全 文 ：Sep．2008
· 68·
生物加工过程
ChineseJoumalofBioprocessEngineering
第6卷第5期
2008年9月
Ⅳ一乙酰氨基苯磺酰氟用于柱前衍生氨基酸的
毛细管胶束电动色谱分离
葛佳璐1，屠春燕1，赵 琚1，唐美华1，吴燕娇1，韦萍1，李寿椿2
(1．南京工业大学制药与生命科学学院，南京210009；
2．南京中意化工技术开发研究所，南京210037)
摘要：采用一种新型标记试剂N一乙酰氨基苯磺酰氟(PAABS．F)作为柱前衍生试剂，建立了用毛细管胶束电动色
谱分离16种常见氨基酸的方法。以硼砂．三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)二元缓冲体系为背景电解液，考察了缓冲液
的pH和离子强度、表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS)添加量、有机改性剂种类及分离电压等条件对分离效果的影
响，实验结果表明：采用40mmol／L硼砂-Tris(摩尔比l：1)缓冲液(pH9．3)、添加140mmoL／L的SDS、体积分数5％
甲醇及10mmoL／L三乙胺作为分离体系，可对16种PAABS．F氨基酸衍生物进行分离。
关键词：毛细管胶束电动色谱；氨基酸；时乙酰氨基苯磺酰氟；衍生化
中图分类号：0657．8 文献标志码：A 文章编号：1672—3678(2008)05—0068—05
Separationofaminoacidsbymicellarcapillaryelectrokineticchromatography
usingN-acetamidobenzenesulfonylfluoridea pre-co umnderivativereagent
GEJia—lul，TUChun．yanl，ZHAOJunl，TANGMei．hual，WUYan-jia01，WEIPin91，LIShou．chun2
(1．CollegeofLifeScienceandPharmaceuticalEngineering，NanjingUniversityofTechnology，Nanjing210009，China；
2．Sino-ItalianRese rchInstituteofNanjingforChemicalTechnologyDevelopment，Nanjing210037，China)
Abstract：Amethodf rseparatingsixteencommonaminoacidsbymicellarcapillaryelectrokineticchro—
matographyisusedbyusingN-acetamidobenzenesulfonylfluorideaspre—columnultravioletlabelinglea—
gent．Sodiumdodecylsu fateconcentrations，organicmodifiersandpHintherunningbufferconsistedof
sodiumtetraborate—Trisw reoptimizedforfastandefficients paration．Experimentalresultsshowedthat
40mmoL／Lsodiumborate—Tris(1：1)，pH9．3，140mmol／Lsodiumdodecylsu fate，5％methanol，
and10mmol／Ltri—ethylaminewerethoptimalconditions．Undertheoptimalconditions，sixteentom—
nonaminoacidsweresuccessfullyseparated．
Keywords：micellarelectrokineticcapillaryhromatography；aminoacid；N—acetamidobenzenesulfonyl
fluoride；derivation
氨基酸是生命有机体的重要组成部分，其分离
分析在生化、食品等领域都具有重要意义。近年
来，毛细管电泳以其分析效率高、速度快、能耗小、
成本低等特点成为解决氨基酸分离分析的关键技
术¨-3]。由于大多数氨基酸无紫外吸收，需要对其
进行柱前或柱后衍生化反应后测定，而目前广泛使
用的各种氨基酸衍生化试剂或多或少存在着不同
的缺陷⋯，如衍生过程的重现性差，衍生条件苛刻、
收稿日期：2007．12-05
作者简介：葛佳璐(1983一)，女，江苏南京人．硕士研究生．研究方向：仪器分析。
联系人：屠春燕．副研究员，E-mail：tcy7341@126．corn
万方数据
2008年9月葛佳璐等：Ⅳ．乙酰氨基苯磺酰氟用于柱前衍生氨基酸的毛细管胶束电动色谱分离 ·69·
或过量的衍生试剂放置过程中会严重干扰其他衍
生组分的测定等，因此寻找新的衍生化试剂具有十
分重要的意义。
本文以Ⅳ．乙酰氨基苯磺酰氟(PAABS．F)作为
柱前衍生试剂，在乙醇溶液中衍生可获得较稳定的
紫外检测产物，衍生条件温和，操作简便。实验在
胶束电动色谱(MEKC)模式下考察并优化了氨基酸
衍生物的分离条件，实现了对16种氨基酸衍生物的
基线分离。
1实验部分
1．1仪器和试剂
WACEMDQ高效毛细管电泳仪(美国Beck．
man--Coulter有限公司)，石英未涂层毛细管(河北
永年光导纤维厂)，MILLIPORE超纯水制造系统
(美国MiUipore公司)，720ApH计(美国Thermo有
限公司)。
对乙酰氨基苯磺酰氟(PAABS—F，江苏中意化工
研究所提供，商品名为SINORO-4A)，氨基酸对照品
(上海惠兴生化试剂公司)，甲醇和乙醇色谱纯；硼
砂，三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)，十二烷基硫酸钠
(SDS)和三乙胺等试剂均为分析纯。
1．2实验方法
1．2．1电解液的配制
在不同离子强度的硼砂一Tris缓冲溶液中加入
不同浓度的SDS、甲醇及三乙胺，配制成分离用电解
液。用0．45“m的滤膜过滤备用，实验前超声脱气
10min。
1．2．2毛细管处理
毛细管(75斗m×60cm，有效长度为50em)第
一次使用前依次用甲醇、超纯水、0．1mol／L盐酸、
超纯水、0．1mol／LNaOH、超纯水分别冲洗10rain，
予以活化。每天进样前依次用0．1mol／LNaOH、超
纯水和电解液冲洗毛细管5rain；两次运行间用电解
液冲洗3rain。
1．2．3氨基酸的衍生化
准确称取16种氨基酸，用硼砂缓冲液(40
mmolfL，pH9．3)配制成总浓度为50mmol／L氨基
酸储备液；将PAABS—F配制成浓度为50mmol／L的
乙醇溶液，以适量体积比将氨基酸储备液与衍生剂
混合，70℃水浴衍生反应30min，用硼砂缓冲液稀
释，进样前用0．45“m的滤膜过滤。
1．2．4色谱条件
用1．2．1配制的电解液分离氨基酸衍生物，分
离电压22kV，气压进样3．45MPa×5s，分离时间
30rain，检测波长260am，分离温度为25℃，结果如
图1所示。
12
lO
毒8
晷s
望4
臣2
O
￡(迁移)／min
l一杂质峰；2一酪氨酸(Tyr)；3一组氨酸(His)；4一缬氨酸
(Val)；5一苏氨酸(Thr)；6一甲硫氨酸(Met)；7一异亮氨酸
(1ie)；8一脯氨酸(Pro)；9一赖氨酸(Lys)；10一丙氨酸(Ala)；
1l一丝氨酸(Ser)；12一苯丙氨酸(Phe)；13一色氨酸(Trp)；
14一甘氨酸(Gly)；15一精氨酸(Arg)；16一对乙酰氨基苯磺酸
(PAABS．OH)；17一天冬氨酸(Asp)；18一谷氨酸(Glu)
图l 16种标准氨基酸的电泳图
Fig．1Electrophoregramof16standardaminoacids
2结果与讨论
2．1衍生机理
对同一批次衍生剂的衍生效果进行考察，其相
对标准偏差为3．3％，衍生剂稳定性良好。
衍生化反应如下：
N．HCOCH3
@
R
+H，N—CH—COO。
硼砂缓冲液pH=9．3r；
NHCOCH，
尚 +HFV
SO，OH
2．2缓冲液的影响
2．2．1缓冲液种类的影响
通过对分离条件的系统考察，发现缓冲液的种
类是影响氨基酸衍生物分离的重要因素。用单一
的硼砂缓冲体系，衍生产物峰集中在一个较小的区
间内，且不少峰出现重叠，分离度不佳，重现性差。
因此，实验着重考察了二元缓冲体系。Tris一硼砂二
39=
P液冲缓
F
眇
吨
硼SlI
万方数据
· 70· 生物加工过程 第6卷第5期
元缓冲体系可以使分析窗口扩大，缓冲容量增大，
且在较高浓度下亦不会产生过大电流，对未知物的
干扰影pad,。实验证明，加入Tris后衍生产物分离
度有所改善，可能是由于和部分氨基酸衍生物形成
离子对，从而使迁移率有所扩大∞J。体系中，基线
平稳，出峰快，峰形好，信号灵敏度高。
2．2．2电解质溶液浓度的影响
电解质溶液浓度对柱效及迁移时间的影响比
较复杂，相关性较差。适当增加缓冲液浓度，将压
缩毛细管内壁的双电层，能有效地降低电渗流
(EOF)，延长迁移时间，使得各组分在迁移率E的
微小差异扩大，从而改善分离效果；同时高浓度缓
冲液将产生较大的热量，降低柱效。实验考察了不
同浓度的硼砂一Tris溶液(pH9．3，含120mmol／L
SDS及体积分数5％甲醇)对迁移时间较为集中的
几种氨基酸衍生物(图l中的第4～第9种氨基酸)
的分离影响，最终选择Tris一硼砂的浓度
为40mmol／L。
2．2．3缓冲液pH的影响
缓冲液pH除控制弱电解质的有效淌度外，还
控制着电渗甚至样品在管壁上的吸附水平№J。实
验在硼砂一Tris缓冲液的有效缓冲范围内研究了pH
变化对分离的影响，如图2(图中序号同图l所示)。
当pH9．3时，各种氨基酸衍生物电泳迁移率的差异
过小，导致组分峰重叠严重；当pH9．6时，缓冲液中
OH一浓度急剧增加，电流增大，放热效应使分离效
率反而下降。
2．3 表面活性剂浓度的影响
毛细管胶束电动色谱是分离氨基酸常用的一
种分离模式，通过加入阴离子表面活性剂，作用于
疏水性不同的各个样品，所形成的准固定相的分配
作用可改变氨基酸的选择性。或通过离子相互作
用吸附于毛细管表面，对毛细管内壁进行改性，从
而改变了电渗流，减少管壁对溶质的吸附，达到改
进分离度的目的一J。实验选择了迁移时间接近的9
种氨基酸，在40mmol／L硼砂一Tris缓冲液(pH9．3，
含体积分数5％甲醇)中，考察了不同浓度的SDS添
加量对分离效果的影响，结果证明当SDS量为
140mmol／L时，整体分离效果较好(图3)。此外还
发现，SDS对色氨酸和精氨酸的迁移时间影响较大，
随着SDS浓度增加，二者出峰时间在整个出峰顺序
中提前。
．量
昌
X
：蹬
崩
i
12 13 14 15
t／rain
8+9
10 11 12 13 14
t／rain
图2 pH对分离的影响
Fig．2TheffectofpHonseparation．
c(SDS)／(mmol‘L“)
—1卜Met—*一Leu—*一Pro—●一Ala+ser—Try+Phe
图3 SDS浓度对迁移时间的影响
Fig．3TheffectofSDSconcentrationonm grationtime
2．4添加剂种类及含量的影响
缓冲溶液中加入有机溶剂，可以影响介质的粘
度、介电常数、双电层结构等，进而影响EOF的大小
万方数据
2008年9月葛佳璐等：Ⅳ-乙酰氨基苯磺酰氟用于柱前衍生氨基酸的毛细管胶束电动色谱分离 ·7l·
及各种物质的迁移行为，以达到优化分离、改善峰
形和提高检测灵敏度的目的。8o。比较甲醇、乙腈、
丙酬及三乙胺等添加剂对分离的影响，结果发现乙
腈和丙酮对分离选择性没有明显作用，而甲醇和三
乙胺的协同效应可有效地改善分离度。
2．4．1甲醇含量的影响
低含量的甲醇对分离度略有提高，这可能是因
为加入甲醇增加了样品在缓冲溶液中的溶解度，使
分离度增高；高含量的甲醇削弱了样品分子与表面
活性剂的作用，使分离度降低，应控制在5％左右为
佳。随着有机溶剂在缓冲溶液中比例的增加，虽然
基线噪音降低，但导致出峰时间逐渐延长(如图4，
电解液为：40mmol／L硼砂．Tris，pH9．23，添加
140mmol／LSDS)。
O 1 2 3 4 5 6 7 8
驴(甲醇)／e
—●一Thr—{卜Val—■r—Mel—÷}一lie
—弓卜Pro——·一Ala——+-一Ser——I—Phe
图4 甲醇含量对迁移时间的影响
Fig．4TheffectofMethanolonmigrationtime
2．4．2三乙胺浓度变化的影响
实验中发现胺类添加剂如三乙胺对氨基酸衍生物
的分离选择I生也有一定的影响，加入5mmol／L三乙胺
后基线平稳，噪音低，分离时间明显缩短，峰型佳，响应
高。随着三乙胺浓度增加至10nunol／L，体系分离度变
大，峰高增加，但随着离子浓度加大，电流增大，焦耳热
效应使基线噪音也随之增加，影响分离效果。
2．4．3甲醇和三乙胺的共同影响
考虑同时添加甲醇和三乙胺两种添加剂，通过不
同的配比实验发现，甲醇的体积分数增加，使分离时
间变长，有利于11e和Pro的分离，但Lys随甲醇含量
不同出峰位置变化较大，且易与Met，lie重叠在一起；
三乙胺浓度增大有利于Val与Thr的分离，但过大则
使Ile和Pro重叠，(如图5，电解液为：40mmol／L硼
砂．Tris(pH9．23)+140mmol／LSDS)。
2．5电压的影响
随着操作电压的增加，迁移时间缩短，但过高
12．0
11．5
：蹬11．0
崩
10．5
图5 甲醇和三乙胺对迁移时间的共同影响
Fig．5TheffectofMethanolandTri—ethylamine
Oilmigrationtime
会使柱内的热量增加，柱效反而下降，基线噪音明
显增加‘9|。电压由25kV降为22kV后，发现分离
度稍有改善，特别是脯氨酸和赖氨酸的衍生产物
峰，继续降低电压，由于迁移时间延长，使得峰形展
宽，检测灵敏度下降，因此综合考虑迁移时间和分
离度，选择分离电压为22kV。
2．6样品分析
将适量绿豆蛋白水解液与衍生剂以一定体积
混合，衍生条件见1．2．3，色谱条件见1．2．4，分离结
果见图6。
jt镫
__JI⋯I?U
8 lO121416 18202224262830
t／min
l一杂质峰；2一组氨酸(His)；3一缬氨酸(Val)；4一苏氨酸
(Thr)；5一异亮氨酸(1ie)；6一脯氨酸(Pro)；7一赖氨酸(Lys)；
8一丙氨酸(Ala)；9一丝氨酸(Ser)；lO一苯丙氨酸(Phe)；ll一
色氨酸(Trp)；12一甘氨酸(Gly)；13一精氩酸(Arg)；14一对乙
酰氨基苯磺酸(PAABS．OH)；15一谷氨酸(Glu)
图6绿豆蛋白水解液中氨基酸的电泳图
Fig．6Electrophoregramofaminoacidsin
hydrolysateofmungbean
3结论
通过对分离条件的考察优化，发现缓冲液的组
成、浓度及有机添加剂的含量是影响氨基酸衍生物
彩
5
5
5
5
5
5
3
2
l
O
9
8
uIE，(漤壬f)7
万方数据
· 72· 生物加工过程 第6卷第5期
分离的重要因素。以40mmoL／L硼砂-Tris缓冲液
(pH9．3，含140mmol／L的SDS、体积分数5％甲醇
及10mmoL／L的三乙胺)为分离电解液，分离温度
25℃，分离电压22kV，实现了对16种PAABS·F氨
基酸衍生物的同时分离(图1)。对照文献[10]中
的分离结果，发现在本实验的优化条件下，分离效
果有所提高。采用此方法完成了绿豆蛋白水解液
中主要氨基酸的检测，该方法简便快速，节省试剂，
具有一定的实用性。
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