全 文 ：·技术与方法·
生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 11期
蛋白质定向进化技术的研究进展
苏怡丹 1, 2 　伍宁丰 2 　刘国安 1
(1西北师范大学生命科学学院 ,兰州 730070; 2中国农业科学院生物技术研究所 ,北京 100081)
　　摘 　要 : 　蛋白质定向进化技术是蛋白质分子改造的一个重要策略。重点介绍了易错 PCR、DNA改组等对编码蛋白质
的基因进行随机突变和重组的技术 ,以及构建突变体库和高通量筛选的方法 ,并探讨了定向进化技术在蛋白质工程中的应
用及前景。
关键词 : 　定向进化 易错 PCR DNA改组 高通量筛选
Research on D irected Evolution of Prote in
Su Yidan1, 2 W u N ingfeng2 L iu Guoan1
(1 College of L ife Science, N orthwest N orm al University, Lanzhou 730070;
2 B iotechnology Research Institu te, Chinese Academ y of Agricultural Sciences, B eijing 100081)
　　Abs trac t: 　 D irected evolution of p rotein is the effective strategy for the p rotein imp rovement. This review introduced the tech2
niques for the mutation and recombination of DNA using error2p rone PCR, DNA shuffling methods, and generation of mutational library
and high throughput screening. Meanwhile, recent app lications and development of directed evolution of p rotein were also reviewed in
this paper.
Key wo rds: 　D irected evolution Error2p rone PCR DNA shuffling H igh2throughput screening
收稿日期 : 2009208220
基金项目 : 国家“863”计划项目 (2007AA100605)
作者简介 : 苏怡丹 (19832) ,女 ,汉族 ,甘肃省兰州人 ,理学硕士研究生 ,研究方向 :生物化学与分子生物学 ; E2mail: wunf@caas. net. cn
通讯作者 : 刘国安 (19642) ,女 ,博士 ,副教授 ,硕士生导师 ,主要研究方向为生物化学与药理学
　　定向进化技术是一种在生物体体外 (试管中 )
模拟达尔文进化 ,利用自然选择的动力进化出在自
然界并不存在的或是具有更优性质的蛋白。蛋白质
定向进化技术从上世纪 70年代就开始了。最早的
一个例子是进化一个来源于大肠杆菌的 EbgA 蛋
白 ,这个酶几乎不具备β2半乳糖苷酶的活性。通过
以乳糖为单一碳源的平板上筛选 Lac - 缺失的大肠
菌株 ,野生型的 EbgA就进化成为了具有β2半乳糖
苷酶活性的酶 [ 1 ]。令人惊奇的是 ,如 EbgA一样 ,酶
新功能的进化只需要很少的突变。在过去的 60
年中 ,蛋白定向进化技术得到越来越广泛的应用 ,
在蛋白质工程领域当中提供了强有力的技术平
台。这项技术综合了分子生物学的方法和高通量
的筛选技术从而使其更具优势 ,可以简化试验过
程 ,并且能够筛选出即便只有小幅提高目的性状
的突变体。
通常一个典型的蛋白质定向进化技术涉及到三
步 :首先是多样化 ,将目的蛋白的编码基因进行突变
或是随机重组产生一个含有多个基因的突变体库。
其次是选择 ,在包含有目标性质的突变体库当中进
行筛选 ,筛选可以识别并分离出高性能的突变体 ,同
时选择过程也意味着自动排除所有的非功能性突
变。最后是扩增筛选出的突变子 ,研究其 DNA 序
列 ,理解蛋白功能与序列的相互关系。将这三步综
合到一起组成了定向突变的一个循环。在试验当
中 ,用之前循环得到的最优作为下一轮的模板 ,从而
产生更多样化的突变体库。蛋白质定向进化方法的
优点在于即使研究者不需要了解蛋白的空间结构以
及某种特性的作用机制 ,也可以对蛋白进行改造 ,这
样大大扩宽了蛋白质工程学的研究和应用范围。
随着分子生物学技术的不断发展 ,特别是 PCR
和基因重组技术的应用以及对于突变基因 DNA序
© 1994-2011 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 11期
列的分析研究 ,定向进化已从体内转为在体外进行。
体内进化的优势在于可以在细胞内环境中进行筛
选 ,特别是当突变蛋白习惯于活体组织时。但是体
外进化在可用的筛选方法上更加多样 ,能够选用
高通量筛选和体外展示技术 ,试验方法也变得简
便、快速和高效 ,更进一步拓展了体外定向进化的
应用范围。
蛋白进化的首要目的就是产生具有新的或是更
好性状的蛋白。除了加深对在自然界中进化过程的
理解 ,还要赋予这些蛋白或是酶理想的性状 ,使其更
好地在化学、农业和制药工业中的应用。以下两种
方法可以实现这一目的。第一种方法是定向进化 ,
建立一个突变体库并在其中寻找具有所需性状的
克隆子。第二种是理性设计 ,这一方法基于对所
要改造蛋白的结构或作用机理上的理解而作出的
特定改变。
1　蛋白质定向进化技术
建立突变体库是进行蛋白质定向进化的首要步
骤 ,运用不同的技术增强突变体库的多样性。
1. 1　无性突变
1. 1. 1　易错 PCR技术 　所谓无性突变是指发生在
分子内部的单一突变 ,最常见的无性突变技术是易
错 PCR技术。易错 PCR是一种简便快速的在 DNA
序列中随机制造突变的方法 ,它是通过改变传统
PCR反应体系中的 Mg2 +浓度、dNTP的浓度比例、
pH值或使用低保真度的 Taq酶 ,使碱基在一定程度
上随机引入错误而创造序列多样性文库 [ 2 ]。这种
方法对于建立任意核苷酸序列文库或是在表达及筛
选过程引入突变同样有用。但是 ,由于这种方法的
关键在于控制合适的突变频率 ,所以较低的突变率
(每代每序列有 2～3个碱基置换或一个氨基酸替
代 )可以积累大部分的有益突变 ,而较高的错掺几
率将产生中性突变或有害突变。另外 ,此法又是在
分子内部进行的单一突变 ,有害突变要比有益突变
多。当一个突变体中有害突变占大多数时 ,一般仅
能形成无活性的蛋白分子 ;同样 ,如果突变位点过
少 ,则野生型序列在整个体系中占绝对优势 ,特征表
现不明显 ,也不利于后续的筛选和鉴定工作。
1. 1. 2　定点突变和定点饱和突变技术 定点突变
技术 ( Site2directed mutagenesis)一般用于对 DNA分
子特定位点的突变 ,所以需要预先知道野生型基因
序列。早在 1978年 M ichael Sm ith就运用寡核苷酸
进行定点突变 [ 3 ]。定点突变的基本原理是首先合
成一段含有突变碱基的 DNA引物 ,然后这段合成的
引物可以杂交到包含有目的基因的单链 DNA上 ,用
DNA聚合酶将剩余片段进行延伸 ,得到的双链分子
转入到宿主细胞并被克隆 ,最后用特定的筛选方法
将突变子筛选出来。定点突变技术有盒式诱变 [ 4 ]
和多种基于 PCR的突变方法 ,最常见的有重叠 PCR
等方法。当靶位点氨基酸分别可被其它 19种氨基
酸代替而得到突变子的方法 ,称为定点饱和突变技
术 ,此方法是要着重寻求靶位点的最适氨基酸 [ 5 ]。
定点突变和定点饱和突变技术的运用 ,能极大地丰
富突变体库的多样性。
1. 1. 3　组合活性中心饱和突变试验 组合活性中
心饱和试验 ( combinatorial active2site saturation test,
CAST)的基本原理是 :在酶的活性中心部位寻找一
系列在空间位置上相互接近的氨基酸对作为突变位
点 ,选择的氨基酸对必须是在侧链基团取向上具有
潜在的协同作用 [ 6 ]。因此 ,突变后才可能获得更具
有潜力的突变体。这是单点突变不能做到的。如果
选择的氨基酸对应的位置是 n,则第 2个氨基酸的
选择遵循以下的原则 :如果第 n个氨基酸在环上 ,则
另一个氨基酸选择第 n + 1位 ;若在β折叠上则选
择第 n + 2位 ,若在 310螺旋上 ,则选择第 n + 3位 ;若
在α螺旋上 ,则选择第 n + 4位。对于 CAST突变体
库容量的计算 :每突变一对氨基酸要进行饱和随机
突变 ,即这一对氨基酸要突变成 20种氨基酸的任何
一种。以 NN K (N 代表任何一种核苷酸 , K代表是 G
或 T)作为突变的碱基形式 ,则有 322 = 1 024种不同
的组合 ,而氨基酸则可突变成 202 = 400种不同的组
合。因此 ,要将每个库的所有突变的覆盖率达到
95% ,则每个库至少要挑 3 000个克隆子。
此外 ,近年来还发展出了更多的、新颖的无性突
变技术。例如 ,三核苷酸突变 ( TriNex) [ 7 ] ,随机插
入 2删除突变 (R ID ) [ 8 ] ,序列饱和突变 ( SeSaM ) [ 9 ]以
及它的改进方法 SeSaM 2Tv + [ 10 ]。这些方法都是为
了能最大程度的增强突变体库的多样性 ,丰富并延
伸无性突变的方法手段。
44
© 1994-2011 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
2009年第 11期 苏怡丹等 :蛋白质定向进化技术的研究进展
1. 2　DNA改组
DNA改组最初是 1994年由 Stemmer等 [ 11 ]提出
来的 ,指将目的片段切割成随机片段后通过 PCR进
行重新聚合 ,从而产生突变体。DNA重组是基因在
分子水平上进行的有性重组 ( sexual recombination) ,
因此也称为分子育种 (molecular breeding) [ 12 ]。
由于传统定点突变方法是低频率的有益突变 ,
所以成功率并不高。并且目前对蛋白结构功能关系
的知识了解还有所欠缺 ,所以运用定向突变的方法
有很大的局限性。DNA 重组是允许有益突变的直
接重组 ,从而克服了这一缺陷 ,同时也克服了易错
PCR只能发生点突变而不能进行序列小片段之间
交换的缺点 ,大大提高了进化效率。DNA改组能
将漫长的进化过程大大缩短 ,在短时间内创造出
海量的突变体库 ,同时有益突变的比率也大大增
加了。
1. 2. 1　单基因改组 　将单基因用 DNA酶 Ⅰ进行随
机切割 ,获得较大的 DNA片段混合体。该混合体在
不加引物的情况下直接进行 PCR,从而得到 DNA不
同区域间随机重组的新的 DNA突变体 ;最后再以目
的基因两端的引物将 DNA扩增成全长 ,重构突变产
物 ;最后将 PCR产物在一定寄主细胞中表达并筛选
出希望获得的突变体。如此进行多次循环 ,直到筛
选出理想的突变体。这种方法虽然突变率和良性率
都比无性突变高 ,但是 DNA重组只是发生在单一基
因内部 ,没有与外界发生更多的交流 ,所以准确意义
上讲还不能算做有性突变。
外显子改组 ( exon shuffling) [ 13 ]类似于 DNA改
组 ,两者都是在各自含突变的片段间进行交换 ,不同
的是 ,外显子改组是靠同一种分子间内含子的同源
性进行重组的 ,而 DNA改组不受限制。外显子改组
更适用于真核生物。
1. 2. 2　基因家族改组 　在基因改组的基础上 , 1998
年由 Crameri等 [ 14 ]提出了基因家族改组技术 (DNA
fam ily shuffling) ,至此才是真正的有性重组的开始。
基因家族改组与单基因改组最大的区别在于出发序
列的同源性。利用基因家族同源序列进行 DNA改
组 ,实现同源重组。由于同源序列是经过自然选择
保留下来的相对有益或无害的片段 ,所以基因家族
改组的突变机率和改组效率明显提高 ,体现了基因
的多样性。
1. 2. 3　交错延伸过程 交错延伸过程 ( StEP)是由
Zhao等 [ 15 ]提出的一种简化的 DNA改组技术 ,它将
含有不同点突变的模板混合 ,随之进行多轮变性 ,短
暂复性后随之延伸反应。在每个循环中 ,延伸的片
段在复性时与不同的模板配对 ,最终合成的全长是
包含了不同模板 DNA的信息。此种方法省去了酶
切的过程 ,大大简化了时间 ,提高了效率。
随着酶分子定向进化的发展 ,在常规的定向进
化方法的基础上 ,又相继开发出另一些新方法 ,如依
赖同源性重组的临时模板随机嵌合技术 ( random
chimeragenesis on transient temp lates, RACH ITT) [ 16 ]、
设计的寡核苷酸装配 ( assembly of designed oligonu2
cleotides, ADO) [ 17 ]、诱变和单向重组 (mutagenic and
unidirectional reassembly,MURA) [ 18 ]、随机插入 2删除
链交换突变 ( random insertional deletional strand ex2
change mutagenesis, RA ISE) [ 19 ]、体外随机引发重组
( random p rim ing in vitro recombination, RPR ) [ 20 ]、基
于 Y连接的构件改组 ( Y2ligation2based block shuff2
ling, YLBS) [ 21 ]、合成改组 ( synthetic shuffling) [ 22 ] ,以
及不依赖于同源性的蛋白质重组方法 ( sequence ho2
mology2independent p rotein recombination, SH IPR2
EC) [ 23 ]、用于产生杂合酶的递增截短 ( incremental
truncation for creation of hybrid enzymes, ITCHY) [ 24 ]
以及非同源随机重组 ( nonhomologous random recom2
bination, NRR)等 [ 25, 26 ]。新方法都有改造蛋白的成
功案例 ,也为更好的进行定向进化提供了强有力的
工具和指导思想。
1. 3　无性突变与有性重组的综合应用
有人将易错 PCR与 DNA改组综合起来运用 ,
它们各有优势 ,易得到具有优良性状的克隆。例如 ,
先运用易错 PCR引入点突变 ,构建起始基因文库 ,
筛选出所有良性克隆 ,以此作为亲本基因再进行
DNA改组 ,使得有益突变迅速积累 ,导致功能明显
提高。同时还可以进行多轮改组 , 得到更好的
结果 [ 27 ]。
2　筛选方法
蛋白定向进化最核心的部分在于建库的多样性
和筛选的高效性。在一个突变体库建好之后 ,选择
一个灵敏、高通量、被证明能用于目标筛选的方法 ,
54
© 1994-2011 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 11期
能否快速、准确的在庞大的突变体库中寻找出所需
克隆是决定定向进化成败的关键因素 [ 28 ]。
筛选过程首先是将突变基因进行分离并尽可能
多地表达成蛋白质 ,其次是将蛋白质的活性通过亲
和、催化或报告基因等方式表现为可检测的形式 ,最
后是将符合要求的蛋白质分离出来 [ 29 ]。筛选方法
选取以下标准 :首先对目的蛋白要具有针对性 ,即所
筛即所得 ,这也被称为进化第一定律。其次 ,必须是
高通量的筛选方法。最后 ,检测方法必须可行 ,检测
过程必须灵敏。总的来说 ,筛选没有一个通用的法
则 ,方法要根据所需蛋白的特性所决定。目前 ,传统
的筛选方法多采用琼脂平板克隆筛选或利用荧光检
测粗酶裂解液的酶活 ,但它们的灵敏度相对较低 ,后
者还要辅助自动化仪器才能达到高通量的目的。近
几年 ,由于核糖体展示技术 (RD )和 mRNA 展示技
术 ,在体外无细胞翻译体系中进行 ,不受克隆和细胞
转化效率的限制 ,所以具有库容量大的优点 ,得到了
广泛应用 ,同时还可以应用于任何有细胞毒性分子
的筛选与研究。另外 ,还有其他的一些高通量筛选
技术 ,如噬菌体表面展示技术、反胶束分离、QREST
( quering for enzymes using the three2hybrid system)系
统以及荧光激活细胞分检技术 ( FACS)等 [ 30 ]。
3　定向进化技术的应用及前景
通过蛋白质的定向进化技术对蛋白进行分子
改造 ,极大地促进了酶工程、代谢工程以及医药等
很多领域的发展 ,对增强蛋白的稳定性及底物特
异性、改变或增强蛋白质的活性等方面都取得了
巨大的成果。
3. 1　提高酶的催化活性
提高酶的催化活性是人们进行蛋白质改造最基
本的愿望之一。有许多报道都证明定向进化技术对
于提高酶的催化活性起到了很好的效果。 Shim
等 [ 31 ]采用定点突变技术构建的突变体 ,改变了位
于酶活性中心的“蛋白 2S2结合 ”口袋中 M et2317,并
突变为 A la,从而有利于底物范围的扩大 ,实际也
证明其具有更高的催化磷酸二脂键的催化能力。
淀粉蔗糖酶是一种催化蔗糖而得到的直链淀粉
酶 ,但是由于它直接催化蔗糖的活性较低 ,使其的
应用受到很大的限制。Potocki2Veronese等 [ 32 ]利用
易错 PCR和 DNA Shuffling技术对其进行突变 ,得
到催化蔗糖活性提高 60%的突变体 A sn387A sp ,
从而扩大其应用范围 ,在实际生产中具有重要
意义。
3. 2　提高酶的稳定性
提高或改变蛋白特性另一个重要的方面就是提
高热稳定性 ,因为这是在工业生产中运用酶催化反
应而经常遇到的难题 ,为了解决这一问题 ,众多科学
家采用定向进化的方法改造蛋白 ,期望提高其热稳
定性。Xiao等 [ 33 ]运用序列比对的结果为指导 ,进行
定点突变 ,得到突变体的 Tm值提高了 6℃,同时在
不影响原有催化活性的基础上 ,在 45℃时的半衰期
比原酶提高了 23倍之多。M iyazaki等 [ 34 ]为了适应
生产化需要 ,综合了随机突变、定点饱和突变和
DNA shuffling的方法 ,将 11家族木聚糖酶进行改
造以提高其热稳定性。最终得到的突变体的半热
变性温度从 58℃提高到 68℃,最适温度也从 55℃
升到了 65℃, 同时在 60℃的热稳定性也明显
增强。
另外 ,蛋白经常会在有机溶剂和水 2有机溶剂混
合溶液中失去原有的催化活性 ,所以 Moore等 [ 35, 36 ]
进行了随机突变 ,从枯草芽孢杆菌蛋白 E的突变体
库中筛选出一株能够在 60%二甲基甲酰胺溶液中
具有和在水溶液中相等的酶活 ;同样 ,通过随机突变
和基因重组将 p2硝基苯酯酶在 30%二甲基甲酰胺
水溶液中的酶活提高了 100倍以上。
3. 3　改变酶的底物特异性
Manu等 [ 37 ]通过对纤维二糖磷酸化酶 ( CP)进
行易错 PCR筛选 ,得到的突变株作用底物从传统的
纤维二糖转变成了乳糖 ,随即提高了乳糖磷酸化酶
的活性。最终得到的突变体菌株的乳糖磷酸化酶的
活性比原酶高出了 10倍。
3. 4　改变对映异构体特异性
Schm idt等 [ 38 ] 选用易错 PCR 技术将来源于
Pseudom onas fluorescens酯酶的对应选择性野生型的
E值从 63提高至 96,同时活性也相应的增加了 ,能
够达到 2 m in转化 50%的底物 ,相当于 1. 25 U /mg
的蛋白量。A rnold等 [ 39 ]运用易错 PCR和饱和诱变
的方法 ,成功地使一株倾向于 D2型底物的乙内酰脲
酶发生转变 ,使之变为倾向于 L2型底物 ,经过分析
这种转变只生发了一个氨基酸的替换。与野生型的
64
© 1994-2011 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
2009年第 11期 苏怡丹等 :蛋白质定向进化技术的研究进展
催化蛋白相比 ,增加了 L2甲硫氨酸的产量 ,降低了
不必要的产物积累。
4　总结
目前 ,定点突变技术发展的日趋成熟 ,在农牧
业、医药工程以及环境保护方面的应用也日趋广泛 ,
并产生了巨大的影响。随着结构生物学和生物信息
学的发展 ,越来越多的焦点集中到基于理性设计的
蛋白改造 ,所以了解蛋白本身的结构与功能的关系、
相互作用显得尤为重要。同时 ,快速、有效的筛选办
法也是定向进化成功不可或缺的关键。
参 考 文 献
1　 Campbell JH, Lengyel JA, Langridge J. Natl Acad Sci USA, 1973,
70 (6) : 1841～1845.
2　 L ingMM, Robinson BH. Anal B iochem, 1997 , 254 (2) : 157～178.
3　 Hutschison CA, Philipp s S, et al. J B iol Chem, 1978, 253 ( 18 ) :
6551～6560.
4　 Kegler2Ebo D, Pollack G, D iMaio D, Totoua: Humana Press,
1996, 57: 297～310.
5　 Zheng L, Baumann U, Reymond JL. Nucleic Acids Res, 2004, 32
(14) : 115.
6　 ReetzMT, Bocola M, Carballeira JD, et al. Angew Chem Int Ed En2
gl, 2005, 27 (44) : 4192～4198.
7　 Baldwin AJ, Busse K, et al. Nucleic Acids Res, 2008, 36 (13) : 77.
8　 Murakam i H, Hohsaka T. et al. Nucleic Acids Symp Ser, 2000,
(44) : 69～70.
9　 Wong TS, Tee KL, et al. Nucleic Acids Res, 2004, 32 (3) : 26.
10　Wong TS, Roccatano D, et al. B iotechnol J, 2008, 3 (1) : 74～82.
11　StemmerW P. Nature, 1994, 370 (6488) : 389～391.
12　Chang CC, Chen TT , Cox BW , et al . Nat B iotechnol, 1999, 17
(8) : 793～797.
13　LászlóPatthy. Gene, 1999, 238 (1) : 103～114
14　Crameri A, Raillard SA, Bermudez E, et al. Nature, 1998, 391
(6664) : 288～291.
15　Zhao H, Giver L, Shao Z, et al. Nat B iochnol, 1998, 16 (3) : 258～
261.
16　Pelletier JN. Nat B iotechnol, 2001, 19 (4) : 314～315.
17　Zha D, Eipper A, ReetzMT. Chembiochem, 2003, 4 (1) : 34～39.
18　Jae Kwang Song, et al. App lied and Environmental M icrobiology,
2002, 68 (12) : 6146～6151.
19　Fujii R. Nucleic Acids Res, 2006, 34 (4) : 30.
20　Shao Z, Zhao H, Giver L, A rnold FH. Nucleic Acids Research,
1998, 26 (2) : 681～683.
21　Kitamura1 K, et al. Protein Engineering, 2002, 15 (10) : . 843～853,
22　Ness JE, Kim S, Gottman A, et al. Nat B iotechnol, 2002, 20 (12) :
1251～1255.
23　Andrew UK, et al. Methods in Molecular B iology, 2003, 231: 153
～163.
24　Lutz S, O stermeierM, et al. Proc Natl Acad Sci USA, 2001, 29 (4) :
16.
25　B ittker JA, Le BV, et al. PNAS, 2004, 101 (18) : 7011～7016.
26　Yuan L, et al. M icrobiology and Molecular B iology Reviews, 2005,
63 (3) : 373～392.
27　M iyazaki K, Takenouchi M, et al. J B iol Chem, 2006, 281 ( 15 ) :
10236～10242.
28　A rnold FH, Georgiou G, D irected Enzyme Evolution: Screening and
Selection Methods (Methods in Molecular B iology) . Humana Press,
2003.
29　Aharoni A , Griffiths AD , Tawfik DS. Curr Op in Chem B iol , 2005 ,
9 (2) : 210～216.
30　O lsen M, Iverson B, Georgiou G. Curr Op in B iotechnol, 2000, 11
(4) : 331～337.
31　Shim H, et al. J B iol Chem, 1998, 273 (28) : 17445～17450.
32　Potocki2Veronese, et al. J B iomol Screen, 2007, 12 (5) : 715～723.
33　Xiao ZZ, et al. App lied and Environmantal Mcirobiology, 2008, 74
(4) : 1183～1189.
34　M iyazaki K, et al. The Journal of B iological Chem istry, 2006, 281
(15) : 10236～10242.
35　Moore JC, A rnold FH. Natl B iotechnol, 1996, 14 (4) : 458～467.
36　Moore JC, J in HM, et al. J Mol B iol, 1997, 272 (3) : 336～347.
37　Manu RM, et al. Protein Engineering, Design & Selection, 2009, 22
(7) : 393～399.
38　Chm idt M, Hasenpusch D, Kahler M, et al. Chembiochem, 2006, 7
(5) : 805～809.
39　May O, Nguyen PT, A rnold FH, et al. Nat biotechnol, 2000, 18
(3) : 317～320.
74
© 1994-2011 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net