全 文 ：第 35 卷第 13 期
2015年 7月
生 态 学 报
ACTA ECOLOGICA SINICA
Vol.35,No.13
Jul.,2015
http: / / www.ecologica.cn
基金项目:国家自然科学基金(U1204301, 31170488); 河南省教育厅科学技术研究重点项目(12A210019); 河南省高等学校青年骨干教师资助
项目(2012GGJS166)
收稿日期:2014鄄06鄄17; 摇 摇 网络出版日期:2015鄄01鄄27
*通讯作者 Corresponding author.E鄄mail: hnzhaolongfei@ 163.com
DOI: 10.5846 / stxb201406171262
赵龙飞, 徐亚军, 曹冬建, 李源, 厉静杰, 吕佳萌, 朱自亿, 秦珊珊,贺学礼.溶磷性大豆根瘤内生菌的筛选、抗性及系统发育和促生.生态学报,
2015,35(13):4425鄄4435.
Zhao L F, Xu Y J, Cao D J, Li Y, Li J J, L俟 J M, Zhu Z Y, Qin S S, He X L.Screening, resistance, phylogeny and growth promoting of phosphorus
solubilizing bacteria isolated from soybean root nodules.Acta Ecologica Sinica,2015,35(13):4425鄄4435.
溶磷性大豆根瘤内生菌的筛选、抗性及系统发育和
促生
赵龙飞1,*, 徐亚军1, 曹冬建1, 李摇 源1, 厉静杰1, 吕佳萌1, 朱自亿1, 秦珊珊1,
贺学礼2
1 商丘师范学院生命科学学院, 河南省高校植物与微生物互作重点实验室, 商丘摇 476000
2 河北大学生命科学学院, 保定摇 071002
摘要:对采自河南省不同地区的大豆根瘤进行内生菌分离纯化、溶磷性筛选试验。 根据能否产生溶磷圈及溶磷圈直径(D)、菌
落直径(d)和 D / d值大小确定菌株溶磷能力,采用钼锑抗比色法测定培养液中有效磷含量;平板筛选法对筛选菌株进行耐盐
性、耐酸碱、重金属等抗性测定,并对筛选菌株进行理化特性、16S rDNA、recA 序列和系统发育分析。 结果表明,从分离纯化的
324株内生菌中筛选出 36株具有溶磷特性,其中 20株有较强溶磷性。 菌株 DD291发酵液中可溶性磷含量最高(452 mg / L),发
酵液 pH与对照相比均有不同程度下降,最大降幅达 2.92。 大部分溶磷性内生菌具有较强耐盐碱性,对 Pb2+、Cr6+和 Cu2+有较高
耐受性,对 Ni2+和 Hg2+抗性较弱。 结合细胞形态、生理生化、16S rDNA、recA 序列和系统发育分析结果,菌株确定为 Bacillus
cereus, Enterobacter cancerogenus, E. cloacae和 Pseudomonas putida。 部分溶磷菌株对大豆的生长有促进作用,显示出潜在的应用
前景。
关键词:大豆; 根瘤内生菌; 溶磷性; 筛选; 抗性; 系统发育分析
Screening, resistance, phylogeny and growth promoting of phosphorus
solubilizing bacteria isolated from soybean root nodules
ZHAO Longfei1,*, XU Yajun1, CAO Dongjian1, LI Yuan1, LI Jingjie1, L譈 Jiameng1, ZHU Ziyi1, QIN Shanshan1,
HE Xueli2
1 Key Laboratory of Plant鄄Microbe Interactions of Henan, College of Life Science, Shangqiu Normal University, Shangqiu 476000, China
2 College of Life Science, Hebei University, Baoding 071002, China
Abstract: Endophytes were isolated from soybean nodules collected from different regions of Henan province, and
phosphorus dissolving experiments were performed on the purified strains. The ability of strains to dissolve phosphorus were
primarily determined based on whether it can produce dissolved phosphorus halo, the diameter of the dissolved phosphorus
halo (D), the diameter of the colonies (d) and D / d value. The phosphate鄄solubilizing capacity of endophytes was assayed
by molybdenum鄄antimony鄄D鄄iso鄄ascorbic鄄acid鄄colorimetry (MADAC) in inorganic phosphorus liquid culture. Resistances of
the tested strains to such factors as salt, pH and heavy metals were measured through adopting plate screening method.
Physiological and biochemical characteristics, 16S rDNA and recA sequencing, phylogenetic analysis and inoculation tests
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were determined for the strains. Results showed that 36 strains of the 324 isolated endophytes were able to dissolve
phosphorus and 20 strains with stronger phosphate鄄solubilizing capacity (D / d = 1. 218—3. 55) were selected for further
studies. Phosphate鄄solubilizing capacity of strain DD291 during plate screening was maximum (D / d = 3. 55). Soluble
phosphorus content in fermented liquid increased 1—11.9 times compared with that of the control, and among them, such
value of DD291was the highest (452 mg / L), followed by that of DD284. However, all strains had different degree of pH
decline compared with that of the control, and the biggest drop amounted to up to 2.92 units. Soluble phosphorus content
increased, which held certain relevance to lower pH, but soluble phosphorus contents of strains with approximately close pH
values were different. Most of the phosphorus dissolving endophytes had strong saline鄄alkaline tolerances. Some strains can
tolerance and grow on plate containing maximum 8% salt concentration. Under the pH 11, strains DD283 and DD284 never
grew, but DD291 grew well and its growth status was second only to that of control, and the rest 4 isolates ( DD028,
DD140, DD167 and DD186) survived. However, strains can grow under pH 7, second only to control. In the setting range
of heavy metal concentration, only isolate DD283 of seven strains can tolerate five kinds of heavy metal simultaneously,
whereas the remaining six strains can tolerate four different concentrations of heavy metals. In a whole, seven strains showed
higher tolerances to heavy metal ions Pb2+, Cr6+ and Cu2+ under the tested concentrations, while their tolerances to Ni2+ and
Hg2+ were lower. Judged together by their cellular morphological characteristics, physiological and biochemical
characteristics, 16S rDNA and recA sequencing results and phylogenetic analysis, these strains were identified as Bacillus
cereus, Enterobacter cancerogenus, E. cloacae and Pseudomonas putida, respectively. Results of inoculation showed that
shoot height and fresh weight of seedlings inoculated respectively endophytes and Rhizobium increased compared with those
of controls. For Sinorhizobium fredii USDA205T, DD284, DD186 and DD167, seedling height significantly increased by 35.
43%, 35.43%, 27.06% and 29.86%, respectively. Fresh weight of seedling inoculated with S. fredii USDA205T increased
to the maximum extent (104%), DD167 (58. 46%) to the second. However, seedlings inoculated alone with soluble
phosphorus endophytes did not nodule. Screening excellent strains with phosphorus鄄solubilizing ability, salinity tolerance
and metal resistance from microenvironment, analyzing their phylogenetic positions and investigating their growth promotion
effects on host soybean plants provide potential application prospects for the regulation and enhancement of host plants忆
growth environments, which are beneficial for soybean growth.
Key Words: soybean ( Glycine max ); phosphorus dissolving characteristics; root nodules endophytes; screening;
resistance; phylogenetic analysis
磷元素是植物生长发育过程中不可缺少的三大元素之一,土壤中磷素缺乏是限制农业生产的重要因素。
我国有 74%的耕地土壤缺磷,土壤中 95%以上磷为无效磷,施入的磷肥当季利用率仅为 5%—25%,植物吸收
的磷仅有两种可溶性离子形式,即 H2PO
-
4 和 HPO2
-
4 。 大部分磷与土壤 Ca2
+、Fe2+、Fe3+、Al3+结合形成难溶性磷
酸盐[1]。 土壤中具有不同解磷能力的微生物,可依靠自身代谢产物或生物协同作用溶解土壤中难溶性无机
磷,提高土壤磷利用率,在磷素转化中起着重要作用[2]。 近年来研究[3鄄5]表明,植物根际、磷矿区以及特殊生
境中许多溶磷性微生物,也可把磷转化为可吸收状态,开发利用溶磷微生物这一巨大资源宝库,对减少土壤板
结,增强作物抗病力[6],修复盐碱地、重金属污染及保持生态环境有重要作用。 因此,从土壤及植物根际筛选
高效溶磷微生物,研究其溶磷活力是目前研究的热点。
植物内生菌是植物微生态系统的重要组成部分[7],大多数内生细菌是兼性内生[5],可减缓受土著微生物
的影响、解决定殖难等问题。 关于内生菌溶磷问题已有许多报道,如王辰月等[8]从线叶嵩草中分离出枯草芽
孢杆菌 LXAl,对无机磷溶解能力为 28.14 mg / L;冯利利[9]从柠条根系内分离到 4株解磷内生细菌并测定其解
磷能力;郑燕玲等[10]用溶磷圈法从石斛兰中筛选出解磷菌,发现 10株细菌及 2株真菌具解磷能力;黄静等[5]
从油菜和玉米植株中筛选出溶磷性内生菌并研究其遗传多样性,结果表明所有菌株都能从磷酸钙中释放出有
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效磷;张国霞等[11]从普通野生稻中分离 36 株内生菌并测定其溶磷特性,结果表明 21 株菌溶磷能力差异较
大;蒋国彪[12]从小麦中筛选出溶磷内生菌 JG鄄 22 对磷酸钙培养基中磷的溶解能力最强。 这些研究均已证实
从草本、灌木以及作物内可分离筛选出相应溶磷菌株,对缓解宿主植物磷素缺乏提供了宝贵资源。 虽然已有
人对豆科作物特殊生境———大豆根瘤内溶磷性内生菌资源和功能做了研究[13鄄14],但由于地域和大豆品种的
局限性,加之,到目前为止,还未见对河南省不同地区大豆根瘤内生菌进行过研究,鉴于此,本文拟分离、筛选、
鉴定河南省不同地区的大豆根瘤内生菌株,以期发现具有溶磷、抗性和促生的菌株,为根瘤溶磷性内生菌资源
的开发和利用提供资源和科学依据。
1摇 材料与方法
1.1摇 供试菌株
采集河南省不同地区的大豆根瘤,用无菌水清洗后,经无水乙醇处理 20—30 s,3% NaClO处理 3—5 min,
再用无菌水洗涤 5—8次,并以最后一次洗涤的水作为对照,以此验证根瘤表面消毒是否彻底。 用无菌镊子压
迫根瘤,在牛肉膏蛋白胨培养基上划线接种,培养 4—7 d,把形成的单菌落再经划线分离,经镜检获得纯菌株,
把单菌落接种到固体斜面培养基上,28 益培养 3—5 d,短期 4 益低温保藏备用,共获得 324株菌。
1.2摇 培养基
YMA(Yeast Mannitol Agar)培养基[15]、牛肉膏蛋白胨培养基[16]、无机磷液体培养基(National Botanical
Research Institute忆s phosphate growth medium, NBRIP) [11]、无机磷固体培养基(Pikovaskaia忆s, PKO) [5]。
1.3摇 溶磷性测定
1.3.1摇 菌悬液制备
用 YM液体培养基(YMA培养基不加琼脂)培养 24 h 收集菌体。 将菌悬液倒入 2 mL 离心管中,8000 r /
min离心 10 min,用无菌水清洗菌体后再向沉淀中加入无菌水,涡旋振荡制成菌悬液,调节 OD 值为 0.8 (约
108 CFU / mL)以备用。
1.3.2摇 溶磷性大豆根瘤内生菌初筛
采用多点接种法,吸取 100 mL菌悬液加入多点接菌器槽内,接种至预先制备的无机磷培养基平板上,每
个平板接种 5个不同菌样,28 益下培养 4—7 d,观察有无溶磷圈形成,测定溶磷圈直径(D)、菌落直径(d),根
据能否产生溶磷圈和 D / d值大小来判断菌株有无溶磷能力及溶磷能力大小[17]。
1.3.3摇 溶磷性大豆根瘤内生菌复筛
经初筛获溶磷能力较强的菌株,复筛方法同初筛,与初筛的区别是在一个平板内点接同种菌样,每个处理
3次重复。 置于 28 益恒温培养 4—7 d,观察并测定透明圈和菌落直径大小。
1.3.4摇 液体培养基中内生菌的溶磷效果
在盛有无菌 NBRIP 液体培养基的三角瓶中按 2%接菌量接入菌悬液,每株 3 个重复,不接菌的 NBRIP 液
体培养基为对照。 置于 28 益、150 r / min震荡培养 7 d后,将菌液经 8000 r / min 4益 冷冻离心 15 min,取上清
液 1 mL于 100 mL容量瓶中,采用钼锑抗比色法测定培养液中有效磷含量[5];同时取 5 mL 离心后上清液用
pH计测定培养液 pH值。
1.4摇 筛选菌株抗性测定
1.4.1摇 菌株耐盐能力测定
分别配制含 NaCl浓度 4%、5%、6%、7%、8%、9%的 YMA 固体培养基,将筛选菌株接种在不同浓度 NaCl
的 YMA培养基上,其中浓度为 0.01%的 YMA培养基为对照,每一个处理 3次重复。 在 28 益下培养 3—5 d观
察生长情况,生长记为“+冶,不生长记为“-冶。 长势的好坏用“+冶多少表示。
1.4.2摇 耐酸碱能力测定
设置 pH值分别为 5、6、7、8、9、10、11的 YMA培养基,以 pH 值 7 的基础培养基为对照,每个处理 3 次重
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复。 用 1 mol / L的 NaOH或 HCl将 YMA培养基调至设定 pH 值,高温灭菌后再次调节 pH 值至设定值,而后
制成平板。 将筛选菌株接种在不同 pH值的 YMA培养基上,置于 28 益恒温培养,3—5 d后观察生长状况,记
录结果。
1.4.3摇 重金属抗性测定
选取铅、镍、汞、铬、铜的重金属盐母液与 YMA培养基分别湿热灭菌,倒平板前混合均匀,加入 0.5 mmol / L
EDTA,配置最终浓度 Pb2+:2、3、4、5 mmol / L;Ni2+:1.0、1.2、1.4、1.6 mmol / L;Hg2+:0.025、0.05、0.075、0.1 mmol /
L;Cr6+:0.3、0.6、0.9、1.2 mmol / L;Cu2+:0.15、0.35、0.5、0.7、0.9、1.2 mmol / L。 以正常 YMA 培养基为对照,每一
个处理 3次重复。 接种筛选菌株后,置于 28 益恒温培养 3—5 d观察生长状况,记录结果。
1.5摇 溶磷菌株生理生化和细胞形态特征测定
按照东秀珠方法[18],对筛选溶磷菌株进行生理生化特性分析,菌体特征包括革兰氏染色、芽孢染色和菌
体大小等指标的测定。
1.6摇 16S rDNA和 recA基因的序列测定及系统发育分析
采用细菌基因组 DNA试剂盒 OSR鄄M502 (天根生化科技有限公司生产)提取细菌基因组 DNA,进行 16S
rDNA和 recA基因的扩增。 所用引物、扩增体系、反应条件见文献[15,19],扩增产物送北京奥科鼎盛生物科技有
限公司测序,根据测序结果,将扩增得到的序列在 GenBank 中进行 BLAST 分析,用 DNAMAN6.0 进行序列相
似性分析,通过 Clustal鄄X1.81和 TREECONW软件(version 1.3b),以 Neighbor鄄joining方法构建系统发育树,用
Bootstrap(1000次重复)进行检验。
1.7摇 接种试验
对筛选菌株进行大豆幼苗的接种试验。 选取饱满、健康、大小均一的大豆种子,进行表面消毒、发芽、接种
和盆栽试验,接种无菌水的幼苗为对照(Control Check, CK),具体参见文献[15]。 生长 1 个月记录鲜重、苗高。
另外,选用 1株大豆根瘤菌 Sinorhizobium fredii UDSA205T为参考,并与大豆根瘤内生菌的促生作用进行比较,
统计其结瘤和植物促生指标(即鲜重和苗高)。 用 SPSS 11.0 软件统计分析,评价接种内生菌对幼苗植株生长
的影响。
2摇 结果与分析
2.1摇 溶磷性测定
2.1.1摇 筛选结果
324株大豆根瘤内生菌接种在无机磷培养基上,测定溶磷圈直径和菌落直径大小。 结果发现,溶磷性内
生菌共有 36株。 从初筛结果中选取 20株溶磷能力较强的菌株进行复筛,结果表明,溶磷能力最强的菌株为
DD291,D / d为 3.550(表 1)。
2.1.2摇 液体培养基中内生菌溶磷效果
平板筛选 20株溶磷能力较强的内生菌,在液体条件下震荡培养均有溶磷能力。 发酵液中可溶性磷含量
和对照相比增加 1—11.9倍。 溶磷量大于 300 mg / L的有 9株(DD291、DD284、DD283、DD140、DD142、DD167、
DD161、DD312、DD311),其中菌株 DD291发酵液中可溶性磷含量最高(452 mg / L),DD284 次之(439 mg / L)。
发酵液 pH值与对照相比,均有不同程度下降,最大降幅达 2.92个 pH单位。 可溶性磷增加与 pH值降低有一
定相关性,但 pH值相近菌株的溶磷量也存在差异(图 1)。
2.2摇 溶磷性内生菌抗性测定
2.2.1摇 耐盐能力
由表 2 可见,20 株菌均可耐受 4%和 5%盐浓度,18 株菌可耐受 6%盐浓度,7 株菌(DD028、DD140、
DD167、DD186、DD283、DD284、DD167)可耐受 7%盐浓度,其中 1 株菌(DD140)可耐受 8%盐浓度,9%盐浓度
无存活菌株。 说明筛选出的部分溶磷性内生菌在 4%—6% NaCl浓度培养基上具有较强耐受性,最大可耐受
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含 8%的盐浓度。
表 1摇 大豆根瘤溶磷性内生菌复筛结果
Table 1摇 The secondary screening results of dissolved inorganic phosphorus by endophytic bacteria from soybean nodules
菌株
Strains
溶磷圈直径(D) / cm
Diameter of dissolved phosphorus halo
菌落直径(d) / cm
Colony diameter
比值(D / d)
Ratio
DD291 3.97依0.121 0.42依0.052 3.550依0.327a
DD284 3.93依0.121 0.47依0.041 3.460依0.146b
DD283 2.87依0.110 0.83依0.121 3.458依0.163bc
DD140 2.13依0.369 0.65依0.328 3.277依0.051a
DD167 3.72依0.325 1.18依0.172 3.153依0.065a
DD186 3.68依0.264 1.13依0.200 3.257依0.024a
DD028 3.53依0.372 1.15依0.327 3.070依0.049a
DD264 2.88依0.075 1.43依0.110 2.014依0.203bc
DD273 2.83依0.121 1.57依0.121 1.803依0.163bc
DD272 1.98依0.130 1.43依0.151 1.385依0.218bc
DD312 1.93依0.163 1.47依0.163 1.313依0.203bc
DD270 1.87依0.121 1.65依0.105 1.133依0.067bc
DD274 0.88依0.117 0.68依0.117 1.294依0.057c
DD142 2.43依0.258 1.92依0.147 1.266依0.057a
DD161 2.27依0.301 1.82依0.248 1.247依0.036a
DD168 2.45依0.123 1.97依0.186 1.244依0.063a
DD138 2.30依0.219 1.87依0.187 1.230依0.030a
DD062 2.37依0.163 1.93依0.163 1.228依0.037a
DD125 2.55依0.321 2.08依0.232 1.226依0.046a
DD126 2.40依0.190 1.97依0.186 1.218依0.035a
摇 摇 菌落上透明圈直径、菌落直径均为培养 4—7 d测得 6次重复的平均值依标准差,数据后小写字母表示差异显著 (P<0.05)
图 1摇 液体培养条件下内生菌对 Ca3(PO4) 2的溶解能力
Fig.1摇 Dissolving capacity of endophytic bacteria to Ca3(PO4) 2 under liquid culture conditions
表 2摇 内生菌对不同 NaCl浓度耐受性
Table 2摇 The tolerance of endophytic bacteria to different concentration of NaCl
NaCl 浓度 NaCl concentration / % 4 5 6 7 8 9
存活菌株 Survival strains 20 20 18 7 1 0
比例 Proportion / % 100 100 90 35 5 0
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2.2.2摇 耐酸碱能力
对耐盐的 7株菌接种在 pH值 5—11培养基上(表 3),培养 3 d 后观察,7 株菌在 pH 值 8—10 培养基上
均能很好生长,在 pH值 6时菌株生长仅次于对照,在 pH 值 5 时菌株 DD140、DD283、DD291 可生长,说明这
些菌株有一定耐酸能力。 在 pH 值 11 下菌株 DD283、DD284 均不能生长,DD291 生长仅次于对照,其余 4 株
菌(DD028、DD140、DD167、DD186)能存活,说明一些溶磷性内生菌株具有较强耐碱性。
表 3摇 pH对溶磷性内生菌生长的影响
Table 3摇 The effect of pH on growth of soluble phosphorus endophytes
pH 5 6 8 9 10 11 对照 / CK
DD028 + ++ ++ ++ ++ + +++
DD140 ++ ++ +++ +++ +++ + +++
DD167 - ++ +++ +++ ++ + +++
DD186 - ++ +++ +++ +++ + +++
DD283 ++ ++ +++ +++ ++ - +++
DD284 + ++ +++ ++ +++ - +++
DD291 ++ +++ +++ +++ +++ ++ +++
摇 摇 “+++冶表示菌株生长很好,“++冶表示菌株生长良好,“+冶表示菌株存活,“-冶表示菌株不能生长
2.2.3摇 重金属抗性
由表 4 可知,7 株菌对 Pb2+、Hg2+、Cr6+和 Cu2+有较强耐受性。 耐受 5 mmol / L Pb2+的有 3 株(DD186、
DD284、DD291),能耐受 4 mmol / L Pb2+的有 3株,能耐受 3 mmol / L Pb2+的仅有 1株。 在 1.0 mmol / L Ni2+浓度
时仅有 DD283存活,其余菌株生长受严重抑制。 能耐受 0.05 mmol / L Hg2+有 2 株,其余 5 株均能耐受 0.025
mmol / L Hg2+。 能耐受 1.2 mmol / L Cr6+的有 6株,耐受 0.9 mmol / L Cr6+的仅有 1 株(DD186)。 能在 Cu2+浓度
为 1.2 mmol / L 的培养基上生长的仅有 DD028,能耐受 0.9 mmol / L 的有 4株,能耐受 0.7 mmol / L Cu2+的仅有 2
株(DD167、DD186)。 总之,在设置的重金属浓度范围内,7株溶磷菌中仅有 1 株菌 DD283 可同时耐受 5 种重
金属,其余 6株可同时耐受 4种不同浓度的重金属。
表 4摇 溶磷菌株重金属抗性
Table 4摇 Heavy metal toxicity testing of the soluble phosphorus endophytes
菌株 strain
重金属浓度 Heavy metal concentration / (mmol / L)
Pb2+ Ni2+ Hg2+ Cr6+ Cu2+
DD028 4.0 0.050 1.2 1.2
DD140 4.0 0.025 1.2 0.9
DD167 4.0 0.050 1.2 0.7
DD186 5.0 0.025 0.9 0.7
DD283 3.0 1.0 0.025 1.2 0.9
DD284 5.0 0.025 1.2 0.9
DD291 5.0 0.025 1.2 0.9
摇 摇 :菌株在所设重金属浓度下不能生长
2.3摇 溶磷菌株菌落、生理生化和细胞形态特征
筛选结果表明,筛选出 7株内生菌进行细胞形态特征和生理生化特性测定(表 5)。 在固体培养基上培养
48h,菌株 DD028、DD140、DD167、DD186的菌落呈不透明或半透明突起,菌落边缘不规则,呈乳白色且湿润,
菌落直径 1—5 mm。 菌体经革兰氏染色呈杆状或短棒状,菌体大小(0.96—1.27) 伊(1.44—4.36) 滋m,革兰氏
染色呈阳性,有芽孢生成。 DD283、DD284均为革兰氏阴性菌,无芽孢生成,菌落呈半透明或不透明,突起、边
缘圆整、湿润,菌体呈短杆状或球状。 菌株 DD291 菌落半透明、突起,边缘圆整、乳白、湿润,菌体杆状,大小
(0.11—0.26)伊(1.54—1.92) 滋m,革兰氏阴性,无芽孢。
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表 5摇 筛选菌株生理生化和细胞特征
Table 5摇 Physiological and biochemical tests and cell characteristics of screened strains
理化特性
Physiological and biochemical
characteristics
DD028 DD140 DD167 DD186 DD283 DD284 DD291
接触酶 Catalase test + + + + + + +
V鄄P 试验 V鄄P test + + + + + + -
D鄄葡萄糖产酸 D鄄glucose acid yield + + + + + + +
L鄄阿拉伯糖产酸 L鄄Arab sugar acid yield - - + + - - +
D鄄甘露醇 D鄄mannitol - + - + + + +
木糖 Xylose - - + - - - +
肉汤 Broth (pH5.0) + + + + + + +
淀粉 Starch + + + + + + -
苯丙氨酸脱氨酶 Phenylalanine transaminase - - - - - - +
卵黄磷脂酶 Lecithinase + + + + + + +
硝酸还原酶 Nitrate reductase + + + + + + +
酪素分解 Casein decomposition + + + + + + +
柠檬酸盐 Citrate utilization + + + + + + -
酪氨酸水解 Tyrosine hydrolysate + + + + + + -
形态 Morphology 短杆状 杆状 杆状 短杆状 球状 短杆状 杆状
菌体大小 Strain size / 滋m (0.96—1.05)
伊
(1.44—1.92)
(1.27—1.35)伊
(4.36— 4.52)
(0.96—1.25)伊
(2.5—2.88)
(0.96—1.44)伊
(1.92—2.40) 0.22—0.27
(0.6—1.1)伊
(1.2—2.5)
(0.11—0.26)伊
(1.54—1.92)
革兰氏染色 Gram stain G+ G+ G+ G+ G- G- G-
芽孢有无 Spore forming + + + + - - -
摇 摇 “+冶表示阳性,“_冶表示阴性
2.4摇 筛选菌株系统发育分析
筛选出 7株菌的 16S rDNA和 recA基因经 PCR(Polymerase Chain Reaction)扩增表明,扩增产物长度分别
为 1.5 kb和 485 bp,在 GenBank 中的序列登记号为 KJ596324鄄KJ596330,KM216215鄄KM216221。 将菌株序列
与模式菌株或参比菌株序列进行比对,16S rDNA 序列分析结果表明,菌株 DD283、DD284 与菌株 Enterobacter
ludwigii EN鄄119T(AJ853891) 、Enterobacter cancerogenus LMG 2693T(Z96078)位于系统发育树分支 I 的同一小
分支上 (图 2),与模式菌株 Enterobacter cancerogenus LMG 2693T ( Z96078)、Enterobacter ludwigii EN鄄 119T
(AJ853891)的同源性分别为 99.7%和 98.3%。 而持家基因 recA 系统发育分析(图 3)表明 DD283、DD284 与
Enterobacter cancerogenus ICMP5706 ( DQ859855 ) (同源性 98. 9%)、 Enterobacter cloacae SA鄄ENCLREC25
(HF569037)(同源性 99. 2%)分别有最大同源性。 结合其理化特性和培养特征,分别属于 Enterobacter
cancerogenus,Enterobacter cloacae。 菌株 DD291位于 16S rDNA系统发育树分支 II上,与模式菌株 Pseudomonas
putida ATCC 12633T(AF094736)具有最大的同源性(99.3%),而 recA系统发育分析中与 Pseudomonas putida 具
有最高同源性,支持了 16S rDNA 的系统发育地位,结合理化特征和形态学特征,DD291 属于 Pseudomonas
putida。 菌株 DD028、DD140、DD167 和 DD186 位于系统发育分支 III 上,且它们与模式株 Bacillus cereus
ATCC14579T(AF290547)具有最高同源性,均为 100%,而 recA 系统发育分析结果(同源性分别为:97.7%、
96.7%、98%、98%)进一步印证了 16S rDNA的系统发育地位,结合生理生化特征以及培养特征,这 4株菌均属
于 Bacillus cereus。
2.5摇 内生菌接种对幼苗的影响
由表 6可知,接种内生菌、根瘤菌与对照相比,苗高均有所增加,但是并非全部显著增加,仅 Sinorhizobium
fredii USDA205T、 DD284、 DD186、 DD167,分别显著增加了 35. 43%、 29. 86%、 27. 06%、 29. 86%, S. fredii
USDA205T增加最多,DD284、DD167次之。 对幼苗鲜重的影响除 DD284外均有显著增重,接种根瘤菌 S. fredii
USDA205T的增重最多(104%),DD167次之(58.46%)。 但是,单独接种内生菌均不能使幼苗结瘤。
1344摇 13期 摇 摇 摇 赵龙飞摇 等:溶磷性大豆根瘤内生菌的筛选、抗性及系统发育和促生 摇
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图 2摇 溶磷性内生菌株 16S rDNA序列系统发育树(系统发育树分支上的数值表示大于 50%的自举值,括号里是 GenBank登录号,粗体是待
测菌株,标尺指核苷酸替代数)
Fig.2摇 Phylogenetic tree generated by the neighbor鄄joining method based on 16S rDNA sequences of selected strains (Bootstrap values (1000
replicates) above 50% are indicated above the branches. Strains tested are labeled in bold. Scale bar indicates 0.05% substitution of nucleotide)
表 6摇 内生菌接种大豆幼苗试验结果
Table 6摇 Results of inoculation tests
菌株
Strains
苗高 / cm
Seedling shoot length
鲜重 / (g /株)
Seedling fresh weight
瘤数 / (个 /株)
Number of nodules
DD284 34.31依1.92a* 11.23依1.65cd 0a
DD283 32.53依0.72ab 12.31依1.18bc 0a
DD291 31.46依3.82ab 13.15依0.61bc 0a
DD186 33.57依2.56a 12.54依0.60bc 0a
DD167 34.31依1.03a 14.23依0.57b 0a
DD140 33.29依1.22ab 13.16依1.19bc 0a
DD028 29.14依5.18ab 13.72依0.31bc 0a
CK 26.42依0.80b 8.98依0.09d 0a
Sinorhizobium fredii USDA205T 35.78依0.46a 18.32依1.22a 28b
摇 摇 * 表中数据为测得 3次重复的平均值依标准差,数据后不同小写字母表示差异显著 (P<0.05)
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图 3摇 溶磷性内生菌株 recA基因序列系统发育树(系统发育树分支上的数值表示大于 50%的自举值,粗体是待测菌株,标尺指核苷酸替代
数)
Fig.3摇 Phylogenetic tree generated by the neighbor鄄joining method based on recA gene sequences of selected strains (Bootstrap values (1000
replicates) above 50% are indicated above the branches. Strains tested are labeled in bold. Scale bar indicates 0.05% substitution of nucleotide
3摇 讨论
一般认为微生物生长代谢过程中分泌出 H+、有机酸、磷酸酶以及通过降解底物释放磷,同时伴随溶磷菌
无机盐呼吸和同化 NH4+时也可释放 H+[20]。 产生的酸既能降低 pH 值,又可与铁、铝、钙等离子结合,从而使
难溶性磷酸盐溶解[2],其作用大小不仅取决于分泌酸种类和数量,还与其缓冲性能以及有机酸鳌合离子
(Ca2+)多少有关[20]。 本试验中,可溶性磷增加而 pH 值有一定降低,但部分 pH 值相近菌株溶磷量又存在差
异。 这与赵小蓉等[5,21鄄22]研究结果一致,溶磷菌在培养过程中分泌出一些物质,导致 pH 值降低。 Illmer 和
Schinme[23]认为,分泌物质对培养基介质酸度没有影响,但能与钙离子产生络合或螯合作用,使磷酸盐溶解。
本试验涉及到磷源仅为磷酸钙,还需对其溶磷能力进行全面评估。 因此,开展对多种形式磷源进行内生菌解
磷能力测定[20]、溶磷相关基因扩增与克隆以及内生菌溶磷机制仍需进一步研究。
研究表明,芽孢杆菌属(Bacillus)是豆科根瘤中常见内生菌,能够产生大量溶磷物质、生长素等代谢产物,
促进了土豆、番茄、拟南芥、大米、谷物、油菜、可可、豇豆、鹰嘴豆等作物产量的提高[24鄄28]。 本研究筛选的溶磷
性内生菌 DD028、DD140、DD167、DD186均属于 Bacillus,由于其形成芽孢,有助于该类细菌在低温、高温和干
旱等逆境条件下长期存在,形成优势种群,且具有较强耐盐碱能力和重金属抗性,比较适于溶磷菌肥的开发和
利用。 研究表明[25鄄28]芽孢菌可快速定殖在小麦、土豆、玉米、草坪、蚕豆、可可和黄瓜根部,诱导宿主发生生理
变化和系统抗性,提高作物对生物胁迫和非生物胁迫的抵抗能力。 Bai 等[29]从大豆根瘤中分离出 3株内生菌
均属于 Bacillus (归属于 B. subtilis,B. thuringiensis),单独接种不能促使宿主结瘤和重量增加,但这 3 株菌和
Bradyrhizobium japonicum联合接种,在无氮条件下均能增加植株的重量。 这和本研究结果不太一致,单独接
种内生菌 DD284、DD186、DD167 与对照相比,不仅均增加了植物的株高,除 DD284 外,鲜重也均有显著增加。
这可能与内生菌不同种、属(试验筛选菌株为 Enterobacter cancerogenus、Pseudomonas putida、Bacillus cereus)的
菌株特性有关,如这些菌株都具溶磷特性和部分有较强抗逆性。 本研究中,对大豆单接种根瘤菌
Sinorhizobium fredii USDA 205T时,与单接种溶磷菌相比,其苗高和鲜重均为最高,也有根瘤产生,说明,对豆科
植物来说,根瘤菌的促生作用要显著高于溶磷菌的促生作用。 菌株的其他促植物生长特性如代谢产物 IAA
(indole鄄3鄄acetic acid)、铁载体,以及溶磷菌和根瘤菌混合接种大豆等工作正在研究之中。
Enterobacter cloacae是兼性厌氧细菌,分离自水稻根际,具有较强的固氮能力,在培养过程中可产生乳酸
和氢、二氧化碳、氨等大量气体,并能排出一些含肽物质[30]。 且可通过产生 ACC(1鄄aminocyclopropane鄄 1鄄
carboxylate)转氨酶降低宿主植株体内乙烯水平,促进根的伸长[31]。 此外,也用于水果和蔬菜采后生物防治以
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及预处理种子防止倒伏病的发生。 如 E. cloacae CAL2 和 UW4 可以促进油菜根系生长;E. cloacae UW5 合成
植物激素 IAA,增加根毛的数量和侧根长度[32]。 E. cloacae RRC 101定殖于玉米植株内,作为根部内共生体防
治枯萎病的发生[33]。 本实验中内生菌 DD284 除具溶磷作用外,还兼有耐重金属和耐盐碱作用,这对适应大
田环境具有重要的应用价值。
菌株 DD291属于恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida),是一种广泛分布于陆地和水生环境的菌株,在豆科
植物根瘤中也常被分离出[34],是溶解无机磷的主要内生菌。 对宿主植物具有促生长作用,如 P. putida GR12鄄
2可定殖在宿主植物根部,促进根毛的形成,增加侧根的数量和长度[35]。 基因组分析[34]证实了 P. putida
KT2440的无毒性和安全性,为环境生物技术方面的应用提供了理论基础。
本试验中,耐受 7%NaCl的内生菌 DD283、DD284、DD028 不仅表现出较强溶磷特性,而且对 pH 值、重金
属铅、铬、铜也有较强耐受性。 7 株菌均能耐受 4 种以上重金属,这可能是内生菌通过分泌质子、氨基酸以及
各种有机酸,提高体系酸度,溶解重金属,或利用代谢产物与重金属配合改变形态,使其对多种金属具有耐受
性[36]。 因此,溶磷能力较强菌株对某些重金属也兼有较强耐受性,可能与菌体长期进化形成的适应机制有
关。 微生物为了适应胁迫环境,体内形成了 6类相应的抗性或解毒机制[37],包括细胞外排、胞外沉淀、胞内扣
押或隔离、主动输出、酶类解毒及降低细胞对重金属敏感性,这可能与菌株遗传特性及生存环境有关。 从大豆
根瘤特定微环境分离筛选出溶磷、耐金属和盐碱的优良菌株,调节和改善宿主生长环境,对促进我国农业和生
态可持续发展有重要意义。
致谢:温州医科大学附属第一医院转化医学研究所赖心河博士对本文写作给予帮助,特此致谢。
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