全 文 ：在酿酒酵母中共表达 !"#$ 和 !%&!基因后
利用木糖的初步研究
李永建，严 明，丁 莉，许 伟，许 琳!
（南京工业大学 制药与生命科学学院，南京 !"###$）
摘 要：为了使酿酒酵母较好地利用木糖产生乙醇，将来自 ’()*+,- .()*+/0(12,- 的木糖异构酶基因 !"#$ 和酿酒酵
母自身的木酮糖激酶基因 !%&"，构建到酵母表达载体 %&’()*&+ 中，导入酿酒酵母 ,-./$$ 中，同时成功表达了两
种酶基因。该菌以木糖为唯一碳源进行限氧发酵，木糖的利用率为 $ 01/2，为宿主菌的 / 0"3 倍，产生 ! 0!! 4456·
* 7 "的乙醇。同时初步探讨了两种酶基因的表达量对酿酒酵母发酵木糖生成乙醇的影响。木糖异构酶对木糖的利
用起关键性的作用，木酮糖激酶的过量表达不利于乙醇生成。
关键词：木糖异构酶；木酮糖激酶；木糖；酿酒酵母；乙醇
中图分类号：8391 文献标识码：: 文章编号："13! 7 ;139（!##1）#/ 7 ##1< 7 #<
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随着石油危机的出现，乙醇作为可再生资源中
比较理想的液态燃料正受到人们越来越多的关注。
自然界中可再生的木质纤维素资源极为丰富，其主
要成份之一是半纤维素。半纤维素容易被酸或者酶
水解，其水解产物中的 9<2 \ $#2为木糖［"］。因此
利用木糖发酵生产乙醇具有重要的应用研究价值。
酿酒酵母是传统的乙醇生产菌株，因其缺乏转
化木糖的酶系而不能很好地利用木糖。自然界中微
! 收稿日期：!##1)#9);#
基金项目：国家 $3; 项目（!##;(]3"1###）；国家自然科学重点基金项目（!#;;1#"#）。
作者简介：李永建（"$9#)），男，江苏连云港人，硕士，主要研究方向为分子生物学。
联系人：许 琳，教授，&)4BA6：VO6A>^ >@OP X ILO X K>
第 / 卷第 / 期
!##1 年 "" 月
生 物 加 工 过 程
(MA>IRI _5ON>B6 5J ]A5%N5KIRR &>?A>IINA>?
C5Q X !##1
·1<·
万方数据
生物由木糖转化为木酮糖的代谢途径有两条：其一，
木糖在依赖 !"#$% 的木糖还原酶（&’()*+ ,+-./01*+，
23）作用下还原木糖形成木糖醇，随后在依赖
!"# 4的木糖醇脱氢酶（&’(50)( -+6’-,)7+81*+，2#%）的
作用下，氧化形成木酮糖［9，:］。其二，在木糖异构酶
（&’()*+ 5*);+,1*+，2<）的作用下直接转化木糖形成木
酮糖［:，=］。第一条途径中由于 23 与 !"#% 的亲和
力较大，易于造成氧化还原不平衡导致副产物木糖
醇的大量积累。而来源于细菌的木糖异构酶（2<）可
以直接转化木糖到木酮糖，不需要任何辅酶。因此
木糖异构酶被认为是构建酿酒酵母木糖新代谢途径
的最适宜的酶。而木酮糖激酶催化木酮糖磷酸化形
成 >?磷酸木酮糖也是木糖代谢的限速步骤之
一［>，@］。已有文献报道［=，A］在酿酒酵母中表达了来
自于嗜热菌的的木糖异构酶基因和不同来源的木酮
糖激酶（&’(.()B581*+），但在发酵过程中仍然需要添
加葡萄糖，并且木糖的利用率很低。
本研究通过运用 $C3 技术将来自 !"#$%&’ ("#$)
%*+",-&’ 的木糖异构酶基因 ./01 和酿酒酵母自身的
木酮糖激酶基因 .23D，构建到酵母表达载体 EFGC?
HFI。采用诱导表达系统，使细胞生长和基因表达
的两个过程分开进行，在酿酒酵母中表达了来自
!"#$%&’ ("#$%*+",-&’ 的木糖异构酶基因（ ./01）和酿
酒酵母木酮糖激酶基因（ .23D），在酿酒酵母中建立
了 2<路径的木糖代谢途径。该重组菌在以木糖为
唯一碳源的培养基中进行限氧发酵，研究木糖异构
酶基因 ./01 和酿酒酵母自身的木酮糖激酶基因
.23D对酿酒酵母发酵木糖生产酒精的影响，以期为
今后酿酒酵母重组菌的木糖发酵的深入研究奠定基
础。
! 材料与方法
D JD 质粒与菌株
质粒 EFGC?HFI，菌株 K$%=LL 购自美国 G0,101?
7+8+公司，M?N+/0),购自美国 $,);+71公司，M?2KH" ，
M?2OGD，45>!为实验室保藏。
D J9 酶与试剂
$C3反应试剂盒（P# P5)*/5+8/+ C()80+/6 公司）；
琼脂糖 #!" 回收试剂盒（日本 M1B1,1）限制性内切
酶（英国纽英伦公司（!FP））；M= #!" 连接酶及低熔
点琼脂糖（美国 $,);+71 公司）；$C3 反应试剂、M1Q
#!"聚合酶及 #!" R1,B+,（大连宝生生物公司）；氨
苄青霉素，<$MS（北京博大泰克公司）；酵母提取物，
胰蛋白胨（T2T<# 公司产品）；破碎用玻璃珠（直径
U J> ;;），木酮糖（G57;1 公司产品）；K+1*0 !50,)7+8
P1*+（上海生工有限公司）；磷酸烯醇丙酮酸，"M$，丙
酮酸激酶（日本 V"OT 产品）；乳酸脱氢酶（"R?
3FGCT）；其余为国产分析纯。
D J: 培养基及菌体培养
K$"# 培养基用于酵母菌的培养和保存。HP培
养基（DU 7·H W D胰化蛋白胨，> 7·H W D酵母提取物，DU
7·H W D !1C(，E% A JU）用于大肠杆菌的培养。G#?HFI
培养基为用于酵母转化的含葡萄糖的基本选择培养
基。GDU 7·H W D的木糖。酵母重组子在 G#?HFI 培养基中
:U X培养 9= 6 后离心收集菌体，生理盐水洗 D 次，
菌体转接于含 <$MS 的以木糖为唯一碳源的培养基
中，控制菌体的 64@UU为 9 JU 左右，在木糖为唯一培
养基上 :U X继续培养。
D J= 分子克隆技术
#!" 酶切、连接、转化和细菌感受态制备等基
本基因操作技术参照文献及有关公司提供的操作手
册进行［Y，L］。基因组 #!"提取采用上海华舜生物工
程有限公司的试剂盒，经琼脂糖凝胶电泳分离的
#!"片段回收采用德国宝灵曼公司的 #!" 回收试
剂盒回收纯化。$C3 反应采用 P5);+0,1 公司 $C3
仪。酿酒酵母的转化采用醋酸锂法。
D J> 木糖异构酶和木酮糖激酶的活性检测
D J> JD 粗酶液制备
3 J 7#$#8,’,9# 转化子在选择液体培养基 G# ?HFI
中培养 :@ 6 至对数生长期，转入发酵培养基中，诱
导培养，离心收集菌体并用 >U ;;)(·H W D磷酸缓冲液
（E% A JU）洗涤两次，然后溶于新配制的裂解缓冲液
（>U ;;)(·H W D磷酸缓冲液，U J> ;;)(·H W D #MM，D
;;)(·H W D $RGZ，E% A JU）中。菌悬液加入适量玻璃
珠（直径 U J> ;;），在细胞破碎仪最大速度下处理 >
;58，冰浴 : ;58。破碎重复 : [ = 次。
= X下 DU UUU 7离心 DU ;58，收集上清液，即为
粗酶液，用于酶活测定分析和蛋白含量测定。蛋白
含量的测定按 P,1-\),- 方法［DU］进行。
D J> J9 酶活力测定
（D）木糖异构酶的酶活性测定［DD］ 木糖异构酶
的酶活力测定采用半胱氨酸?咔唑法：U JD ;)(·H W D
4?木糖 >U"H，粗酶液 DUU"H，DU ;;)(·H
W D R7C(9 >U
"H，缓冲液（磷酸钾缓冲 E% A JU）>U"H，Y> X，反应 D
·@@· 生物加工过程 第 = 卷第 = 期
万方数据
!，沸水浴终止反应；取 "##!$ 立即加入 "% &’(·$
) "
的 *+ ,-. / &$，" 012的半胱氨酸盐酸盐 # 0+ &$，
# 0"+2的咔唑酒精溶液 # 0+ &$，混匀，+1 3反应 %#
&45，于 1.# 5&处测定光吸收，据木酮糖标准曲线求
得木酮糖量。
在标准反应混合物中，酶活力单位（6）定义为
每分钟催化产生 "!&’$木酮糖所需的酶量。
（+）木酮糖激酶的酶活力测定［"+］ 78 的酶活分
析液为：1# &&’(·$ ) " 9:4;，1# &&’(·$ ) "氨基乙酸，1#
&&’(·$ ) " 8<(，" &&’(·$ ) " =>9?，"# &&’(·$ ) " @AB，"
&&’(·$ ) "磷酸烯醇丙酮酸，1 &&’(·$ ) " CD<(+，#01
&&’(·$ ) " ?9E，#0%&&’(·$ ) " @?>*，+1 6 乳酸脱氢酶
和丙酮酸激酶，#0" &$ 酶粗提液，无菌水调终体积至
#01 &$。反应从加入 " &&’(·$ ) "木酮糖开始。
在标准反应混合物中，酶活力单位（6）定义在
分析条件下每分钟转化 "!&’$底物所需要的酶量。
测定在 %.# 5&波长下进行。
" 0/ 发酵底物产物分析
用高效液相层析（*E$<）分析底物的消耗以及
产物的产出。层析柱使用 ,F!G:4;’:H @*+离子交换
柱，流动相乙腈和水体积比为 I1 J "1，流速为 " &$·
&45 ) "，分析在 %K 3进行。用折光示差检测仪 +."#
进行检测，乙醇测定采用血乙醇试剂盒（长春汇力生
物技术有限公司）。
" 0K !"#$ 基因的克隆
参照由 LG5GHA5M 数据库中查到的 %&’()*+ ,&’(-
)./&01*+ *NI基因序列，设计如下 E1PQ?9??L??9 L<9?<<<<9<<9公司合成。用上海华舜生物工程有限公司的试剂盒，
以 9Q!"#$（实验室保藏）为模板 E基因 !"#$。扩增程序为：R. 3，+ &45；R. 3，%# ;；K#
3，1# ;；/I 3，R# ;，共 %1个循环。
" 0I !43" 基因的克隆
参照由 LG5GHA5M数据库中查到的 SGA;T !43" 基
因序列，然后设计如下 EL?<引 物 1PQL<9?L<99?99?L?9L?L?L9<9999<（2&’"）由上海博亚公司合成。采用上海华舜生物
工程有限公司的试剂盒，提取基因组。以 9Q!43"
（实验室保藏）为模板上 E!"#$。扩增程序为：R. 3，+ &45；R. 3，%# ;；1# 3，
1# ;；/I 3，R# ;，共 %1 个循环。
! 结果与讨论
+ 0" !"#$ 及 !43" 基因扩增结果及鉴定
E的目的基因片断，回收纯化。回收结果如图 " 所示。
结果显示扩增片段 !"#$ 大小约为 " 0+ MH，!43" 大
小约为 " 0I MH，与文献报道一致。
$A5G 78,：EC：>@? CA:MG: >$+###
图 " 木糖异构酶基因（!"#$）和木酮糖
激酶基因（!43"）EB4D 0" E+ 0+ 表达重组子的构建、筛选与鉴定
将回收后的 E2.,"和 3/’"限制性内切酶双酶切，然后将切下的
目的基因及同样处理过的 F=,< 载体进行连接，连
接后得到 F=,E酶切，连接后得到 F=,大肠杆菌 671$感受态细胞。提取质粒经 708U%
酶切、电泳结果见图 +。结果表明外源片段已经连
接到表达质粒上。质粒构建图如图 %。
+ 0% !"#$ 和 !43" 的表达
在以木糖为唯一碳源的培养基，诱导培养温度为
%# 3，"1# :·&45 ) "，诱导时间为 .I !的条件下，考察了
不同 YE9L终浓度对重组菌木糖异构酶和木酮糖激酶
活的影响。实验结果如图 . 所示，结果表明，!"#$ 和
!43"在酿酒酵母中得到表达。在诱导剂 YE9L 终浓
度为 "0# &&’(·$ ) "时重组菌发酵液木糖异构酶的酶
活最高，为 #01"+ 6·&D ) "蛋白，在 #0I &&’(·$ ) "木酮
+##/ 年 "" 月 李永建等：在酿酒酵母中共表达 !"#$ 和 !43" 基因后利用木糖的初步研究 ·/K·
万方数据
糖激酶的酶活为 !"#!$ %·&’ ( )蛋白。出发菌的木酮
糖激酶的酶活为 !"*+, %·&’ ( )蛋白。
-./0 )：12345!"#$%!&’) ( )*+6!；-./0 7：89 7.:;0: <-,!!!
图 , 表达重组子 12345!"#$%!&’) 的酶切鉴定
=>’ ", )*+6! 6>’0?@ AB :0CA&D>/./@ 1E.?&>6 12345!"#$%!&’)
图 * 表达重组质粒构建图
=>’ "* FGH?>C.E &.1 AB :0CA&D>/./@ 1E.?&>6 12345!"#$%!&’)
—!—木糖异构酶的酶活；—"—木酮糖激酶的酶活
图 $ IFJK终浓度对重组菌酶活的影响
=>’ "$ I/BEL0/C0 AB IFJK B>/.E CA/C0/@:.@>A/
, "$ 不同诱导剂浓度对重组菌木糖的利用率的影
响
重组菌在木糖为唯一碳源，*! M，)N! :·&>/ ( )
的培养条件下，发酵 )!O G，观察了不同诱导剂浓度
对木糖利用的影响，结果表明相同条件下出发菌株
（12345-2%空质粒转入的酿酒酵母 PFQ$##），其木
糖利用率为 , "*)R，没有检测到乙醇的产生。重组
菌在 IFJK浓度为 ) "! &&AE·- ( )时，木糖的利用率最
大可达 # "O$R，比出发菌提高了 $ ")+ 倍，乙醇的产
量为 , ",, &&AE·- ( )。
表 ) 不同诱导剂浓度下重组菌株木糖发酵实验
J.DE0 ) =0:&0/@.@>A/ AB SHEA?0 >/ 6>BB0:0/@ >/6LC06 CA/C0/@.@>A/
,（IFJK）
T &&AE·- ( )
,（木糖）
T ’·- ( )
木糖醇产量
T ’·- ( )
乙醇产量
T &&AE·- ( )
木糖残留量
T ’·- ( )
木糖转化率
T R
! "O )! ! "!NN , "N$ # "+!! * "!!
! "U )! ! ",!, ) "## # "N!! N "!!
) "! )! ! ")!+ , ",, # "!*O # "O$
) ", )! ! ",U) , "$O # ",$O + "N$
有文献报道［$］采用酿酒酵母共表达 !"#$ 和
!&’)，需要添加葡萄糖和木糖共发酵生产酒精，虽
然木糖的消耗比出发菌提高了 $* "UR，但其木糖转
化率较低。同时由表 ) 可以看出，重组菌均有副产
物木糖醇的产生，可能是与菌体内依赖 89异的醛糖还原酶作用有关［)*］。
由图 $ 结合表 ) 结果可知：随着木糖异构酶的
酶活的提高，木糖的利用率也相应增加。在 IFJK 浓
度为 ) "! &&AE·- ( )时，木糖异构酶的活力为 ! "N), %
·&’ ( )蛋白，对应于木糖的利用率最大为 # "O$R，而
当木糖异构酶的活力较低时，木糖的利用率亦出现
相应的下降（见图 $），表明木糖的利用率和木糖异
·OU· 生物加工过程 第 $ 卷第 $ 期
万方数据
构酶的活性有着直接的关联。同时，木酮糖激酶的
活性对酒精产量也有一定影响，结果表明随着木酮
糖激酶活性的提高，酒精产量降低。在诱导剂浓度
为 ! "# $$%&·’ ( )时木酮糖激酶的酶活性最小，但酒
精含量达到最高为 * "+, $$%&·’ ( )。而诱导浓度为
) "! $$%&·’ ( )时虽然木糖的利用率较高，其酒精含
量较低。推测可能是木酮糖激酶过量表达使代谢途
径中的 -./消耗增多，而酿酒酵母内的代谢流没能
提供磷酸戊糖途径所需的足够的 -./，导致乙醇的
产率相对降低［),，)+］。有文献报道当木酮糖激酶过
量表达时，+0磷酸木酮糖的水平很高而 -./ 的量很
低，可能因为 +0磷酸木酮糖的增多对细胞产生了毒
害作用［#0)+］。木酮糖激酶催化木酮糖生成 +0磷酸木
酮糖，是提高木糖代谢流向磷酸戊糖途径的关键，该
结果与 -112 3 相类似［)#］，只有木酮糖激酶适量表
达，使之与整个代谢网络相协调才能调节代谢流向
生成乙醇的方向，提高乙醇的得率。
4 结 论
将 !"#$%&’ ("#$%)*"+,&’ 木糖异构酶（56）基因
-./0 和酿酒酵母木酮糖激酶基因 -12) 成功构建
到酵母表达载体 73890’3:，酶活测定证明转化入酿
酒酵母菌株的酶基因得到了活性表达。重组菌以木
糖为唯一碳源的发酵结果表明，木糖的利用率达到
; "#,<。木糖利用率同出发菌相比提高了 , ")= 倍，
但是木糖的转化率并不理想，推测可能的原因主要
是来自 !"#$%&’ ("#$%)*"+,&’ 木糖异构酶在酿酒酵母
最适生长温度（4! >左右）时的酶活力较低。木糖
异构酶对于木糖利用率起着重要作用。木酮糖激酶
的适量表达对提高乙醇得率具有十分重要的影响。
目前本实验室正在进行嗜热木糖异构酶的分子
改造，期望木糖异构酶在低温下具有较高的活性，从
而提高工程菌株共发酵木糖产生乙醇的能力。同时
正在对共表达 -./0 和 -12) 菌株发酵木糖生成乙
醇进行探索，以期为酿酒酵母重组菌木糖发酵代谢
工程的深入研究奠定基础。
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