNA作为改组
模板的 DNA改组技术。单链家族改组在较短模板
上的重组延伸减少了非改组克隆子的背景, 其中
PCR合成法介导的 DNA家族改组法、RACH ITT增
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 12期
加了交换频率,降低了对序列同源性的要求。
121 单链介导的 DNA家族改组 在 DNA改组
过程中通常使用双链 DNA作为模板, 但由于退火过
程中同质双链形成的概率很高,有时往往导致改组
效率很低。常规的 DNA家族改组使用 DNase I进
行酶切。K ikuch i等 [ 13]以编码儿茶酚 2, 3双加氧酶
的同源基因 nahH和 xy lE为研究对象, 经双链 DNA
改组后, 50%的克隆有活性, 随机选取其中的 50个
克隆, 测序发现没有一个具有嵌合性: 15株为 nahH,
26株克隆为 xy lE, 9株为点突变, 嵌合率小于 1%。
而采用具有一定亲缘关系的不同种属的单链 DNA
作为模板进行改组试验, 同样随机选取有活性的克
隆测序分析,发现有 7株发生了嵌合, 40株为亲本
基因, 3株为点突变, 嵌合率达到 14%, 并且其产生
的嵌合基因编码蛋白的热稳定性更好。单链 DNA
改组与双链 DNA改组的惟一区别在于 DN ase I作
用的模板不同。单链 DNA改组时需要将基因在噬
菌体载体 (如 M13)中克隆。尽管单链 DNA改组在
操作上比双链 DNA改组多了一步,但从结果上看它
的效率更高,更具潜力。
122 DNA改组结合瞬时模板随机嵌合 ( RACH I
TT) RACH ITT以全长单链同源基因作为脚手架,
将单链片段和这一脚手架退火 [ 14] ,其最主要的优点
是能产生高度多样性的文库, 避免非改组背景。由
于非改组克隆只会提供无用的信息,因此, RACHITT
方法所获得的进化酶都可能是新酶,这样可获得最大
的筛选结果。而有些方法有 90% - 99%的非改组
克隆, 要获得相同结果需花 10倍甚至 100倍的
努力。
另外, RACH ITT方法对要改组的基因序列同源
性要求低,这也是该方法较其他方法优越之处;对出
发基因同源性要求的降低, 大大提高了候选基因选
择的范围。在没有多个改组基因配体可选择的情况
下,利用随机诱变方法, 仍可成功地将 DNA改组方
法应用于由目标基因随机诱变产生的改组基因配
体上。
降低非改组克隆的背景是这项技术的另外一个
显著优点, 多数情况下定向进化方法可产生高于
75%的改组克隆, 而用 RACH ITT 方法则可产生
100%改组克隆。另外,在 RACH ITT中具有较高的
交换频率,平均每个基因交换次数为 14, 比其他基
于 PCR的方法更能增加文库的多样性。
123 PCR合成法介导的 DNA家族改组 RA
CH ITT是以全长单链同源基因作为脚手架的, 低同
源性的小基因片段往往不适宜采用 RACH ITT技术,
一种建立在一定结构基础上的 PCR合成法克服了
这个难点。该方法通过在每轮 DNA改组中分别添
加不同的特定寡核苷酸引物, 促进退火阶段在同源
性较高的条件下顺利进行片段重组, 从而有效提高
改组频率。Tom inaga等 [ 15]发现, 小球菌素 PA1编
码基因的 N末端与其他细菌素具有高度同源性, 但
由于该基因很小, 如果使用 DN ase I很可能会导致
酶切片段过短以致难以进行有效重组。引入 PCR
合成法后, 他们从 280个嵌合体表达蛋白中筛选得
到 63个对乳酸菌抗性提高的克隆子,并有效增加了
其抗菌谱。
124 定向进化的其他方法 随着酶分子定向进
化的发展, 除以上介绍的方法外, 又相继开发出了
一些定向进化的新方法, 如体外随机引发重组 ( ran
dom prim ing in vitro recomb ination, RPR)
[ 16 ]
;不依赖
于同源性的蛋白质重组方法 ( sequence homology in
dependent protein recomb ination, SH IPREC )
[ 17]
;交替
酶切的产杂合酶技术 ( incremental truncation fo r the
creation o f hybrid enzymes, ITCHY )
[ 18]
;分离 -混合
方法 ( separatem ix ing method) [ 19]以及部分同源基因
片段介导的家族改组 [ 20]等方法,应用这些新方法已
经有相当一部分成功的例子,但仍没有易错 PCR和
DNA改组等传统方法应用得普遍。
此外,结合计算机技术,将数学、统计学以及生
物信息学等学科引入到蛋白质的定向进化中来, 进
行理性设计,将作为定向进化的辅助方法,能够有效
地降低定向进化过程的操作强度和提高蛋白质定向
进化成功的几率 [ 21, 22]。Vo igt和 Arno ld等 [ 23]用计算
的方法,限制了突变库的大小,减小了筛选正向突变
体的工作量。利用统计学方法并结合构建的突变模
型, 对有限突变文库中发生的有益突变的位点分析
发现,突变库中有益突变常常集中发生在那些对替
换容忍程度大的氨基酸残基上 [ 12]。
2 定向进化在改进酶稳定性方面的应用
提高酶活往往是各种定向进化技术的共同目
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2010年第 12期 程峰等:改进酶稳定性的定向进化技术
的, 根据实际工业应用的需要, 在提高酶活的同时
又有了新的要求, 例如, 改善酶的热稳定性, 提高
pH稳定性, 增加立体选择性,改变底物特异性等。
而影响酶稳定性的机制非常复杂, 不仅与二级结
构的共价键、非共价键有关, 而且与蛋白质的三、
四级结构相关, 如酶空间结构中氢键的形成与断
裂、蛋白表面的带电情况、金属离子对酶结构的影
响等,从本质上讲是氨基酸的组成和各种作用力
综合的结果, 所以酶稳定性的研究具有商业和科
研双重价值。
21 定向进化提高酶的 Tm值
酶的热稳定性是研究者最感兴趣的方面。
Palacka l等 [ 24]报道了一个定向进化技术在增加酶的
热稳定性应用中较为成功的例子。他们首先从新鲜
牛粪样本中克隆得到木聚糖酶,并对该酶基因进行
了改造, 从 5 000个突变子中筛选获得了 9个有益
突变, 合并有益突变点后发现, Tm 值增加了
342∀ 。随后,他们构建了突变文库, 从 4 000多个
克隆中筛选得到 33个热稳定性提高的突变体, 其中
一个热稳定性是野生型的 9倍。有趣的是, 所有这
些突变位点都聚集在酶的 N端区域 (图 2), 棍棒模
型标注的氨基酸即是突变氨基酸: D8F、Q11H、
N12L、G17I、G60H、P64V、S65V、G68A和 S79P, 可见
都是前 80个氨基酸残基。
柳志强等 [ 25 ]同时以酶活力和 pH稳定性为指
标, 利用易错 PCR结合 DNA改组方法, 对泛解酸
内酯水解酶进行了定向进化研究。经过 3轮易错
PCR和 1轮 DNA改组, 对约 75万株突变体进行
筛选,最终获得一株酶活力高、且在低 pH条件下
稳定性好的突变株 M ut E861。该突变株的酶活
力是野生型酶的 55倍。对突变体和野生型酶在
pH60和 pH 50条件下的残余酶活进行对比, 在
这两种 pH条件下, 突变体酶的酶活残留分别为
75%和 50% ; 而野生型酶只有 40%和 20%。通过
C lusta lw对突变体 M ut E861酶基因和野生型酶基
因进行分析对比,发现突变体 Mut E 861酶基因发
生了 3处点突变,其中突变使两处氨基酸取代, 即
K 118Q和 V241 I;另一处为沉默突变, 未引起氨基
酸的变化。
该木聚糖酶 (GenBank登录号 AY394562 )来自未知菌种,
该木聚糖酶以 2 dcy为模板 (分辨率 14 A )利用软件
M odeller同源建模得到其空间三维结构,同源性 98%
图 2 一个木聚糖酶的三维结构图
22 定向进化提高酶在极端 pH条件下的稳定性
淀粉酶特别是微生物源的 淀粉酶,广泛用于
工业领域,如淀粉液化和纸浆的生产过程。由于生
产操作的需要, 必须得到更高活力、特别是在碱性
pH条件下 (如清洁剂中 )仍有较高的活力的 淀粉
酶。Cornelius等 [ 26]尝试通过易错 PCR和 DNA改组
技术增强解淀粉芽孢杆菌中 淀粉酶的 pH 稳定
性。研究结果表明, 其中的一个突变株的最适 pH
相比野生型向碱性范围移动了一个单位, 而且在
pH 10时,活力是野生型的 5倍;另一个突变株虽然
pH范围没有发生变化, 但是最高活力是野生型的
9倍。
W ang和 X ia[ 27 ]通过两轮 DNA改组试验, 同时
考察了木聚糖酶的活性、碱性 pH条件下的稳定性、
热稳定性 3个指标, 发现最终突变体在碱性 pH 条
件下的稳定性得到了较大的提高。而且 kcat /Km
较之野生型也提高了 12倍, Km减少 45倍,热稳定
性也有所提高。测序鉴定发现突变后蛋白在以下 5
个氨基酸位置发生了突变: T21A、G25P、V87P、I91T
和 G217L, 其中 3个位点靠近催化中心。进一步做了
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 12期
每个点突变的试验, 发现单突变氨基酸 V87P和
G217L后,酶活和 pH 条件稳定性有明显提高, 而
T21A和 G25P仅对 pH条件稳定性有明显影响,但
没有改变酶活力。
23 定向进化提高酶在氧化环境下的稳定性
早在 1999年 Cherry[ 28] 等就在 Na ture B io te
chology上发表了第一个利用定向进化技术改善酶
的抗氧化稳定性的例子。野生型过氧化物酶在高
pH值 ( 105) ,高温 ( 50∀ ) , 高浓度双氧水 ( 5- 10
mmo l/L )条件下会迅速失活。然而,他们利用定点
突变和易错 PCR两条平行的技术路线, 通过两轮
改组试验创造突变体, 最终筛选得到的突变蛋白
热稳定性是野生型的 174倍, 抗氧化能力也提高
了 100倍。
光学活性的 D氨基酸被广泛应用于抗生素中
间体、抗病毒合成剂、杀虫剂及甜味剂等的生产 [ 29 ]。
N 氨甲酰水解酶的氧化稳定性和热稳定性一直是
制约其发展的瓶颈, Oh等 [ 30]利用 DNA shuffling技
术并结合平板 pH指示剂法筛选得到了 N 氨甲酰
基 D氨基酸酰胺水解酶的突变体,抗氧化性提高了
18倍、耐热性提高了 8倍。测序分析得知 5个氨基
酸发生了突变: Q23L、V40A、H58Y、G75S、M184L和
T262A。分析发现前 4处的突变与酶的氧化稳定性
和热稳定性紧密相关。目前的研究表明, 抗氧化性
稳定性的提高的机理是由于蛋白内部有新的氢键形
成,从而改变了酶的三级结构。
24 定向进化改进酶对有机溶剂的耐受性
水相中的生物催化反应存在以下缺点: 在许多
反应中酶作用的底物水不溶性,遇水容易分解;不少
有机试剂在水相中会产生一些不需要的副反应;许
多反应过程的热力学平衡在水中处于不利条件;有
些产物从水溶液中回收非常困难。尽管水相反应有
这些缺点,但是酶在非水相中往往活性不高,稳定性
较差。
随着现在生物催化技术、特别是非水相的酶催
化技术和定向进化技术突飞猛进的发展, 非水相酶
催化有了长足的进展。 2001年, Song和 Rhee[ 31]就
利用 epPCR和 DNA shuffling技术, 通过两轮不同浓
度的 d imethy l sulfox ide筛选突变菌株, 得到了半衰期
提高 6倍的 3个磷脂酶 A1的突变体: SA8(Y251F和
L263Q )、SA17 ( D168E、A234S、A235V、L263Q ) 和
SA20( V34A和 L292Q ), 试验后发现, 它们在甲苯、
丙酮、丁酸、己烷、辛烷等有机溶剂中的稳定性也大
大提高了,特别是对二甲基亚砜的耐受性有了显著
提高 ( 4倍 )。可以发现,通过设计有效的筛选方法,
定向进化完全有能力产生筛选得到耐受不同有机溶
剂的酶,可大大拓宽酶在工业领域的应用范围。
25 定向进化提高酶在逆胶束系统中的稳定性
溶剂工程的研究经历了从水相到有机溶剂和
逆胶束 (含有表面活性剂与少量水的有机溶剂系
统 )的过程。在水 -有机溶剂两相系统和微水有
机溶剂均相系统中, 有时酶的催化活性不高,而反
相胶束体系能够较好地模拟酶的天然环境。为了
使酶在逆胶束系统中有很高的活力和较好的稳定
性, D an ielsena与 Eklundb等 [ 32 ]通过组合蛋白质工
程的方法,利用 PCR合成法介导的 DNA家族改组
构建脂肪酶的基因突变文库, 筛选得到突变株, 发
现酶对不同侧链长度的底物特异性发生了改变,
同时, 酶的稳定性得到了提高。测序得知 83位的
丝氨酸被苏氨酸取代,后又研究发现该酶 81至 98
位的氨基酸形成了一个 螺旋和两个铰链区, 这
些氨基酸在与底物结合作用的过程中起了类似
开关 !的作用, 开关 !的大小影响了酶的稳定性
和底物特异性。目前, 大多数酶能够在反相胶束
体系保持催化活性和稳定性, 而通过定向进化甚
至表现出 超活性 !和 超稳定性 !。
3 结束语
变异使得物种的进化成为可能, 为了得到能催
化重要反应的酶,过去的十几年中,科学家建立起了
区别于理性蛋白设计的 定向 !进化的一系列方法,
这种策略在不需要知道酶的结构或催化机理的情况
下, 在试管中模仿了自然进化过程,将时间尺度从数
百万年减少到了数月甚至数周。
现在, 定向进化不仅可以应用于生物催化剂活
性, 而且能改善酶的温度稳定性、极端 pH 耐受性、
耐氧化压力、有机溶剂耐受性等等,而且还能使酶在
金属离子、辅因子、表面活性剂存在的条件下发挥作
用。热稳定性和耐操作条件性能的显著提高不仅可
以应用到疫苗和制药领域, 而且可以应用到精细化
工的各个领域。总之,定向进化为生物催化剂从实
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2010年第 12期 程峰等:改进酶稳定性的定向进化技术
验室研究走向工业应用提供了强大的手段。目前,
定向进化在医药工程、工业用酶优化、食品添加剂的
开发、增强植物抗病能力、环境污染治理、改造生物
合成途径等方面都有了可喜的成果, 令众多相关领
域的科学家为之振奋。
参 考 文 献
[ 1] Woh lgem uthR. The lock s and keys to indu strial b iotechnology. N ew
B iotechnol igy, 2009, 25( 4) : 204213.
[ 2] StraathofA J, Panke S, S chm id A. The production of fine chem icals
by b iotrans form at ions. C urr Op in B iotechno,l 2002, 13( 6) : 548556.
[ 3] 郑裕国,薛亚平, 柳志强,等. 腈转化酶在精细化学品生产中的
应用. 生物工程学报, 2009, 25( 12) : 17951807.
[ 4] Panke S, H eldM, W ubb oltsM. T rends and innovat ion s in industri
al b iocatalys is for th e produ ct ion of fin e chem icals. Curr Op in B io
techno,l 2004, 15( 4 ): 272279.
[ 5] Burton SG, Cow an DA, Wood ley JM. Th e search for the id eal b io
catalys t. Nat B iotechno,l 2002, 20( 1) : 3745.
[ 6] Fg in C. Understand ing and increasing protein stab ility. B ioch im
B iophysA cta, 1995, 1252( 1 ): 114.
[ 7 ] C aldw ell RC, Joye GF. Random ization of genes by PCR m u tagene
sis. PCR M ethodsApp lic, 1992, 2 ( 1) : 2833.
[ 8] A rnold FH. Advances in protein chem is try. introdu ct ion. Adv Pro
tein Chem, 2000, 55: 79160.
[ 9] S temm erWPC. Rap id evolu tion of a p rotein in v itro by DNA shu ff
ling. Natu re, 1994, 370 ( 6488) : 389391.
[ 10 ] ZhaoH, G iver L, Shao Z, et a.l M olecu lar evolut ion by staggered
exten sion p rocess ( S tEP) in vi tro recom b ination. Nat B iotechno,l
1998, 16( 3) : 258261.
[ 11 ] C ram eriA, Ra illard SA, Bermudez E, et a.l DNA shu ffl ing of a
fam ily of genes from d iverse species accelerates d irected evolut ion.
Nature, 1998, 391( 6664) : 288291.
[ 12 ] 孙志浩, 柳志强. 酶的定向进化及其应用. 生物加工过程,
2005, 3 ( 3) : 713.
[ 13 ] K ikueh iM, Ohn ish iK, H arayam a S. Novel fam ily shu ffl ingm eth
od s for the in v itro evo lut ion of enzym es. G ene, 1999, 236 ( 1 ) :
159167.
[ 14 ] C oco WM, Lev insonWE, C ristM J, et a.l DNA shu ff ing m ethod
for gen erat ing h igh ly recomb in ed gen es and evolved enzym es. Na
ture B iotecho,l 2001, 19 ( 4) : 354359.
[ 15 ] Tom inaga T, H atakeyam a Y. Developm en t of innovat ive pediocin
PA1 by DNA shuff ling among class IIa bacteriocins. Appl ied and
E nviromn entalM icrob iology, 2007, 73 ( 16) : 52925399
[ 16 ] Shao Z, ZhaoH, G iver L, et a.l Randomprim ing in v itro recomb i
nation: an effect ive tool for d irected evolu tion. Nucl Acids Res,
1998, 26( 2) : 681685.
[ 17] S ieber V, M art inez CA, Arnold FH. Lib raries of hybrid proteins
from d istant ly related sequen ce. Nat B iotechno,l 2001, 19: 456460.
[ 18] Grisw oldKE, Kawarasak iY, Ghoneim N, et a.l Evolu tion of h igh
ly active enzym es by hom ologyind ependen t recom b ination. Pro
ceedings of the Nat ional Academy of Sciences of the Un ited S tated
ofAm erica, 2005, 102 ( 29) : 100827.
[ 19 ] An Y, Ji J, Wu W, et a.l M olecu lar evolut ion of adom et syn
th etase by DNA recomb inat ion w ith a novel separatem ixing m eth
od. M olecu lar B iology, 2006, 40 ( 3) : 486492.
[ 20] Barriau ltD, PlanteMM, SylvestreM. Fam ily shu ffling of a targe
ted bphA region to engineer b iphenyl d ioxygenase. B acterio,l
2002, 184 ( 14) : 37943800.
[ 21] M oore GL, Maran as CD. Pred ict ing ou tofsequence reassem b ly in
DNA shu ff ling. J Theor B io, 2002, 219 ( 1) : 917.
[ 22] M oore GL, Maran as CD, GutshallKR, et a.l M od eling and opt i
m ization of DNA recom b ination. C ompu ters and Chem ical E ngi
n eering, 2000, 24 ( 27 ) : 693699.
[ 23] V oigt CA, Mayo SL, Arno ld FH, et a.l C om pu tat ion alm ethod to
redu ce the search sp ace for d irected protein evolu tion. P roc N at
A cad SciUSA, 2001, 98( 7 ) : 37783783.
[ 24] PalackalN, Brennan Y, C allenWN, et a.l An evo lut ionary rou te
to xylanase process f itness. Protein S c,i 2004, 13 ( 2) : 494503.
[ 25] 柳志强,孙志浩,郑璞,等. D泛解酸内酯水解酶的定向进化.生
物工程学报, 2005, 21 ( 5) : 93101.
[ 26] B essler C, S chm itt J, M au rer KH, et a.l Directed evolut ion of a
b acterial aam ylase: tow ard enh anced pH perform ance and h igher
sp ecific act ivity. Protein S cien ce, 2003, 12 ( 10) : 21412149.
[ 27] W angQ, X ia T. Enhancem en t of the therm ostab ility and hydro lytic
activity of GH 10 xylanase by modu le shuff ling b etw een C ellu
lom onas f im i C ex andTh erm om onospora a lba Xy lA. W orld Journ al
ofM icrob io logy and B iotechnology, 2007, 23( 8 ) : 10471055.
[ 28 ] Cherry JR, Lam saMH, S chneider P, et a.l D irected evolut ion of a
fungal perox idase. N ature B iotechn ology, 1999, 17 ( 4) : 379384.
[ 29] W angYS, Zheng RC, Xu JM, et a.l Enan tioselect ive hydrolys is of
(R ) 2, 2dim ethy lcyclopropane carboxam id e by imm ob ilized cells
of an Ram idaseproducing bacterium, De lf tia tsu ruhaten sis CCTCC
M 205114, on an alg inatecapsu le carrier. J IndM icrob iol B iotech
no,l 2010, 37( 5 ): 503510.
[ 30 ] OhKH, Nam SH, K im H S. D irected evolut ion ofNcarbamy lDa
m ino acid am idohydrolase for s imu ltaneous im provem en t of ox ida
tive and th erm al stab ility. B iotechnol Prog, 2002, 18( 3 ) : 413417.
[ 31] Song JK, Rhee JS. Enhancem ent of stab ility and activ ity of phos
phol ipase A ( 1 ) inorgan ic solven ts by d irected evo lut ion. B ioch im
B iophys Acta, 2001, 1547( 2 ) : 370378.
[ 32] Dan ielsen S, Ek lund M, Deussen H J, et a.l In v itro select ion of
enzym atically active lipase varian ts from phage l ibraries us ing a
m echan ismbased inhibitor. Gene, 2001, 272 ( 12) : 267274.
99