全 文 ：第6卷第5期
2008年9月
生物加工过程
ChineseJournalofBioprocessEngineering
Sep．2008
· 27·
水产废弃物胶原蛋白的提取
曾 嵘1，杨忠华2，王 玉2，韩 雪2，李 伟2，刘 涛2
(1．湖北大学 化学化工学院，武汉430062；2．武汉科技大学化工学院，武汉430081)
摘要：以水产废弃物为原料，利用酶法提取有价值的胶原蛋白。以胃蛋白酶为胶原蛋白提取周酶，鱼鳍和鱼鳞作
为提取的原料，提取工艺为原料粉碎、脱钙、提取、纯化。鱼鳞和鱼鳍的胶原蛋白提取率分别达8．1％和6．6％。该
方法对提高水产废弃物的综合利用具有重要的意义。
关键词：胶原蛋白；提取；水产废弃物
中图分类号：TQ936．1 文献标志码：A 文章编号：1672—3678(2008)05—0027—04
Extractionofc llagenfromfishprocessingwastes
ZENGRon91，YANGZhong．hua2，WANGYu2，HANXue2，LIWei2，LIUTa02
(1．CollegeofCh mistryandChemicalEngineering，HubeiUniversity，Wuhan430062，China；
2．CollegeofChemicalSaganeefingandTechnology，WuhanUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430081，China)
Abstract：CollageniStheproteininconnectivetissueofvitalstructure．Itwaswidelyusedinmedicine．
health，foodprocessing，cosmetics，etc．fields．Thecollagenwasextractedfromgrasscarprocessing
wastesincludingscaleandfinswithacids．Enzymaticextractionmethodsinthepepsinwereemployed．
Theprocesswama&bypulverization，meshing，demineralization，andxtraction．Underop malcondi—
tions，theyieldsofcollagenfromscaleandfinsreached8．1％and6．6％．respectively．
Keywords：collagen；extraction；fishwaste
胶原蛋白是结缔组织中极其重要的一种结构
蛋白，是动物体内含量最多、分布最广、具有免疫学
性质的蛋白质u≈j，可广泛应用于医药、保健、食品
加工、化妆品等领域。最近，国外研究表明，胶原水
解所得的胶原多肽不仅具有很好的消化特性，而且
还具有许多生理活性功能，已引起研究人员的广泛
兴趣旧J。长期以来，人们都是使用猪、牛的皮和骨，
以及禽类组织提取胶原蛋白和明胶。其提取方法
主要有碱法、酸法、酶法和热处理等方法。但因疯
牛病、口蹄疫、禽流感等疾病的爆发，使人们对牲畜
与禽类胶原制品安全性产生疑虑。另外，由于宗教
和习俗等原因，有些地区也不能使用牲畜胶原蛋白
制品。因此，寻找胶原蛋白的新来源显得愈来愈迫
切。水产动物尤其是其加工废弃物——皮、骨、鳞
中含有丰富的胶原蛋白，具有开发利用价值[4。]。
当前这些水产废弃物没有得到很好的利用，大部分
直接排放到环境中去，产生环境污染问题。对此进
行开发可以变废为宝，达到综合利用的目的，此开
发具有重要的应用前景，也具有重要的社会与经济
意义。
鉴于此，本工作以酸、碱、酶以及酸酶结合法从
鱼鳍和鱼鳞等水产废弃物中提取胶原蛋白，以探索
收稿日期：2008-02-29
基金项目：武汉市青年科技晨光计划资助项目(200750731288)
作者简介：曾嵘(1977一)．士，湖南常德人，硕士．讲师，研究方向：天然产物。
联系人：杨惠华，剐教授，E—mail：yangdragon@wust．edu．crl
万方数据
· 28· 生物加工过程 第6卷第5期
水产废弃物的综合利用。
1材料与方法
1．1实验材料与试剂
1．1．1材料
新鲜草鱼鱼鳞、鱼鳍，取自当地市场。
1．1．2试剂
胃蛋白酶(酶活为3000U／g)，酶试剂，碧云天
生物技术研究所。化学试剂为市售分析纯。
1．2提取方法
基本提取步骤为：
水产废弃物一预处理一酶解提取(或酸提取)
_重复提取一透析一干燥。
1．2．1材料的预处理
将新鲜草鱼鱼鳞、鱼鳍用清水洗净，50℃烘干
备用。杂蛋白的去除和钙质的脱除直接影响着胶
原蛋白的提取效果。本实验分别用盐酸、乙酸和柠
檬酸进行脱钙处理，用NaOH去除杂蛋白。此外，材
料是否粉碎和粉碎的程度都对提取的效果有一定
的影响，故还对鱼鳞和鱼鳍分别做厂粉碎和未粉碎
的比较实验。
1．2．2胶原蛋白的提取
称取10g预处理后的材料进行提取。所有提
取过程中所用酶量均为10g／L胃蛋白酶。由于胃
蛋白酶的最适pH2—3，故需要酸性环境下进行提
取帕J。分别采用0．5mol／L乙酸、质量分数1％柠檬
酸作为提取介质。此外，采用了质量分数l％的盐
酸取胶原蛋白，与酶法进行对比。提取中利用磁力
搅拌器连续搅拌，使温度保持在4℃。提取液为
100mL，每个样品分两次提取，每次提取24h。
1．2．3胶原蛋白的纯化
由于胶原蛋白粗提液的颜色较深，且还有较大
的腥味。在胶原蛋白的粗提液中加入4g活性炭，
搅拌30min，以除色、除异味。
活性炭吸附后的胶原蛋白初提液经过滤后以
4500r／min离心20min，倾出上清液，加NaCI至最
终浓度为0．9mol／L，盐析过夜，4500r／min离心20
rain收集沉淀，沉淀用0．5mol／L乙酸溶解，重复盐
析和溶解操作1次[5]，得到的胶原蛋白溶液移人透
析袋，用蒸馏水透析3d，每天更换透析水2—3次。
以除去胶原蛋白中的无机离子，得到较纯的胶原
蛋白。
1．2．4提取效率计算
提取效率以提取率表示，计算公式如下：提取率=避篇铲x100％
1．3提取产物的鉴定
产物利用十二烷基磺酸钠．聚丙烯酰胺(SDS．
PAGE)凝胶电泳和傅立叶红外光谱来进行鉴定。
1．3．1SDS．PAGE凝胶电泳
质量分数7．5％分离胶，质量分数5％浓缩胶，
15止上样量，电压120V，考马斯亮蓝R笛。染色"。。
1．3．2傅立叶红外光谱
将一定量干燥后的KBr和冷冻干燥后的胶原
蛋白样品置于玛瑙研钵中，研磨均匀，尽量成粉末
状，装样，手动压片，取出样品小心轻放人样品室。
采用VERTEX70型170傅立叶变换红外光谱仪对
样品在400—4000cm一处扫描，扫描信号累加32
次，分辨率为8cm～。
2结果与讨论
2．1 提取结果
图l为提取得到的样品红外图谱。N—H伸缩振
动的吸收峰出现在3400—3440cm“处，但它以氢键
形成缔合体后，其峰将向低波数发生位移。由图1可
见，草鱼鱼鳞胶原蛋白的酰胺A出现在3410em～，
表明其N-H伸缩与氢键形成了缔合体。29 6cm。1
的弱吸收为酰胺B的C—N伸缩引起的特征吸收峰。
酰胺I带的特征吸收频率为1600—1700cm～，是由
蛋白多肽骨架的C—O伸缩引起，其吸收最强，常被
用于蛋白质的二级结构分析。鱼鳞胶原蛋白的酰胺I
带出现在1641cm。1处，较其他来源的胶原蛋白
1 650～l655cm“高。l480—1600em“为酰胺II
带的特征吸收频率，主要为胶原蛋白的C—N伸缩与
N—H弯曲的反映，鱼鳞胶原蛋白酰胺II带的特征吸
收为1452cm一处的强吸收。与文献图谱比较，所提
取的鱼鳞胶原蛋白和小牛腱I型胶原蛋白的红外图
谱基本一致旧1，由此可以进一步确定所提胶鱼鳞胶原
蛋白为I型胶原蛋白。
图2为本实验中不同样品的电泳谱带，谱带从左
到右依次为标准梯度蛋白(ProteinMarker)、样品1，
2，3，4，5，6，7。实验所用的标准梯度蛋白的相对分子
质量范围为1—2×105。胶原蛋白存在两条0【链(d1
和a2)与一条口链，仅l和以相对分子质量相近，在
万方数据
2008年9月 曾嵘等：水产废弃物胶原蛋白的提取 · 29·
1．1一1．2×105的范围中，口链的相对分子质量在2×
105左右，这与一般胶原蛋白相对分子质量相吻合。
∞ N
o 叼
寸 口
卜∞ln∞
一∞寸n
葛导葛g
4000350030002500200015001 000 500
刀cm—i
图1试样的红外图谱
Fig．1Fr—IRspectraoffishcollagenexperimentsample
图2试样的SDS．PAGE
Fig．2SDS-PAGEoffishcollagenexperimentsample
2．2提取条件的影响
各种提取条件下，提取的结果如表1所示。
表l 不同提取方法的提取产率
TableYieldfordifferentextractionmethods
2．2．1前处理对胶原蛋白提取的影响
鱼鳞中含有丰富的蛋白质和各种矿物质，其中
有机物质量分数占41％～55％，钙盐为38％-46％。
蛋白质主要为胶原蛋白和角蛋白。这样的组成使
得提取胶原蛋白前需要进行去除部分杂蛋白和
钙质。
由表1可知，经粉碎处理的样品1#的提取率明
显高于未经粉碎处理的样品2#的提取率，可见经粉
碎处理的样品更有利于原料的脱钙和胶原蛋白的
提取。样品3}≠、4#分别采用盐酸和乙酸脱钙，从表1
中可以看出盐酸的脱钙比乙酸脱钙效果要好。这
是因为盐酸的酸性较乙酸强，能够更好地去除鱼鳞
和鱼鳍中的无机物成分，以利于提取过程中胶原蛋
白的析出。
2．2．2提取介质的选择
传统的胶原蛋白提取介质为0．5mol／L乙酸，
本实验选用了质量分数1％的柠檬酸作为提取介质
与之进行比较，由表1可见，样品3#与样品5#tL较，
显示1％的柠檬酸作为提取介质的提取效果要优于
0．5mol／L的乙酸。这主要是在较长的提取时间下
酸|生较强的乙酸将部分高相对分子质量的胶原蛋
白分解为相对分子质量较低的产物，使得乙酸介质
的产率较低。
2．2．3鱼鳍与鱼鳞提取结果的比较
比较鱼鳍与鱼鳞的提取产率，发现他们的提取
产率差不多。比较盐析后的粗提蛋白，发现鱼鳍所
提取的粗蛋白颜色较深，还有较浓的鱼腥味。可
见，虽然鱼鳍和鱼鳞的提取产率相差不大，但是鱼
鳍的无机物含量较鱼鳞高，且颜色和腥味不易除
去，而鱼鳞具有胶原蛋白含量高、颜色淡、脂类含量
少、易粉碎等特点。因此，相比较而言鱼鳞是更优
良的胶原蛋白原料。
万方数据
·30· 生物加工过程 第6卷第5期
2．2．4酸、碱法提取与酸、酶结合提取的比较
比较盐析后的粗提蛋白，发现用l％的NaOH，
5％HCl和NaOH作提取介质几乎得不到粗提蛋白；
利用1％HCl进行提取，只能得到部分胶原蛋白。
可见，传统的酸、碱提取法产率较低，而且酸、碱的
浓度较难控制，浓度较大时容易将原料中的胶原蛋
白分解。然而酸酶结合提取法有较高的产率，且反
应条件较温和，蛋白结构不易被破坏。
3结论
提取中发现鱼鳍的无机物含量较鱼鳞高，且颜
色和腥味不易除去。提取工艺为样品粉碎，利用盐
酸脱钙，酶与柠檬酸结合提取，再进行进一步的纯
化。在较优的提取工艺条件下，鱼鳞和鱼鳍的胶原
蛋白提取收率分别达8．1％和6．6％
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马斯科马湖集团将在密歇根州建立纤维乙醇工厂
密歇根州州长JenniferGranholm和马斯科马湖集团公司(MascomaCorporation)CEOBruceJamerson日前
共同宣布马斯科马湖将在北密半岛建立它的第一个商业化规模运行的纤维乙醇工厂，该乙醇工厂采用先进
的联合生物工艺从非粮可再生植物中制取纤维乙醇。
密歇根经济发展组织(MEDC)和密歇根州立大学(MSU)以及密歇根科技大学(MTU)将帮助该乙醇工
厂的建立。
2008年欧盟生物柴油产能有望增长55％
据欧洲生物柴油局(EBB)发布的最新报告显示，2008年欧盟的生物柴油产能有望增长55％，达到
1．6×107t。
EBB的2008年统计数据显示，由于成员国没有稳定的生物柴油市场，所以目前仍有300万t的产能闲
置。虽然今年欧盟产量将增长17％，达到5．71X 06t，但是增幅要低于前几年的增幅。
去年生物柴油占到欧盟生物燃料消费的76％，而且仍是主要的生物燃料，以满足欧盟的生物燃料目标，
即到2020年生物燃料掺混率要达到10％。
(朱宏阳)
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