全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·技术与方法· 2008年第3期
收稿日期:2007-12-03
基金项目:河南省高校杰出科研人才创新工程项目(2006KYCX008),“河南省教育厅高等学校创新人才培养工程”(河南省教育厅,豫教
高[2005]126号)
作者简介:刘莹(1981-),女,河南安阳人,硕士研究生,研究方向:食品微生物学
通讯作者:曹健,E-mail:biotech@haut.edu.cn
自然界在漫长的进化过程中,进化出了作用非
常精确而高效的酶。然而,自然界的进化过程太过
漫长,如何在实验室条件下模拟自然界的进化过
程,在较短的时间内获得符合人们需要的酶一直是
人类的一个梦想。近些年来,先后出现了许多加速
蛋白质和酶体外定向进化的方法,DNA改组(DNA
shufling)技术就是其中一种应用最广泛且简单有
效的分子体外定向进化方法。对 DNA改组技术的
原理以及近年来在酶工程中的应用进行了综述。
1 DNA改组技术原理
1994年,美国人 Stemmer[1]首次提出了 DNA改
组技术,该技术通过改变单个基因或基因家族
(genefamily)原有的核苷酸序列创造新的基因,并
赋予基因表达产物以新的功能。该策略的目的是为
亲本基因群中的突变创造尽可能的组合机会,最终
获取具有最佳突变组合的酶。
DNA改组是基因在分子水平上进行的有性重
组是一种反复性突变、重组的过程。主要包括以下
步骤:(1)目的 DNA片段的获得;(2)目的基因的随
机片段化,即将目的基因(可以是单个基因或一组
相关基因)酶切成随机片段,这些随机片段集合包
含了来自不同的同源序列的寡核苷酸,这些寡核苷
酸具有不同的 3′末端,从而为下一步的无引物 PCR
提供了条件;(3)无引物 PCR,即具有互补 3′末端的
寡核苷酸互为引物,各为模板,通过不断的 PCR循
环,在不同模板上随机互补结合并进一步延伸;(4)
有引物 PCR,即以上轮无引物 PCR的产物为模板,
加入基因两端序列为引物,经过多轮 PCR得到重
排产物的集合,称为突变文库;(5)克隆、筛选、分析
及多轮筛选,即进一步对突变文库进行筛选,选择
改良的突变体组成下一轮改组的模板,重复上述步
骤进行多次重排和筛选,最终获得性状比较理想的
DNA改组技术在酶工程中的应用
刘莹 曹健 王中太 杨永刚 黄亮
(河南工业大学生物工程学院,郑州 450052)
摘 要: DNA改组技术是一种应用最广泛且简单有效的分子定向进化方法。它是一种高通量的随机突变筛选技
术,可以对目的基因进行多次重组和选择,得到性质优良的突变文库。介绍了DNA改组技术的原理及其在酶工程中的应
用。
关键词: DNA改组 酶工程 应用
ApplicationsofDNAShuflinginEnzymeEngineering
LiuYing CaoJian WangZhongtaiYangYonggang HuangLiang
(ColegeofBiologicalEngineering,HenanUniversityofTechnology,Zhengzhou450052)
Abstract: DNAshuflingisoneofthemostwidelyusedmethodsaswelasasimpleandeficienttechnologyfor
directedmolecularevolution.DNAshuflingisahighthroughputrandom mutationscreeningasay,whichcanrecombinate
andselectthesequenceofthetargetgeneformanytimes,andmutationlibrariesoffinepropertiescanbeobtainedasa
result.PrincipleandapplicationofDNA shuflingtechniqueinthefieldofenzymeengineeringwasreviewedinthis
paper.
Keywords: DNAshufling Enzymeengineering Application
2008年第3期
突变体。
2 DNA改组技术在酶工程中的应用
DNA改组技术是一种高通量的突变、筛选技
术,通过 DNA重组技术得到的突变文库具有容量
大、多样性好等优点。与传统的分子进化方法相比,
DNA改组可以更快地加速分子进化进程,取得更
好的进化效果。因此,DNA改组技术在酶工程、代
谢工程以及医药等领域都得到了广泛的应用,显示
出巨大的应用价值。DNA改组技术对分子酶工程
的发展具有重大的影响,已应用到提高酶活性、稳
定性以及改变底物专一性等方面。
2.1 提高酶的催化活性
Wang[2]等人通过定向进化的方法改良天冬氨
酸酶,经过 PCR和 3轮 DNA改组,得到的优化突
变体活性提高了 28倍,热稳定性也得到相应的提
高。
ZhouZ[3]等人利用 DNA基因家族改组的方法,
对来自于大肠埃希氏菌(Escherichia.coli)、嗜柠檬
酸克吕沃尔氏菌(Kluyveracitrophila)和雷氏普罗威
登斯菌 (Providenciaretgeri)的同源性在 62.5%~
96.9%之间的青霉素 G酰化酶(PGA)基因 pga进行
了改组,得到的 PGA突变文库活性比原酶提高
40%;进一步研究还发现 PGA的 α亚单位与合成
活性的提高有关。
β-葡萄糖苷酸酶(beta-glucuronidase,GUS)基因
作为报告基因有着广泛的应用。熊爱生等[4]选择大
肠杆菌的 GUS基因作为模板,通过 DNA改组技术
构建了突变 GUS基因的原核表达质粒库,经高活
性筛选,获得了活性提高 3倍的 GUS基因。
BesslerC等[5]对淀粉液化芽孢杆菌(Bacilusam
yloliquefaciens)的 α-淀粉酶基因进行了 DNA改组,
经高通量筛选后得到的 α-淀粉酶,pH耐受性和酶
活性比原酶均有所提高,其中一个 α-淀粉酶在
pH10的条件下,酶活力比原酶提高了 5倍。
2.2 改变酶对底物的专一性
β-半乳糖苷酶是大肠杆菌中最大的一种蛋白,
ZhangJH等[6]运用 DNA改组技术,以 LacZβ-半乳
糖苷酶为模板,经过 7轮筛选得到改良酶,和野生
型 β-半乳糖苷酶相比,改良酶对邻硝基苯酚岩藻
糖邻硝基半乳糖苷的相对专一性提高了 300倍,改
良的岩藻糖苷酶底物的 Kcat/Km值比大肠杆菌自身
的岩藻糖苷酶提高了 10~20倍。
BariaultD[7]等对 3种联苯双加氧酶(BPDOs)
的关键基因 bphA进行了基因家族改组,数据表明:
LB400BphA中含有 7个氨基酸的片段 335TFNNIRI341
被 B-356或 P6的 BphA中的 333GINTIRT339片段取代
有助于酶底物专一性的降低。
此外,利用 DNA改组技术进行底物专一性改
造的酶还有 β-内酰胺酶、核酶、细胞色素 C过氧化
酶(CCP)、磷酸酯酶等。
2.3 提高酶的稳定性
酶的稳定性易受温度、pH值和溶液浓度的影
响,因此在工业应用中也受到一定的限制。应用
DNA改组技术可以得到性能更为稳定的各种特定
功能的酶,满足工业生产的特殊需要。
KimYM等[8]对栖热菌(Thermussp.)IM6501菌
株中具有热稳定性的麦芽糖淀粉酶(Maases)进行
了 DNA改组,经过 4轮改组和筛选,得到了具有高
耐热性的麦芽糖淀粉酶。
NessJE等[9]对同源性在 56%~99%之间的 26个
枯草芽孢杆菌蛋白酶基因进行了改组,结果发现,
77个克隆在 pH10下的活性比原酶高,另外一些克
隆的热稳定性提高了 3倍,溶剂稳定性提高了 115
倍,某些克隆的上述特性均得到了提高。
Song和 Rhee[10]利用随机突变和重组的方法筛
选得到的三株磷脂酶 A1突变体,其稳定性和活性
都得到了较大的提高。
Arnold等人[11]通过 DNA改组获得一株辣根过
氧化物酶突变体,该突变体能耐受较高浓度的
H2O2、十二烷基硫酸钠和盐类。
2.4 创造新的活性
Fersht[12]等人通过将 α/β-桶状蛋白支架进行氨
基酸替换,使其吲哚-3-甘油磷酸合成酶(indole-
glycerol-phosphatesynthase,IGPS)活性转变成为磷
酸核糖邻氨基苯甲酸异构酶(phosphoribosylanthranil
ateisomerase,PRAI)活性。
2.5 增加微生物酶的抗性
Arizubieta等[13]采用用易错PCR(eror-pronePCR)
扩增和 DNA改组技术对来自多粘类芽孢杆菌
(Paenibaciluspolymyxa)的 β-葡萄糖苷酶(bglB)进
刘莹等:DNA改组技术在酶工程中的应用 55
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第3期
行筛选,得到了抗热性提高的突变株。将这些突变
株重新进行 DNA改组,筛选得到了一个抗热性提
高了 20倍的新突变基因,
砷是一种毒性很大的物质,砷和砷的化合物广
泛存在于自然界和人们的生活中,严重影响着公众
的健康。Crameri等通过 DNA改组技术改造砷抗性
基因,经过 3轮改组和筛选,得到了对砷的抗性提
高 40倍的突变体。
弗氏柠檬酸菌(Citrobacterfreundi)、阴沟肠杆
菌 (Enterobactercloacae)、小肠结肠炎耶尔森氏菌
(Yersiniaenterocolitica)和肺炎克雷伯氏杆菌(Klebs
ielapneumoniae)4种菌的头孢菌素酶基因同源性
在 58%~82%之间,CrameriA等[14]对它们的基因进
行了 DNA改组,结果显示,单基因的改组产生的突
变体对头孢羟羧氧酰胺(moxalactam)的抗性增加了
8倍,而多基因的基因家族改组得到的突变体抗性
可以增加 270~540倍。
3 展望
DNA改组技术不但可以对单个基因进行改
组,还可以进行家族改组,从而大大加速了酶进化
的过程,可以在较短的时间内得到需要的蛋白。由
于针对的是某个特定的基因,因此改组后的基因表
达产物易于识别、鉴定,效率也比较高。另外,DNA
改组技术不需要事先了解酶的空间结构和催化机
制就可以对酶进行改造,对于那些结构与功能相互
关系尚不明确的蛋白质而言,更是一种有效途径,
可以得到性质更优、功能更强大的新酶。DNA改组
技术能积累大量的有益突变,已经成为一种快速、
高效的酶定向进化技术。
DNA改组技术自诞生以来,已经被广泛应用
于酶、药用蛋白等领域,很多成功的实例已经证明
了 DNA改组是目前最方便、最有效的一种将有利
突变迅速积累的体外进化方法。随着 DNA改组技
术的不断优化和高通量筛选方法的建立,该技术在
酶工程领域的应用范围也将不断拓宽,必将会在工
业、农业、医药以及生物治理环境污染等领域做出
更大的贡献。
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