全 文 ：摇 核 农 学 报摇 圆园员圆袁圆远渊猿冤院园源源源 耀 园源源愿允燥怎则灶葬造 燥枣 晕怎糟造藻葬则 粤早则蚤糟怎造贼怎则葬造 杂糟蚤藻灶糟藻泽
文章编号院员园园园鄄愿缘缘员渊圆园员圆冤园猿鄄园源源源鄄园远
以木糖异构酶基因作为选择标记的花生遗传转化
丁摇 霄摇 隋炯明摇 王晶珊摇 乔利仙
渊青岛农业大学生命科学学院 辕山东省高校植物生物技术重点实验室袁 山东 青岛摇 圆远远员园怨冤
摘摇 要院用木糖异构酶基因 曾赠造粤 替换掉 责悦粤酝月陨粤员猿园员 中的潮霉素磷酸转移酶基因渊澡赠早则燥皂赠糟蚤灶 原 月 原
责澡燥泽责澡燥贼则葬灶泽枣藻则葬泽藻袁 匀责贼 冤袁构建了植物表达载体 责悦粤酝月陨粤员猿园员鄄曾赠造粤遥 再利用农杆菌介导法将
责悦粤酝月陨粤员猿园员鄄曾赠造粤导入花生袁转移到添加蔗糖渊缘早 辕 蕴冤和不同浓度木糖渊缘袁 员园袁 圆园袁 猿园早 辕 蕴冤的体胚诱导
及体胚萌发培养基上培养遥 对外植体成苗率及转基因阳性率进行统计袁结果表明袁当木糖浓度为 员园早 辕 蕴
时袁诱导成苗率为 员缘郾 圆缘豫 袁再生植株生长健壮袁且转基因阳性率高达 苑苑郾 圆苑豫 袁最终确定 员园早 辕 蕴 为最适
木糖筛选浓度遥 该筛选方法利用木糖作为筛选剂袁可以避免利用抗生素筛选可能造成的安全隐患袁转化
效率高袁是一种安全尧高效的筛选方法遥
关键词院花生曰 木糖异构酶基因曰 农杆菌介导法曰 遗传转化
栽匀耘 郧耘晕耘栽陨悦 栽砸粤晕杂云韵砸酝粤栽陨韵晕 韵云 孕耘粤晕哉栽 哉杂陨晕郧 载再蕴韵杂耘 陨杂韵酝耘砸粤杂耘
郧耘晕耘 粤杂 粤 杂耘蕴耘悦栽陨韵晕 酝粤砸运耘砸
阅陨晕郧 载蚤葬燥摇 杂哉陨 允蚤燥灶早鄄酝蚤灶早摇 宰粤晕郧 允蚤灶早鄄杂澡葬灶摇 匝陨粤韵 蕴蚤鄄曾蚤葬灶
渊悦燥造造藻早藻 燥枣 蕴蚤枣藻 杂糟蚤藻灶糟藻袁 匝蚤灶早凿葬燥 粤早则蚤糟怎造贼怎则葬造 哉灶蚤增藻则泽蚤贼赠袁 运藻赠 蕴葬遭 燥枣 孕造葬灶贼 月蚤燥贼藻糟澡灶燥造燥早赠 蚤灶
哉灶蚤增藻则泽蚤贼蚤藻泽 燥枣 杂澡葬灶凿燥灶早 孕则燥增蚤灶糟藻袁 匝蚤灶早凿葬燥袁 杂澡葬灶凿燥灶早摇 圆远远员园怨冤
粤遭泽贼则葬糟贼院栽澡藻 曾赠造燥泽藻 蚤泽燥皂藻则葬泽藻 早藻灶藻 渊 曾赠造粤冤 憎葬泽 糟造燥灶藻凿 蚤灶贼燥 责悦粤酝月陨粤员猿园员 增藻糟贼燥则 枣则燥皂 憎澡蚤糟澡 贼澡藻 澡赠早则燥皂赠糟蚤灶鄄月鄄
责澡燥泽责澡燥 贼则葬灶泽枣藻则葬泽藻 早藻灶藻 渊匀责贼冤 澡葬凿 遭藻藻灶 藻造蚤皂蚤灶葬贼藻凿袁 葬灶凿 憎葬泽 凿藻泽蚤早灶葬贼藻凿 葬泽 贼澡藻 则藻糟燥皂遭蚤灶葬灶贼 责造葬泽皂蚤凿 责悦粤酝月陨粤员猿园员鄄
曾赠造粤援 陨贼 憎葬泽 贼则葬灶泽枣燥则皂藻凿 蚤灶贼燥 贼澡藻 藻曾责造葬灶贼泽 燥枣 责藻葬灶怎贼 藻皂遭则赠燥灶蚤糟 造藻葬枣造藻贼 遭赠 粤早则燥遭葬糟贼藻则蚤怎皂鄄皂藻凿蚤葬贼藻凿 皂藻贼澡燥凿援 栽澡藻泽藻
藻皂遭则赠燥灶蚤糟 造藻葬枣造藻贼 藻曾责造葬灶贼泽 憎藻则藻 贼澡藻灶 贼则葬灶泽枣藻则则藻凿 贼燥 贼澡藻 泽燥皂葬贼蚤糟 藻皂遭则赠燥早藻灶藻泽蚤泽 蚤灶凿怎糟贼蚤燥灶 皂藻凿蚤怎皂 葬灶凿 泽燥皂葬贼蚤糟
藻皂遭则赠燥早藻灶藻泽蚤泽 早藻则皂蚤灶葬贼蚤燥灶 皂藻凿蚤怎皂 憎蚤贼澡 泽怎糟则燥泽藻 渊缘早 辕 蕴冤 葬灶凿 凿蚤枣枣藻则藻灶贼 糟燥灶糟藻灶贼则葬贼蚤燥灶泽 燥枣 曾赠造燥泽藻 渊缘袁 员园袁 圆园袁 猿园早 辕 蕴冤
则藻泽责藻糟贼蚤增藻造赠袁 怎灶凿藻则 贼澡藻 糟燥灶凿蚤贼蚤燥灶 燥枣 圆缘益袁 猿园园园造曾袁 员猿澡 造蚤早澡贼 辕 员员噪 凿葬则噪援 栽澡藻 则藻泽怎造贼泽 泽澡燥憎藻凿 贼澡葬贼 贼澡藻 藻曾责造葬灶贼泽
则藻早藻灶藻则葬贼蚤燥灶 则葬贼藻 憎葬泽 员缘郾 圆缘豫 袁 贼澡藻 则藻早藻灶藻则葬贼蚤燥灶 责造葬灶贼泽 憎藻则藻 泽贼则燥灶早 葬灶凿 贼澡藻 贼则葬灶泽早藻灶蚤糟 责燥泽蚤贼蚤增藻 则葬贼藻 憎葬泽 怎责 贼燥 苑苑郾 圆苑豫 葬贼
贼澡藻 糟燥灶糟藻灶贼则葬贼蚤燥灶 燥枣 员园早 辕 蕴 燥枣 曾赠造燥泽藻袁 泽燥 贼澡藻 员园早 辕 蕴 燥枣 曾赠造燥泽藻 憎葬泽 糟燥灶泽蚤凿藻则藻凿 贼燥 遭藻 贼澡藻 燥责贼蚤皂葬造 泽糟则藻藻灶蚤灶早 糟燥灶糟藻灶贼则葬贼蚤燥灶援
栽澡藻 泽藻造藻糟贼蚤燥灶 皂藻贼澡燥凿 怎泽蚤灶早 曾赠造燥泽藻 糟燥怎造凿 葬增燥蚤凿 贼澡藻 怎泽藻 燥枣 葬灶贼蚤遭蚤燥贼蚤糟泽 憎澡蚤糟澡 皂蚤早澡贼 糟葬怎泽藻 泽藻糟怎则蚤贼赠 则蚤泽噪泽援 栽澡藻 灶藻憎 凿藻增藻造燥责藻凿
皂藻贼澡燥凿 憎葬泽 枣燥怎灶凿 贼燥 遭藻 责则葬糟贼蚤糟葬遭造藻袁 澡蚤早澡造赠 藻枣枣蚤糟蚤藻灶贼袁 葬灶凿 泽葬枣藻 枣燥则 贼澡藻 早藻灶藻贼蚤糟 贼则葬灶泽枣燥则皂葬贼蚤燥灶 燥枣 责藻葬灶怎贼援
运藻赠 憎燥则凿泽院责藻葬灶怎贼曰 曾赠造燥泽藻 蚤泽燥皂藻则葬泽藻 早藻灶藻渊曾赠造粤冤曰 粤早则燥遭葬糟贼藻则蚤怎皂鄄皂藻凿蚤葬贼藻凿 皂藻贼澡燥凿曰 早藻灶藻贼蚤糟 贼则葬灶泽枣燥则皂葬贼蚤燥灶
收稿日期院圆园员员鄄员员鄄员苑摇 接受日期院圆园员圆鄄园圆鄄圆员
基金项目院山东省中青年科学家奖励基金渊月杂圆园园怨晕再园圆愿冤袁国家自然科学基金渊猿员员园员员苑愿袁 猿园愿苑员缘源源冤
作者简介院丁摇 霄渊员怨愿远鄄冤袁男袁山西运城人袁在读硕士生袁研究方向为植物基因工程遥 耘鄄皂葬蚤造院 愿园怨苑猿源员员岳 员远猿援 糟燥皂
通讯作者院乔利仙渊员怨苑猿鄄冤袁女袁山西太谷人袁博士袁副教授袁研究方向为花生分子育种遥 耘鄄皂葬蚤造院 造曾择蚤葬燥苑猿岳 员远猿援 糟燥皂
摇 摇 在植物基因工程中袁目前广泛使用的选择标记基
因主要包括抗生素类基因和抗除草剂类基因遥 这些存
在于转基因植物中的抗性标记基因是否对环境及人类
健康有不良影响和损害袁自转基因作物诞生以来就引
起人们的广泛关注咱员袁圆暂 遥 因此袁利用无争议的生物安
全标记基因构建表达载体逐渐成为新的研究热
源源源
摇 猿 期 以木糖异构酶基因作为选择标记的花生遗传转化
点咱猿袁源暂 遥 木糖是半纤维素的主要组成部分袁自然界中
存在着某些利用木糖的丝状真菌尧酵母菌和细菌渊如
大肠杆菌冤等咱缘暂 遥 在利用木糖的细菌中袁木糖是在木
糖异构酶渊曾赠造燥泽藻 蚤泽燥皂藻则葬泽藻袁曾赠造粤冤的作用下直接转化形
成木酮糖袁木酮糖由木酮糖激酶催化形成 缘 原磷酸木
酮糖袁然后进入磷酸戊糖途径渊孕孕孕 途径冤袁并经糖酵
解途径或在厌氧条件下产生乙醇袁或在好氧条件下经
栽悦粤循环彻底氧化咱远袁苑暂 遥 员怨怨缘 年 灾蚤藻蚤造造藻等成功克隆并
表达了 曾赠造粤 基因咱愿暂 遥 许多植物细胞不能利用木糖袁但
在 曾赠造粤 基因的催化下能将木糖转化为木酮糖
渊曾赠造怎造燥泽藻冤袁再经过磷酸戊糖途径分解代谢袁为细胞生
长所利用遥 在以木糖为主要碳源的培养基上袁转化细
胞因能利用木糖而呈现优势生长袁非转化细胞则因碳
源供应不足而使生长受到抑制咱怨暂 遥 匀葬造凿则怎责 等将 曾赠造粤
基因分别转化到马铃薯尧烟草和番茄愈伤组织后袁再将
愈伤组织置于木糖的培养基上进行筛选袁得到能够在
该培养基上正常生长的转基因植株咱员园暂 遥
本研究克隆了大肠杆菌木糖异构酶基因 曾赠造粤袁并
用 曾赠造粤替换掉 责悦粤酝月陨粤员猿园员 中的抗生素选择标记基
因 野 潮 霉 素 磷 酸 转 移 酶 基 因 渊 澡赠早则燥皂赠糟蚤灶鄄月鄄
责澡燥泽责澡燥贼则葬灶泽枣藻则葬泽藻袁 匀责贼冤冶袁构建以木糖作为筛选标记
的非 抗 生 素 安 全 标 记 基 因 植 物 表 达 载 体
责悦粤酝月陨粤员猿园员鄄曾赠造粤袁将表达载体通过农杆菌介导法转
化花生袁探究 曾赠造粤作为筛选标记基因在花生遗传转化
方面应用的可行性袁研究在不同木糖浓度的筛选培养
基上的筛选效率袁 旨在建立高效的木糖筛选再生体
系袁 为花生遗传转化研究提供一条安全尧高效的筛选
途径遥
员摇 材料与方法
员郾 员摇 材料
供试花生品种花育 圆圆 号袁由青岛农业大学生命科
学学院遗传研究室保存遥 大肠杆菌 耘援 糟燥造蚤 阅匀缘琢 菌
株尧农杆菌菌种 耘匀粤员园缘尧责悦粤酝月陨粤员猿园员 质粒均由青岛
农业大学生命科学学院遗传研究室保存遥 克隆载体
责酝阅员愿鄄栽 以及相关酶类购自大连 栽葬运葬砸葬 宝生物公
司遥
员郾 圆摇 培养基
体胚诱导培养基咱员员暂 院酝杂鄄月缘 渊酝杂 无机盐 垣 月缘 有
机成分冤 垣 员园皂早 辕 蕴 圆袁源鄄阅
体胚萌发培养基咱员员暂 院酝杂鄄月缘 渊酝杂 无机盐 垣 月缘 有
机成分冤 垣 源皂早 辕 蕴 远鄄月粤孕遥
员郾 猿摇 试验方法
员郾 猿郾 员摇 曾赠造粤基因片段克隆及序列分析 摇 根据 郧藻灶鄄
月葬灶噪中大肠杆菌 曾赠造粤 基因渊载园源远怨员冤序列设计引物袁
在上下游引物的 缘爷端均引入 载澡燥玉酶切位点渊斜体部
分冤院上游引物为 缘 爷鄄悦栽悦郧粤郧粤栽郧郧粤郧栽栽悦粤粤栽粤栽郧鄄
悦粤粤郧悦悦栽粤鄄猿爷袁下游引物为 缘 爷鄄悦栽悦郧粤郧粤栽栽粤栽栽栽鄄
郧栽悦郧粤粤悦粤郧粤栽粤粤栽郧郧栽栽栽鄄猿爷遥 以大肠杆菌 阅匀鄄缘琢
菌株基因组 阅晕粤 为模板进行 孕悦砸 扩增袁回收目的片
段并将其克隆到 责酝阅员愿鄄栽 载体袁得到 栽鄄曾赠造粤 重组质
粒遥 重组质粒经酶切鉴定后测序袁测序结果在 晕悦月陨
网站进行 月蕴粤杂栽遥
员郾 猿郾 圆摇 责悦粤酝月陨粤员猿园员鄄曾赠造粤载体的构建摇 用 载澡燥玉分
别 酶 切 责悦粤酝月陨粤员猿园员 和 栽鄄曾赠造粤 载 体袁 回 收
责悦粤酝月陨粤员猿园员 质粒大片段和 栽载体 员郾 猿噪遭 小片段袁用
栽源 阅晕粤连接酶将 曾赠造粤 基因片段连接到切除 匀责贼 基因
的表 达 载 体 责悦粤酝月陨粤员猿园员 上袁 得 到 重 组 质 粒
责悦粤酝月陨粤员猿园员鄄曾赠造粤遥
员郾 猿郾 猿摇 木糖筛选体系的建立
员郾 猿郾 猿郾 员摇 基本培养基和培养条件摇 培养基为 酝杂鄄月缘袁
添加不同浓度的蔗糖 辕木糖浓度比袁园郾 愿豫琼脂袁责匀 为
缘郾 愿袁在 员圆员益尧员园缘噪孕葬 条件下灭菌 圆园皂蚤灶遥 培养条件
为 圆缘益尧猿园园园造曾尧每日光照 员猿澡遥
员郾 猿郾 猿郾 圆摇 花生外植体对木糖的利用摇 将花生胚小叶
外植体转移到不含蔗糖袁仅以木糖渊猿园早 辕 蕴冤为碳源的
培养基上袁观察花生胚小叶外植体在木糖培养基上的
生长情况遥
员郾 猿郾 猿郾 猿摇 最低蔗糖浓度的确定摇 取花育 圆圆 号成熟种
子 圆源 粒袁分为 源 组袁每组 远 粒遥 将连同胚轴的花生胚
小叶切下袁在 苑园豫乙醇中浸泡 员园 耀 圆园泽袁 园郾 员豫升汞中
浸泡 愿皂蚤灶袁无菌水冲洗后浸泡过夜袁次日将胚轴切去
分离出胚小叶袁然后转移到 酝杂鄄月缘 培养基进行培养袁
添加蔗糖浓度分别为 缘袁员园袁圆园袁猿园早 辕 蕴遥 约 源 个月后统
计成苗率遥
员郾 猿郾 猿郾 源摇 花生遗传转化及最适木糖浓度的确定摇 利
用农杆菌介导法咱员圆暂将重组质粒 责悦粤酝月陨粤员猿园员鄄曾赠造粤转
化花生种胚胚小叶外植体袁然后转移到添加蔗糖渊缘早 辕
蕴冤和不同浓度木糖渊缘袁员园袁圆园袁猿园早 辕 蕴冤的体胚诱导培养
基上进行培养遥 诱导出的体胚转到添加蔗糖渊缘早 辕 蕴冤
和不同浓度木糖渊缘袁员园袁圆园袁猿园早 辕 蕴冤的体胚萌发培养基
上进行培养遥 约 源 个月后统计成苗率遥
员郾 猿郾 源摇 转基因植株的 孕悦砸检测摇 提取转基因花生植
株叶片基因组 阅晕粤袁利用 曾赠造粤 基因引物进行 孕悦砸 扩
增检测遥 孕悦砸反应程序为院怨缘益 缘皂蚤灶曰怨缘益 缘园泽袁缘远益
缘园泽袁 苑圆益 苑园泽袁猿园 个循环曰苑圆益 员园皂蚤灶遥
员郾 猿郾 缘摇 转基因阳性植株的嫁接移栽摇 当转基因植株
缘源源
核摇 农摇 学摇 报 圆远 卷
长到约 圆 耀 猿糟皂时袁从芽丛基部切下再生小苗做接穗袁
将其插入到切除主茎部分的砧木中袁使砧木和接穗紧
密接触袁然后用封口膜缠绕接口遥 将嫁接苗置于 酝杂鄄
月缘 培养基中培养 猿 耀 源凿袁然后移栽于灭菌的育苗基质
中驯化 猿 周袁之后移栽田间咱员猿暂 遥
圆摇 结果与分析
圆郾 员摇 曾赠造粤基因的克隆及鉴定
以大肠杆菌 阅匀鄄缘琢 菌株基因组 阅晕粤 为模板袁利
用 曾赠造粤基因引物进行 孕悦砸扩增袁得到约 员郾 猿噪遭的扩增
产物渊图 员冤袁与预测目标序列大小一致遥 回收纯化后
与 栽载体连接并转化 阅匀鄄缘琢 菌株袁用 载澡燥玉酶切重组
质粒渊图 圆冤袁对酶切片段大小正确的重组质粒进行测
序袁结果表明该片段长 员猿猿源遭责袁与 晕悦月陨数据库公布的
曾赠造粤基因序列渊载园源远怨员冤完全一致遥
图 员摇 大肠杆菌 曾赠造粤基因 孕悦砸扩增产物
云蚤早援 员摇 孕悦砸 葬皂责造蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶 责则燥凿怎糟贼 燥枣
曾赠造粤 早藻灶藻 枣则燥皂 耘援 糟燥造蚤
酝院阅晕粤 皂葬则噪藻则 阅蕴圆园园园曰悦运院对照曰
员院大肠杆菌 曾赠造粤基因 孕悦砸扩增产物
酝院 阅晕粤 皂葬则噪藻则 阅蕴圆园园园曰 悦运院 糟燥灶贼则燥造曰
员院 孕悦砸 葬皂责造蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶 责则燥凿怎糟贼 燥枣 曾赠造粤 早藻灶藻
图 圆摇 栽鄄曾赠造粤载体 载澡燥玉酶切图谱
云蚤早援 圆摇 栽鄄曾赠造粤 增藻糟贼燥则 凿蚤早藻泽贼藻凿 遭赠 载澡燥玉
酝院阅晕粤 皂葬则噪藻则 酝葬则噪藻则鄄郧曰员院栽鄄曾赠造粤载体酶切结果
酝院 阅晕粤 皂葬则噪藻则 酝葬则噪藻则鄄郧曰 员院 栽鄄曾赠造粤 增藻糟贼燥则 凿蚤早藻泽贼藻凿 遭赠 载澡燥玉
圆郾 圆摇 责悦粤酝月陨粤员猿园员鄄曾赠造粤表达载体的构建及鉴定
重组质粒 责悦粤酝月陨粤员猿园员鄄曾赠造粤 重组区域如图 猿 所
示袁责悦粤酝月陨粤员猿园员 载体上 匀责贼 基因被 曾赠造粤 基因所替
换遥 对 责悦粤酝月陨粤员猿园员鄄曾赠造粤进行 载澡燥玉酶切袁得到表达
载体大片段和 员郾 猿噪遭的小片段渊图 源冤遥 将经酶切验证
正确插入的 责悦粤酝月陨粤员猿园员鄄曾赠造粤 重组质粒送上海生工
测序袁根据测序结果筛选出正向插入的表达载体袁如图
猿 所示遥
圆郾 猿摇 培养基中最低蔗糖浓度的确定
将花生胚小叶外植体转移到不含蔗糖袁仅以木糖
渊猿园早 辕 蕴冤为碳源的培养基上袁花生自身无法利用木糖
正常生长袁在体胚诱导培养基上培养 源 周后全部褐化
死亡渊图 缘冤遥
外植体在不同浓度蔗糖培养基上的生长情况有所
区别渊图 远冤院当蔗糖浓度为 员园早 辕 蕴及以上浓度时袁外植
体可以分化成苗渊图 远 原 粤冤曰当蔗糖浓度为 缘早 辕 蕴 时袁
外植体停留在胚性愈伤组织阶段袁不能分化成苗渊图 远
原 月冤遥 最终确定 缘早 辕 蕴为蔗糖最低临界浓度遥
图 猿摇 责悦粤酝月陨粤员猿园员鄄曾赠造粤重组区域结构示意图
云蚤早援 猿摇 阅蚤葬早则葬皂 燥枣 贼澡藻 则藻糟燥皂遭蚤灶葬灶贼 责造葬泽皂蚤凿 责悦粤酝月陨粤员猿园员鄄曾赠造粤
圆郾 源摇 木糖筛选浓度的确定
经农杆菌侵染转化的花生胚小叶外植体接种含蔗
糖渊缘早 辕 蕴冤和不同浓度木糖渊缘袁 员园袁 圆园袁 猿园早 辕 蕴冤的筛选
培养基上袁培养 源 个月后袁统计成苗率遥 结果表明院木
糖浓度为 缘早 辕 蕴时袁诱导成苗率最高袁达到 员苑郾 缘源豫 袁随
着木糖浓度的增加袁成苗率反而下降渊表 员冤遥 木糖浓
度为 员园早 辕 蕴时袁成苗率虽有所下降渊员缘郾 圆缘豫 冤袁但植株
生长较为健壮遥 故以 员园早 辕 蕴为最佳木糖筛选浓度遥
圆郾 缘摇 再生植株的 孕悦砸检测
从 员园早 辕 蕴木糖浓度筛选出的再生植株中提取幼叶
基因组 阅晕粤袁利用 曾赠造粤 基因引物进行 孕悦砸 扩增遥 由
图 苑 可以看出转基因植株在 员园早 辕 蕴的木糖浓度下扩增
出了目标条带袁大小为 员郾 猿噪遭袁而水对照及非转基因植
株均未扩增出相同的条带遥 表明目的基因已转入花生
远源源
摇 猿 期 以木糖异构酶基因作为选择标记的花生遗传转化
摇 摇 摇 摇 摇 摇 表 员摇 不同木糖浓度下外植体的成苗率及再生苗生长情况
栽葬遭造藻 员摇 杂藻藻凿造蚤灶早 则葬贼藻 燥枣 藻曾责造葬灶贼泽 葬灶凿 早则燥憎贼澡 燥枣 贼则葬灶泽早藻灶蚤糟 责造葬灶贼泽 憎蚤贼澡 凿蚤枣枣藻则藻灶贼 糟燥灶糟藻灶贼则葬贼蚤燥灶 燥枣 曾赠造燥泽藻
木糖浓度
曾赠造燥泽藻 糟燥灶糟藻灶贼则葬贼蚤燥灶
外植体数
灶怎皂遭藻则 燥枣 藻曾责造葬灶贼泽
成苗数
灶怎皂遭藻则 燥枣 泽藻藻凿造蚤灶早
成苗率
泽藻藻凿造蚤灶早 则葬贼藻
再生苗生长情况
早则燥憎贼澡 燥枣 则藻早藻灶藻则葬贼藻凿 责造葬灶贼泽
缘早 辕 蕴 圆愿缘 缘园 员苑援 缘源豫 生长较弱 憎藻葬噪 早则燥憎贼澡
员园早 辕 蕴 圆愿圆 源猿 员缘援 圆缘豫 生长正常 灶燥则皂葬造 早则燥憎贼澡
圆园早 辕 蕴 圆苑圆 圆怨 员园援 远远豫 生长正常 灶燥则皂葬造 早则燥憎贼澡
猿园早 辕 蕴 猿园圆 员愿 缘援 怨远豫 褐化死亡率高 澡蚤早澡 遭则燥憎灶蚤灶早 皂燥则贼葬造蚤贼
图 源摇 责悦粤酝月陨粤员猿园员鄄曾赠造粤载体的 载澡燥 陨酶切图谱
云蚤早援 源摇 孕悦粤酝月陨粤员猿园员鄄曾赠造粤 增藻糟贼燥则 凿蚤早藻泽贼藻凿 遭赠 载澡燥 陨
酝院阅晕粤 皂葬则噪藻则 阅蕴员缘园园园曰
员院 责悦粤酝月陨粤员猿园员鄄曾赠造粤载体 载澡燥 陨酶切结果
酝院 阅晕粤 皂葬则噪藻则 阅蕴员缘园园园曰
员院 孕悦粤酝月陨粤员猿园员鄄曾赠造粤 增藻糟贼燥则 凿蚤早藻泽贼藻凿 遭赠 载澡燥 陨
中袁阳性率为 苑苑郾 圆苑豫 遥
圆郾 远摇 转基因植株生长情况
通过嫁接方法将转基因再生苗移栽田间咱员猿暂 袁转基
因植株在田间生长正常渊图 愿 原 粤冤袁开花及果针生长
渊图 愿 原 月冤也均表现正常遥
图 缘摇 花生胚小叶外植体在碳源为木糖渊猿园早 辕 蕴冤
的培养基上的生长情况
云蚤早援 缘摇 孕藻葬灶怎贼 糟燥贼赠造藻凿燥灶 造藻葬枣造藻贼 藻曾责造葬灶贼泽 早则燥憎贼澡
燥灶 皂藻凿蚤怎皂 葬凿凿藻凿 猿园早 辕 蕴 曾赠造燥泽藻
图 远摇 花生胚小叶外植体在添加 员园早 辕 蕴 渊粤冤和 缘早 辕 蕴渊月冤蔗糖培养基上的生长情况
云蚤早援 远摇 孕藻葬灶怎贼 糟燥贼赠造藻凿燥灶 造藻葬枣造藻贼 藻曾责造葬灶贼泽 早则燥憎贼澡 燥灶 皂藻凿蚤怎皂 葬凿凿藻凿
员园早 辕 蕴渊粤冤 葬灶凿 缘早 辕 蕴渊月冤 泽怎糟则燥泽藻 则藻泽责藻糟贼蚤增藻造赠
源摇 讨论
本研究初步建立了一套以木糖异构酶基因作为筛
选标记的花生遗传转化体系袁确定了筛选培养基中最
低蔗糖浓度为 缘早 辕 蕴袁最佳木糖浓度为 员园早 辕 蕴袁培养基中
木糖浓度占总糖浓度的 远远郾 远苑豫 袁这与 匀葬造凿则怎责 等报道
的在烟草中的筛选浓度相同咱员员暂 袁与玉米中报道的
缘园豫 耀员园园豫适宜木糖筛选浓度一致咱员源暂 遥 但在马铃薯
中报道的适宜筛选浓度为蔗糖 苑郾 缘早 辕 蕴尧木糖 猿郾 苑缘早 辕
蕴咱员员袁员缘暂 袁表明不同作物对木糖的筛选浓度有所差别遥
在蔗糖浓度为 缘早 辕 蕴尧木糖浓度为 缘 耀 猿园早 辕 蕴 的筛选培
养基中袁随着木糖浓度的升高袁外植体成苗率表现下降
趋势遥 当木糖浓度为 猿园早 辕 蕴时袁外植体褐化死亡率高袁
成苗率仅有 缘郾 怨远豫 袁表明高浓度木糖对植物有害袁该
结果同样在马铃薯中得到证实咱员远暂 遥 当木糖浓度为 缘早 辕
蕴时袁再生率最高渊员苑郾 缘源豫 冤袁但植株生长较弱曰当木糖
浓度为 员园早 辕 蕴时袁再生率虽略有降低渊员缘郾 圆缘豫 冤袁但植
株生长较为健壮遥 本研究还检测到当木糖浓度为 缘早 辕
蕴时袁再生苗的转基因阳性率为 远源豫 遥 表明随着木糖
苑源源
允燥怎则灶葬造 燥枣 晕怎糟造藻葬则 粤早则蚤糟怎造贼怎则葬造 杂糟蚤藻灶糟藻泽
圆园员圆袁圆远渊猿冤院园源源源 耀 园源源愿
图 苑摇 员园早 辕 蕴木糖浓度筛选的转基因花生的 孕悦砸检测
云蚤早援 苑摇 孕悦砸 葬皂责造蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶 则藻泽怎造贼泽 燥枣 贼则葬灶泽早藻灶蚤糟 责造葬灶贼泽 泽糟则藻藻灶藻凿 遭赠 员园早 辕 蕴 曾赠造燥泽藻
酝院 阅蕴圆园园园 皂葬则噪藻则曰员院水对照曰圆院非转基因植株曰猿 耀 圆源院转基因植株
酝院 阅蕴圆园园园 皂葬则噪藻则曰 员院 憎葬贼藻则 糟燥灶贼则燥造曰 圆院 灶燥灶 贼则葬灶泽早藻灶蚤糟 责造葬灶贼泽曰 猿 耀 圆源院 贼则葬灶泽早藻灶蚤糟 责造葬灶贼泽
图 愿摇 转基因再生苗田间生长渊粤冤袁
开花及果针生长渊月冤情况
云蚤早援 愿摇 郧则燥憎贼澡 燥枣 泽藻藻凿造蚤灶早袁 枣造燥憎藻则 葬灶凿 枣则怎蚤贼
灶藻藻凿造藻 燥枣 贼则葬灶泽早藻灶蚤糟 责造葬灶贼泽 蚤灶 贼澡藻 枣蚤藻造凿
筛选浓度的升高袁转基因阳性率表现为上升趋势遥 在
烟草木糖筛选体系中表现同样结果袁当木糖浓度从
员园早 辕 蕴升高到 圆园早 辕 蕴时袁转基因阳性率从 远郾 苑豫提高到
员猿郾 猿豫 咱员员暂 遥 这表明高浓度的木糖有利于转基因阳性
苗的筛选袁但不利于植物的生长遥 所以在不同的作物
中需要探索既利于筛选袁又不会对植物生长产生明显
不良效应的蔗糖 辕木糖浓度比遥 本研究确定了花生遗
传转化过程中适宜的浓度配比为 缘早 辕 蕴 蔗糖和 员园早 辕 蕴
木糖遥 经转化得到的转基因植株阳性率高达
苑苑郾 圆苑豫 袁嫁接移栽田间后植株生长尧开花及下针结实
均表现正常袁因此木糖异构酶基因可以作为筛选标记
基因用于花生的遗传转化遥
本研究还检测到利用潮霉素筛选 责悦粤酝月陨粤员猿园员
转化植株袁转基因阳性率不足 苑豫 袁这表明利用木糖筛
选体系得到的转基因阳性率远高于抗生素筛选体系袁
这与 匀葬造凿则怎责等在马铃薯中报道的木糖筛选体系的转
基因阳性率是抗生素筛选的 怨 倍相吻合咱员员暂 遥 并且木
糖异构酶在食品工业被普遍认为是安全的袁在基因遗
传转化过程中也被认为是一种安全的筛选标记咱源袁员远暂 遥
本研究首次在花生中建立了适宜的木糖筛选体系袁相
对于正常的花生胚小叶再生体系袁该木糖筛选体系还
存在一些不足袁譬如体胚诱导率低袁分化率低袁以及转
基因植株生长矮小缓慢袁再生周期长等问题遥 这些都
需要进一步对培养条件进行优化袁比如木糖浓度的进
一步细化袁圆袁源鄄阅以及 远鄄月粤浓度的摸索以及培养方法
的进一步改进遥 此外还可对木糖异构酶基因植物表达
载体进行改造袁如增强启动子的驱动效率以提高木糖
异构酶的表达活性袁进而提高转基因作物利用木糖的
效率遥
参考文献院
咱 员 暂摇 李文凤袁季 静袁王 罡袁王海勇袁牛宝龙援 提高转基因植物标记基
因安全性策略的研究进展咱 允暂 援 中国农业科学袁圆园员园袁源猿 渊怨冤院
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咱 圆 暂摇 赵摇 艳援 植物转化中的安全标记基因咱 允暂 援 生物化学与生物物
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咱 猿 暂摇 杨英军袁周 鹏援 转基因植物中的标记基因研究新进展咱 允暂 援 遗
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特异位点重组系统获得无选择标记转 粤贼酝再月员圆 基因的马铃薯
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渊责任编辑摇 王媛媛冤
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对花生胚小叶体细胞胚胎发生的影响咱 允暂 援 核农学报袁圆园员员袁 圆缘
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咱员圆暂摇 张力凡袁王 斌袁盖伟玲袁王晓杰袁乔利仙援 农杆菌介导的几丁质酶
基因转化花生的研究咱 允暂 援 青岛农业大学学报渊自然科学版冤袁
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咱员猿暂摇 郝世俊袁隋炯明袁乔利仙袁王晓杰袁王晶珊援 花生组培苗嫁接技术
的研究咱允暂 援 青岛农业大学学报渊自然科学版冤袁圆园员园袁 圆苑渊圆冤院
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咱员源暂摇 郭新梅袁张晓东袁梁荣奇袁张立全袁陈耀锋援 以木糖异构酶基因为
筛选标记的玉米遗传转化咱 允暂 援 植物生理与分子生物学学报袁
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