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Study on fed-batch fermentation conditons of L-glutamic acid

L-谷氨酸补料分批发酵的研究



全 文 :第9卷第5期
2011年9月
生 物 加 工 过 程
ChineseJournalofBioprocessEngineering
Vol.9No.5
Sep.2011
doi:10.3969/j.issn.1672-3678.2011.05.006
收稿日期:2011-03-01
基金项目:国家高技术研究发展计划(863计划)资助项目(2006AA020301)
作者简介:卢宗梅(1970—),女,安徽蚌埠人,工程硕士,工程师,研究方向:发酵工程;张伟国(联系人),教授,Email:zhangwg168@126.com
L 谷氨酸补料分批发酵的研究
卢宗梅1,康传利2,张伟国2
(1.中粮生物化学(安徽)股份有限公司,蚌埠 233010;
2.江南大学 工业生物技术教育部重点实验室,无锡 214122)
摘 要:对谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)HCJ46产L谷氨酸的补料分批发酵条件进行研究。结果表
明:最适初糖质量浓度和最佳残糖维持质量浓度分别为100和(10~20)g/L;对发酵控温方式进行研究,确定了最
佳温度控制策略为0~8h维持32℃、8~16h维持34℃、16~32h维持36℃,同时发现相对溶氧控制在30%左右
时产酸最高。在以上的优化条件下,L谷氨酸产量从72g/L提高到95g/L,提高了319%。
关键词:溶氧;分批补料;L谷氨酸;温度
中图分类号:TQ922    文献标志码:A    文章编号:1672-3678(2011)05-0027-05
StudyonfedbatchfermentationconditonsofLglutamicacid
LUZongmei1,KANGChuanli2,ZHANGWeiguo2
(1.COFCOBiochemical(Anhui)Co.,Ltd.,Bengbu233010,China;
2.KeyLaboratoryofIndustrialBiotechnologyofMinistryofEducation,JiangnanUniversity,Wuxi214122,China)
Abstract:FedbatchfermentationconditionsofCorynebacteriumglutamicumHCJ46forLglutamicacid
productionwerestudied.Itwasfoundthattheoptimalinitialglucoseconcentrationandmaintainedresid
ualsugarconcentrationwere100g/L,and10-20g/L,respectively.Thefermentationtemperaturecon
trolmodewasfurtherinvestigated.Resultsshowedthattheoptimalcontrolstrategywascontroledas
0-8hat32℃,8-16hat34℃,and16-32hat36℃.Itwasalsofoundthatthehighestglutamic
acidproductivitywasobtainedwhenthedissolvedoxygenwascontroledat30%.Asaresult,underthe
optimizationoffermentationconditions,Lglutamicacidproductivityincreasedfrom72g/Lto95g/L,
improvedby29%.
Keywords:dissolvedoxygen;fedbatch;Lglutamicacid;temperature
  目前,我国的味精相关产品发展迅速,产量高
居世界首位,但味精年人均占有量仅为769g[1]。因
此味精发酵生产还有很大的发展空间,而提高谷氨
酸产生菌的产酸水平和转化率对于降低生产成本
具有重要意义。
  微生物发酵的生产水平除取决于菌种本身的
性能外,还必须给予微生物合适的环境条件才能发
挥和表现出它的优良生产能力。与生产菌种相关
的环境条件,如培养基组成、温度、溶氧及发酵过程
中的补料对菌株生产能力的提高具有重要意义[2]。
采取补料分批发酵是提高产酸的有效措施,可以避
免在分批发酵中因一次投料过多而产生的负面影
\\DZ19\D\孙桂云\生物加工2011\第5期\SW1105.PS 6校样 排版:孙桂云 修改日期:2011/09/28
响,更有利于菌体生长和产酸。在影响细菌生长和
产酸的因素中,温度起着重要作用。为了使微生物
生长最快和产酸率最高,必须根据菌种的特性,选
择和控制最适的温度。产谷氨酸菌是好养菌,供氧
对菌的生长及谷氨酸的积累有很大的影响[3]。本
文中笔者主要从补料分批发酵、溶氧、温度等方面
对发酵条件进行优化,以期确定最佳发酵条件。
1 材料与方法
11 材料与仪器
111 供试菌株
  谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)
HCJ46,江南大学生物工程学院代谢调控与代谢工
程研究室保藏菌种。
112 材料
  葡萄糖(工业级),山东西王生化科技有限公
司;玉米浆,华北制药康欣有限公司;尿素,上海生
化试剂公司;K2HPO4·3H2O(分析纯),上海化学试
剂公司;FeSO4·7H2O、MgSO4·7H2O和MnSO4·4H2O
(分析纯),上海试剂二厂。
113 培养基
  完全培养基(g/L):葡萄糖 5,牛肉膏 10,蛋白
胨 10,酵母膏 5,NaCl5,琼脂 20。
  种子培养基(g/L):葡萄糖 25,K2HPO4·3H2O
15,MgSO4·7H2O04,玉米浆 35,尿素5(分消加
入)。
  发酵培养基(g/L):葡萄糖160,K2HPO4·3H2O
20,MgSO4·7H2O08,玉米浆30,尿素55(分消
加入)。
  所有培养基调 pH70~72,种子培养基和完
全培养基在01MPa下灭菌20min,发酵培养基在
007MPa下灭菌15min。
114 仪器与设备
  SBA40C生物传感分析仪,山东省科学院生物研
究所;立式圆形压力蒸汽灭菌器,上海医用核子仪器
有限公司;UV2100可见紫外分光光度计,上海尤尼
克有限公司;PHS3C型精密pH计,上海雷磁仪器厂;
7L发酵罐,高百特发酵机(上海)有限公司。
12 方法
121 平板活化培养
  在32℃培养20~24h。
122 种子培养
  500mL三角瓶中装液量100mL,两层绒布封
口,于摇床上80r/min、32℃振荡培养75h。
123 7L发酵罐分批发酵
  发酵罐中装液量 35L,接种量 8%,通风
2L/min,流加氨水控制 pH70~72,通过流加泡
敌消泡,发酵过程中视残糖情况补加800g/L的糖
溶液。根据溶氧需求调节转速,发酵周期32h。
124 pH的测定
  国产精密 pH试纸和 PHS3C型精密 pH计
测定。
125 OD的测定
  取02mL的发酵液用去离子水稀释25倍后,
用分光光度计于光程1cm、在波长620nm条件下
测量吸光度。
126 还原糖、L谷氨酸及乳酸含量的测定
  采用SBA 40C生物传感分析仪测定。
127 菌体干质量的测定
  取发酵液 10mL于 5000r/min离心分离 10
min,并用蒸馏水洗涤2次,然后置于105℃条件下
干燥至恒质量,从而得到菌体干质量。
2 结果与讨论
21 最适初糖浓度的确定
  在发酵过程中,菌体的生长受到底物浓度的影
响。当培养基中的葡萄糖浓度增加到一定量时,生
长就显示饱和型动力学,若进一步增加葡萄糖浓
度,由于发酵液渗透压过大,就对菌体的生长产生
抑制,导致菌体比增长速率减小,菌密度下降,影响
菌体生长[4]。
  考察不同初糖质量浓度对菌体量及产酸的影
响,发酵过程中随时补加80%的糖溶液,使残糖质
量浓度维持在20g/L左右,结果如图1所示。由图
1可知:当初糖质量浓度低于100g/L时对菌体生长
影响不大。当初糖质量浓度超过100g/L时,初糖
就会对菌体的生长产生抑制作用,并且这种抑制作
用随糖浓度的增大而增大,故初糖为160g/L时菌
体增长最慢,OD达到最大所需时间最长。虽然初
糖浓度不同达到最大菌密度的时间不同,但最大菌
密度(OD)基本接近,这可能由于最大菌密度由生
物素用量决定的缘故。当初糖质量浓度为100g/L
时产酸最高。当初糖质量浓度低于100g/L时,由
于流加糖次数增多,菌体代谢容易受到环境改变的
影响,导致产酸下降。当初糖高于100g/L时,存在
对产酸和菌体生长的抑制,最终产酸也较低。
82 生 物 加 工 过 程   第9卷 
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图1 不同初糖质量浓度下菌体生长及L 谷氨酸
产量的变化曲线
Fig.1 ChangesofcelgrowthandLglutamic
acidproductiononvariousinitial
glucoseconcentrations
  图2为不同初糖质量浓度下菌体比生长速率曲
线。由图2可看出:随着初糖质量浓度的提高,菌体
比生长速率下降,这说明高的初糖质量浓度将显著
影响菌体生长。
图2 初糖质量浓度对菌体比生长速率的影响
Fig.2 Specificgrowthrantesonvariousinitial
glucoseconcentrations
22 最适残糖维持浓度的确定
  控制发酵体系维持在适当的残糖浓度对谷氨
酸发酵来说非常重要,这样可以使菌体有足够但不
过多的养料合成目的产物。如果控制残糖浓度过
低,养料不足以维持细胞正常生理代谢和合成产物
的需要,菌体会过早自溶。如果控制残糖浓度过
高,可能刺激菌体生长,也会产生底物抑制,导致产
酸率的下降[4-5]。
  选择初糖质量浓度为100g/L进行补料分批发
酵,采用脉冲流加方式流加800g/L的糖溶液,将发
酵体系中的残糖分别维持在0~10、10~20、20~30
和30~40g/L这4个水平,考察维持不同残糖浓度
对产酸的影响,结果见图3。
图3 残糖维持质量浓度对产酸的影响
Fig.3 Efectsofresidualglucoseconcentrationon
Lglutamicacidfermentation
  由图3可知:当残糖质量浓度维持在10~20g/L
时,比产酸速率较快,最终产酸高。如果控制残糖浓
度高于此范围,将会引起产酸的下降。而低于此范
围时,由于糖不足以维持菌体代谢的需要产酸也会
下降。因此,确定发酵培养基中维持糖质量浓度为
10~20g/L。
23 控温方式对发酵的影响
  在影响细菌生长和产酸的因素中,温度起着重
要作用。为了使微生物生长最快和产酸率最高,必
须根据菌种的特性,选择和控制最适的温度。如果
温度控制过低,菌体生长慢,酶活低,不利于菌体生
长和产酸。但温度过高易引起细胞内蛋白质变性,
同时也就破坏了酶的活性,从而杀死了微生物[2]。
  主要从以下3种控温方式考察对发酵的影响。
方案 A:0~8h34℃,8~16h37℃,16~30h
39℃。方案B:0~8h32℃,8~16h34℃,16~
30h36℃。方案C:发酵过程中一直保持32℃,具
体的发酵结果见表1。
  由表1可知:采用分阶段温控方式B既能保持较
高的发酵强度[2719g/(L·h)],又能得到较大的转
化率(62%),结果能够获得较高的产量(87g/L)。
L谷氨酸产量比温控方式A和C分别提高了609%
和115%。采用温控方式B可实现 L 谷氨酸发酵
高产量、高产率和高生产强度的统一。
92 第5期 卢宗梅等:L谷氨酸补料分批发酵的研究
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表1 控温方式对L 谷氨酸分批发酵过程参数的影响
Table1 Comparisonoffermentationparametersunder
varioustemperaturecontrolmodes
参数
温控方式
A B C
ρ(起始葡萄糖)/(g·L-1) 102 98 99
发酵周期/h 34 32 36
ρ(残糖)/(g·L-1) 4 5 3
最大菌密度OD620 105 117 118
ρ(L Glu)/(g·L-1) 82 87 78
葡萄糖消耗速率/(g·L-1·h-1) 4418 4385 4131
转化率/% 58 62 59
生产强度/(g·L-1·h-1) 2563 2719 2438
24 溶氧水平对产酸的影响
  产谷氨酸菌是好氧菌,溶氧对菌的生长及谷氨
酸的积累有很大的影响,供氧量是否合适决定整个
发酵的成败[3,5-12]。谷氨酸发酵包括菌体生长和产
物积累两个方面,无论是菌体生长还是产物积累阶
段都应把溶氧控制在适宜的范围内,从而获得比较
大的产酸率和糖酸转化率。发酵前期是菌体耗氧
最大的时期,若溶氧控制过低,菌体不能完全转型,
导致代谢途径改变,造成乳酸等其他代谢产物的积
累。若溶氧控制过高,菌体的生长就会受到高氧抑
制,并且后期菌体易衰老自溶,导致发酵后劲不足。
产酸期溶氧水平控制过低,TCA循环跟不上糖酵解
的速率,导致乳酸等代谢产物的积累。若溶氧水平
控制过高,会导致谷氨酸脱氢酶酶活下降,TCA循
环得到加强,大量生成 CO2,造成 C源的损失,不利
于产酸[13-14]。考察相对溶氧在20%、30%和40%
这3个水平下对发酵的影响,结果见图4。
图4 溶氧水平对发酵的影响
Fig.4 Efectsofdissolvedoxygenonfermentation
ofLglutamicacid
  由图4可知:当相对溶氧控制在30%左右时,
发酵过程中耗糖快(476g/(L·h)),产酸快(297
g/(L·h)),最终产酸高(95g/L)。溶氧控制过高或
过低都不利于产酸。
25 发酵条件优化前后比较
  发酵条件优化前后各参数比较如表2所示。由
表2可知:通过各种条件优化,使菌体既能保持较高
的发酵强度(297g/(L·h)),同时又能保持较高的糖
耗速率(476g/(L·h)),结果在较短的时间内(32h)
达到较高的产酸水平95g/L,比优化前 72g/L提高
了319%。根据优化的实验条件,进行发酵产酸,结
果见图5。由图5可知:0~8h为菌体快速生长期,
8~12h菌体生长速率降低,12h后菌浓变化不大,发
酵后期由于补糖菌浓稍微下降。而对产酸来说,6h
后即进入产酸期,8~20h菌体活力强,产酸快,产酸
速率为383g/(L·h),20h后菌体活力有所下降,产
酸速率为25g/(L·h),较优化前有较大提高。
表2 发酵条件优化前后各参数的比较
Table2 Comparisonoffermentationparametrersbefore
andafteroptimization
参数 优化前 优化后
发酵周期/h 36 32
最大菌密度OD620 095 108
ρ(L Glu)/(g·L-1) 72 95
转化率/% 568 624
葡萄糖消耗速率/(g·L-1·h-1) 352 476
生产强度/(g·L-1·h-1) 200 297
图5 优化后发酵过程曲线
Fig.5 Comparisonoffermentationbeforeand
afteroptimization
3 结论
  用江南大学生物工程学院代谢调控与代谢工程
研究室保藏菌株,经补料分批发酵优化,确定了最适
03 生 物 加 工 过 程   第9卷 
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初糖质量浓度为100g/L,最佳残糖维持质量浓度为
10~20g/L,在这种条件下,既解决了高初糖对菌体
生长的抑制作用,又能使整个发酵过程保持较高的产
酸速率。对发酵过程中不同控温方式进行了研究,发
现了最佳的温控方式(0~8h32℃,8~16h34℃,
16~32h36℃)。研究了不同溶氧控制水平对产酸
的影响,确定了相对溶氧控制在30%左右最佳。通
过这几个条件优化,使产酸量从 72g/L提高到
95g/L,使产酸量提高了319%。
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317322.
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