全 文 ：第 １３卷第 ４期
２０１５年 ７月
生　 物　 加　 工　 过　 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ􀆰 １３ Ｎｏ􀆰 ４
Ｊｕｌ􀆰 ２０１５
ｄｏｉ：１０􀆰 ３９６９ ／ ｊ􀆰 ｉｓｓｎ􀆰 １６７２－３６７８􀆰 ２０１５􀆰 ０４􀆰 ００８
收稿日期：２０１４－０４－１１
基金项目：江苏省普通高校研究生科研创新计划（ＣＸＺＺ１２＿０４４０）
作者简介：李　 亚（１９８３—），男，江苏邳州人，博士研究生，研究方向：酶固定化与酶催化；韩萍芳（联系人），教授，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｈｐｆ＠ ｎｊｔｅｃｈ．ｅｄｕ．ｃｎ
超声辅助酶促合成丙二酸单对硝基苄酯
李　 亚１，２，赵四方１，韩萍芳１
（１．南京工业大学 生物与制药工程学院，江苏 南京 ２１１８００；
２．南通科技职业学院 环境与资源系，江苏 南通 ２２６００７）
摘　 要：为了研究超声对固定化脂肪酶 Ｎｏｖｏｚｙｍ ４３５催化合成丙二酸单对硝基苄酯反应的影响。 对超声辅助酶促
酯化反应条件进行了优化，确定最佳反应条件：以甲苯为溶剂，固定化脂肪酶 Ｎｏｖｏｚｙｍ ４３５质量浓度为 ３􀆰 ０ ｇ ／ Ｌ，对
硝基苄醇质量浓度为 ４􀆰 ０ ｇ ／ Ｌ，反应温度为 ３０ ℃，反应时间为 ５ ｈ，超声声强为 ０􀆰 ８ Ｗ ／ ｃｍ２，超声频率为 ２０ ｋＨｚ，丙二
酸单对硝基苄酯收率为 ８９􀆰 ７％。 与振荡水浴条件相比，超声辅助酶催化反应能强化传质，在反应温度降低 １５ ℃，
时间缩短 ３ ｈ和固定化酶浓度减少 １􀆰 ５ ｇ ／ Ｌ的同时，产物收率增加了 １８􀆰 ２％。 超声作用下，Ｎｏｖｏｚｙｍ ４３５ 重复使用
性能较佳，应用于酯化反应 ８次后，丙二酸单对硝基苄酯收率为 ６９􀆰 ３％。
关键词：超声；固定化脂肪酶；酯化反应；丙二酸单对硝基苄酯
中图分类号：Ｏ６２３　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２－３６７８（２０１５）０４－００４２－０５
Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｍｏｎｏ⁃ｐ⁃ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｙｌ ｍａｌｏｎａｔｅ ｂｙ ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ⁃ａｓｓｉｓｔｅｄ
ｌｉｐａｓｅ ｃａｔａｌｙｓｉｓ
ＬＩ Ｙａ１，２，ＺＨＡＯ Ｓｉｆａｎｇ１，ＨＡＮ Ｐｉｎｇｆａｎｇ１
（１． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｎａｎｊｉｎｇ Ｔｅｃｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ ２１１８００，Ｃｈｉｎａ；
２． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ａｎｄ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ，Ｎａｎｔｏｎｇ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｎａｎｔｏｎｇ ２２６００７，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｍｏｎｏ⁃ｐ⁃ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｙｌ ｍａｌｏｎａｔｅ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｌｉｐａｓｅ Ｎｏｖｏｚｙｍ ４３５ ａｓ
ｃａｔａｌｙｓｔ ｉｎ ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ ｗａｓ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ． Ｔｈｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ａｌｓｏ
ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｆｏｕｎｄ ｗｅｒｅ ｔｏｌｕｅｎｅ ｍｅｄｉｕｍ ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ ３􀆰 ０ ｇ ／ Ｌ ｏｆ Ｎｏｖｏｚｙｍ ４３５ ａｎｄ
４􀆰 ０ ｇ ／ Ｌ ｏｆ ４⁃ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ， ３０ ℃ ｆｏｒ ５ ｈ， ０􀆰 ８ Ｗ ／ ｃｍ２ ｏｆ ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ ａｎｄ ２０ ｋＨｚ ｏｆ
ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ． Ｕｎｄｅｒ ａｂｏｖｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，ｔｈｅ ｙｉｅｌｄ ｏｆ ｍｏｎｏ⁃ｐ⁃ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｙｌ ｍａｌｏｎａｔｅ ｒｅａｃｈｅｄ ８９􀆰 ７％．
Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈａｔ ｉｎ ｓｈａｋｉｎｇ ｂａｔｈ，ｔｈｅ ｙｉｅｌｄ ｏｆ ｍｏｎｏ⁃ｐ⁃ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｙｌ ｍａｌｏｎａｔｅ ｗａｓ ｉｍｐｒｏｖｅｄ １８􀆰 ２％ ｉｎ
ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ ｓｔｒｅｎｇｔｈｅｎｉｎｇ ｍａｓｓ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｗｈｅｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ａｂｏｕｔ １５ ℃，ｒｅａｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ
ｓｈｏｒｔｅｎｅｄ ３ ｈ ａｎｄ Ｎｏｖｏｚｙｍ ４３５ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｒｅｄｕｃｅｄ １􀆰 ５ ｇ ／ Ｌ． Ｎｏｖｏｚｙｍ ４３５ ｅｘｈｉｂｉｔｅｄ ｅｘｃｅｌｌｅｎｔ
ｒｅｕｓａｂｉｌｉｔｙ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ． Ｔｈｅ ｙｉｅｌｄ ｏｆ ｍｏｎｏ⁃ｐ⁃ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｙｌ ｍａｌｏｎａｔｅ ｃａｎ ｒｅａｃｈ
６９􀆰 ３％ ａｆｔｅｒ ８ ｒｅｕｓｅｓ ｏｆ Ｎｏｖｏｚｙｍ ４３５．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ； ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｌｉｐａｓｅ； ｅｓｔｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ； ｍｏｎｏ⁃ｐ⁃ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｙｌ ｍａｌｏｎａｔｅ
　 　 丙二酸单对硝基苄酯是一种重要的生物医药 中间体，目前该物质主要采用化学方法合成，如由
＼ ＼ＤＺ１９ ＼Ｄ ＼孙桂云 ＼生物加工 ２０１５ ＼第 ４期 ＼第 ４期．ＰＳ　 ４校样　 排版：孙桂云　 修改日期：２０１５ ／ ０７ ／ ０８
丙二酸和对硝基苄醇经过酯化、碱酸调和及精制等
步骤制得［１－２］；或在丙二酸存在条件下，催化丙二酸
双酯水解得到［３］。 这些反应过程具有原料成本高，
反应能耗大，后处理程序复杂，产品纯度较低等缺
点，且易造成环境污染。 酶催化技术，尤其是以固
定化脂肪酶为催化剂直接催化酯化反应可以有效
解决这些问题。 固定化脂肪酶具有稳定性高、易与
底物及产物分离、可重复利用、提高脂肪酶的利用
效率、降低反应成本等众多优点，在生命科学、生物
医学、食品科学、化学化工及环境科学等领域得到
广泛应用［４ ８］。 然而，固定化脂肪酶催化酯化反应
为非均相反应，液态底物容易在固定化脂肪酶颗粒
表面形成边界层，液相主体中的反应底物必须穿过
边界层才能到达固定化脂肪酶分子表面，因而强化
底物与固定化脂肪酶、底物与底物之间的传质是提
升反应速率的关键。
朱凯等［９］和 Ｌｉｕ 等［１０］研究发现超声是一种增
强传质作用的有效手段，有助于提升酶促反应速
率。 在固定化脂肪酶催化酯化反应中引入超声，一
方面有利于底物由液相主体传递到酶分子活性中
心及产物的脱离，另一方面可以加速底物的溶
解［１１］。 彭杨等［１２］研究发现超声会影响脂肪酶的稳
定性。
笔者将超声应用于固定化脂肪酶 Ｎｏｖｏｚｙｍ ４３５
催化合成丙二酸单对硝基苄酯反应，考察超声固定
化脂肪酶协同作用对酯化反应的影响，对超声辅助
Ｎｏｖｏｚｙｍ ４３５催化合成丙二酸单对硝基苄酯反应条
件进行优化，并与常规恒温振荡水浴方式下的实验
结果进行对比，以期为合成丙二酸单对硝基苄酯提
供新的思路。
１　 材料与方法
１􀆰 １　 材料
１􀆰 １􀆰 １　 试剂与仪器
Ｎｏｖｏｚｙｍ ４３５固定化脂肪酶（ＢＲ），南京奥多福
尼生物技术有限责任公司；丙二酸（ＡＲ）、对硝基苄
醇（ＡＲ）、甲苯（ＡＲ）、甲醇（色谱纯），国药集团化学
试剂有限公司；实验用水为自制去离子水。
１􀆰 １􀆰 ２　 实验仪器
ＣＳ ３ 型水听器，中科院声学研究所；ＤＧＣＩ
１２００型超声处理器（含换能器），无锡德嘉电子有限
公司；ＨＮ 型超声波发生器，无锡市华能超声电子有
限公司； ＳＲ８ 型示波器，江苏扬中电子仪器厂；
ＤＳＨＺ ３００Ａ型旋转式恒温振荡器，太仓实验设备
有限公司；Ｓｕｍｍｉｔ高效液相色谱仪，美国戴安公司。
１􀆰 ２　 实验方法
１􀆰 ２􀆰 １　 丙二酸单对硝基苄酯含量测定
采用高效液相色谱法测定丙二酸单对硝基苄
酯含量，具体分析条件为采用 Ａｌｌｔｅｃｈ Ｃ１８ 色谱柱，
柱温为 ４０ ℃，紫外检测器波长 ２５４ ｎｍ，以 ０􀆰 ０２
ｍｏｌ ／ Ｌ甲醇 磷酸缓冲溶液（体积比 ７ ∶ ３）为流动相，
流速为 ０􀆰 ６ ｍＬ ／ ｍｉｎ，取样量为 ２０ μＬ［１３］。
１􀆰 ２􀆰 ２　 丙二酸单对硝基苄酯收率计算
丙二酸单对硝基苄酯的收率计算见式（１）。
ｙ ＝ ｎ
Ｎ
× １００％ （１）
式中：ｎ为实际得到丙二酸单对硝基苄酯的物质的
量，ｍｍｏｌ；Ｎ为理论丙二酸单对硝基苄酯的物质的
量（以对硝基苄醇加入量计），ｍｍｏｌ。
１􀆰 ２􀆰 ３　 反应时间和温度对酶促合成丙二酸单对硝
基苄酯的影响
在 １００ ｍＬ三角瓶中加入 ０􀆰 ４ ｇ Ｎｏｖｏｚｙｍ ４３５，振
荡使酶分散均匀。 快速加入 ０􀆰 ５ ｇ 对硝基苄醇和
０􀆰 ３４ ｇ丙二酸及一定体积甲苯溶剂，分别置于振荡
水浴（１８０ ｒ ／ ｍｉｎ）或连续作用的超声反应器（声强为
０􀆰 ５ Ｗ ／ ｃｍ２）中反应，考察反应时间和温度对丙二酸
单对硝基苄酯收率的影响。
１􀆰 ２􀆰 ４　 底物浓度和 Ｎｏｖｏｚｙｍ ４３５ 浓度对酶促合成
丙二酸单对硝基苄酯的影响
分别在超声声强 ０􀆰 ５ Ｗ ／ ｃｍ２、频率 ２０ ｋＨｚ、温度
３０ ℃、反应时间 ５ ｈ作用下和温度 ４５ ℃、反应时间
８ ｈ的振荡水浴中考察对硝基苄醇浓度和 Ｎｏｖｏｚｙｍ
４３５浓度对丙二酸单对硝基苄酯收率的影响。
１􀆰 ２􀆰 ５　 超声对酶促合成丙二酸单对硝基苄酯的
影响
在 ３􀆰 ０ ｇ ／ Ｌ Ｎｏｖｏｚｙｍ ４３５、４􀆰 ０ ｇ ／ Ｌ 对硝基苄醇、
反应时间为 ５ ｈ、反应温度为 ３０ ℃条件下，考察超声
对丙二酸单对硝基苄酯收率和 Ｎｏｖｏｚｙｍ ４３５ 重复使
用性能的影响。
２　 结果与讨论
２􀆰 １　 反应时间对丙二酸单对硝基苄酯收率的影响
考察振荡水浴和超声作用时反应时间对丙二
酸单对硝基苄酯收率的影响，结果如图 １ 所示。 由
图 １可知：在 ２５ ℃的振荡水浴中，产物丙二酸单对
硝基苄酯收率随着时间延长而增加，反应 ８ ｈ 趋于
３４　 第 ４期 李　 亚等：超声辅助酶促合成丙二酸单对硝基苄酯
＼ ＼ＤＺ１９ ＼Ｄ ＼孙桂云 ＼生物加工 ２０１５ ＼第 ４期 ＼第 ４期．ＰＳ　 ４校样　 排版：孙桂云　 修改日期：２０１５ ／ ０７ ／ ０８
稳定，最大收率为 ３８􀆰 ７％。 超声作用下和振荡水浴
中，产物丙二酸单对硝基苄酯收率随时间变化趋势
基本相同。 但与振动水浴相比，超声作用下反应 ５ ｈ
即达到平衡，最大收率为 ６２􀆰 ３％，提升产物收率的
同时，有效缩短了反应时间。
图 １　 反应时间对丙二酸单对硝基苄酯收率的影响
Ｆｉｇ􀆰 １　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｉｍｅ ｏｎ ｍｏｎｏ⁃ｐ⁃ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｙｌ
ｍａｌｏｎａｔｅ ｙｉｅｌｄ
图 ２　 温度对丙二酸单对硝基苄酯收率的影响
Ｆｉｇ􀆰 ２　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｎ ｍｏｎｏ⁃ｐ⁃ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｙｌ
ｍａｌｏｎａｔｅ ｙｉｅｌｄ
２􀆰 ２　 反应温度对丙二酸单对硝基苄酯收率影响结果
温度是影响化学反应的重要因素，温度升高有
利于加速反应，但是在酶催化反应中，温度过高会
导致酶变性失活。 考察振荡水浴和超声辐照条件
下，反应温度对丙二酸单对硝基苄酯收率的影响，
结果如图 ２所示。 由图 ２ 可知：在振荡水浴中和超
声作用下，最佳反应温度分别为 ４５ 和 ３０ ℃。 这是
因为脂肪酶对温度较为敏感，低温不利于酶活的发
挥，产物收率较小；高温致使脂肪酶失活，产物收率
下降较明显。 在超声辅助条件下，当温度超过 ４０ ℃
时，丙二酸单对硝基苄酯收率下降较为显著。 这可
能是因为高温条件利于超声空化作用的发生，剧烈
的空化作用破坏了脂肪酶的空间构象，导致其催化
活力下降，产物收率降低［１４］。 因此，后续超声辅助
酶促酯化反应都在 ３０ ℃下进行。
２􀆰 ３　 对硝基苄醇浓度对丙二酸单对硝基苄酯收率
影响
　 　 在对硝基苄醇和丙二酸摩尔比为 １ ∶ １、４􀆰 ０ ｇ ／ Ｌ
Ｎｏｖｏｚｙｍ ４３５条件下，考察超声作用下和振荡水浴中
底物对硝基苄醇浓度对酶促酯化反应的影响，结果
如图 ３所示。 由图 ３可知：在振荡水浴中，当对硝基
苄醇质量浓度为 ６􀆰 ０ ｇ ／ Ｌ 时，丙二酸单对硝基苄酯
收率达到最大值 ６２􀆰 ４％。 刘辉等［１５］研究表明，对硝
基苄醇对酶促酯化反应有促进作用，而酸对酶促酯
化反应起抑制作用。 因醇酸摩尔比固定，增加对硝
基苄醇浓度，丙二酸浓度随之增大，过高浓度的丙
二酸降低反应体系的 ｐＨ，导致脂肪酶的活性降低，
抑制酶促反应的进行，丙二酸单对硝基苄酯收率降
低。 在超声辅助酶促酯化反应过程中，对硝基苄醇
质量浓度为 ４􀆰 ０ ｇ ／ Ｌ 时，产物丙二酸单对硝基苄酯
收率达到最大值 ７８􀆰 １％，超声有效强化了传质，增
加了底物之间及底物与酶的接触几率，进而增加了
反应速率，且丙二酸浓度相对较低，对反应抑制作
用较弱，因此产物收率相对较高。
图 ３　 对硝基苄醇浓度对丙二酸单对硝基苄酯收率的影响
Ｆｉｇ􀆰 ３　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ４⁃ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
ｏｎ ｍｏｎｏ⁃ｐ⁃ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｙｌ ｍａｌｏｎａｔｅ ｙｉｅｌｄ
２􀆰 ４　 Ｎｏｖｏｚｙｍ ４３５用量对丙二酸单对硝基苄酯收
率的影响
　 　 作为酯化反应的催化剂，脂肪酶浓度是影响酶
促反应的关键因素。 增大脂肪酶浓度，即增大酶的
活性位点与底物接触的几率，因此产物收率增大。
但是，固定化酶价格相对较高，因此在酶促酯化反
应中需综合考虑其成本。 对超声辅助和振荡水浴
中酶促酯化反应的催化剂 Ｎｏｖｏｚｙｍ ４３５ 浓度进行了
优化，结果见图 ４。 由图 ４可知：在振荡水浴中和超
声作用下，Ｎｏｖｏｚｙｍ ４３５质量浓度分别为 ４􀆰 ５ 和 ３􀆰 ０
ｇ ／ Ｌ时，丙二酸单对硝基苄酯收率达到稳定。 说明
该浓度下的固定化脂肪酶分子周围的底物浓度已
４４ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷　
＼ ＼ＤＺ１９ ＼Ｄ ＼孙桂云 ＼生物加工 ２０１５ ＼第 ４期 ＼第 ４期．ＰＳ　 ４校样　 排版：孙桂云　 修改日期：２０１５ ／ ０７ ／ ０８
达到平衡，继续增加其浓度，对反应平衡影响较小；
超声作用的传质效果高于振荡作用，有效增大了酶
与底物的接触几率，因而在提升产物收率的同时减
少了脂肪酶用量，节约了反应成本。
图 ４　 Ｎｏｖｏｚｙｍ ４３５浓度对丙二酸单对硝基苄酯收率的影响
Ｆｉｇ􀆰 ４　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｎｏｖｏｚｙｍ ４３５ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｎ
ｍｏｎｏ⁃ｐ⁃ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｙｌ ｍａｌｏｎａｔｅ ｙｉｅｌｄ
图 ５　 超声频率对丙二酸单对硝基苄酯收率的影响
Ｆｉｇ􀆰 ５　 Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｏｎ
ｍｏｎｏ⁃ｐ⁃ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｙｌ ｍａｌｏｎａｔｅ ｙｉｅｌｄ
２􀆰 ５　 超声频率对丙二酸单对硝基苄酯收率的影响
Ｅｎｔｅｚａｒｉ等［１６］研究认为，改变超声频率会改变
稳态空化泡，超声振动过程产生的辐射压力和微射
流会对脂肪酶分子和酶促化学反应产生影响。 在
超声声强为 ０􀆰 ５ Ｗ ／ ｃｍ２时，考察超声频率对酶促酯
化反应的影响，结果见图 ５。 由图 ５ 可知：超声频率
较低时，丙二酸对硝基苄酯收率较高，２０ 和 ２４ ｋＨｚ
的超声作用下酶促酯化反应产物收率分别为
７７􀆰 １％和 ８１􀆰 ６％。 超声频率高于 ２８ ｋＨｚ，产物收率
随超声频率的增加而减小。 这可能是因为频率增
加，超声空化气泡的存在周期缩短，空化核来不及
成长为空化泡；在低频超声作用下，空化泡的存在
周期较长，有利于脂肪酶分子形成活性更强的空间
构象，催化活力增强，产物丙二酸单对硝基苄酯的
收率较高［１７］。 从节约成本考虑，后续实验中选用
２０ ｋＨｚ超声。
２􀆰 ６　 超声声强对丙二酸单对硝基苄酯收率的影响
声强是超声酶促酶促酯化反应的重要影响因
素，超声强度低对反应过程传质促进作用小，超声
强度过高又会造成脂肪酶失活［１８－１９］。 考察超声强
度对 Ｎｏｖｏｚｙｍ ４３５ 催化酯化反应的影响，结果见图
６。 超声强度采用量热法测定［２０］，超声频率为 ２０
ｋＨｚ。 由图 ６ 可知：当超声声强小于 ０􀆰 ８ Ｗ ／ ｃｍ２时，
酯化产物丙二酸单对硝基苄酯的收率随着超声声
强的增加而迅速增大，超声声强为 ０􀆰 ８ Ｗ ／ ｃｍ２时达
到最大值 ８９􀆰 ７％，声强超过 ０􀆰 ８ Ｗ ／ ｃｍ２，产物收率降
低。 这可能是因为适宜强度的超声作用强化了传
质，阻止固定化脂肪酶分子周围形成水膜，加速酶
促反应。 但是，超声声强过高，剧烈的超声空化作
用会破坏脂肪酶分子的空间构象，导致脂肪酶蛋白
的变性失活［２１］，丙二酸单对硝基苄酯收率减小。
图 ６　 超声声强对丙二酸单对硝基苄酯收率的影响
Ｆｉｇ􀆰 ６　 Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ ｏｎ ｍｏｎｏ⁃ｐ⁃ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｙｌ
ｍａｌｏｎａｔｅ ｙｉｅｌｄ
此外，固定化脂肪酶价格昂贵，重复利用可以
降低酶促反应成本。 在超声辅助酶促反应最佳条
件下，重复使用 Ｎｏｖｏｚｙｍ ４３５ 催化合成丙二酸单对
硝基苄酯，考察超声对固定化脂肪酶重复使用性能
的影响，结果见图 ７。 由图 ７ 可知：Ｎｏｖｏｚｙｍ ４３５ 重
复使用 ８次后，丙二酸单对硝基苄酯收率仍可达到
６９􀆰 ３％，说明超声辅助作用于固定化脂肪酶催化合
成丙二酸单对硝基苄酯反应较为稳定。
３　 结论
研究了超声辐照作用下非水介质中固定化脂
肪酶 Ｎｏｖｏｚｙｍ ４３５催化促丙二酸和对硝基苄醇合成
丙二酸单对硝基苄酯的反应，考察了超声作用对酶
促酯化反应的影响，对超声作用下酶法合成反应条
件进行了优化，并与振荡水浴条件下的酶促反应结
果进行了对比。 当反应温度为 ３０ ℃、Ｎｏｖｏｚｙｍ ４３５
５４　 第 ４期 李　 亚等：超声辅助酶促合成丙二酸单对硝基苄酯
＼ ＼ＤＺ１９ ＼Ｄ ＼孙桂云 ＼生物加工 ２０１５ ＼第 ４期 ＼第 ４期．ＰＳ　 ４校样　 排版：孙桂云　 修改日期：２０１５ ／ ０７ ／ ０８
图 ７　 超声作用对固定化脂肪酶的重复使用性能的影响
Ｆｉｇ􀆰 ７　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｎ ｒｅｕｓａｂｉｌｉｔｙ
ｏｆ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｌｉｐａｓｅ
质量浓度为 ３􀆰 ０ ｇ ／ Ｌ时，对硝基苄醇质量浓度为 ４􀆰 ０
ｇ ／ Ｌ，底物摩尔比 １ ∶ １时，在频率为 ２０ ｋＨｚ、声强为
０􀆰 ８ Ｗ ／ ｍ２的超声作用下反应 ５ ｈ，产物丙二酸单对
硝基苄酯最大收率为 ８９􀆰 ７％。 与振荡水浴相比，温
度降低了 １５ ℃，时间缩短了 ３ ｈ，酶用量减少了 １􀆰 ５
ｇ ／ Ｌ，而产物收率增加了 １８􀆰 ２％。 超声作用下
Ｎｏｖｏｚｙｍ ４３５重复应用于酯化反应 ８次，产物收率仍
达到 ６９􀆰 ３％。
参考文献：
［ １ ］　 俞健钧，朱小飞，王德峰．一种培南类药物中间体丙二酸单对
硝基苄酯的生产方法：中国，１０２２７６４７６Ａ［Ｐ］．２０１１⁃１２⁃１４．
［ ２ ］ 　 Ｉｓｈｉｋｕｒａ Ｔ，Ｍａｔｓｕｙａｍａ Ｓ．Ｃｒｙｓｔａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｇｎｅｓｉｕｍ ｓａｌｔ ｏｆ
ｍｏｎｏ⁃ｐ⁃ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｙｌ ｍａｌｏｎａｔｅ ａｎｄ ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｔｈｅ ｓａｍｅ：
ＵＳ，５０８７７３４Ａ［Ｐ］．１９９２⁃０２⁃１１．
［ ３ ］ 　 Ｋｕｎｉｋａｔａ Ｋ．Ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｍｏｎｏ⁃ｐ⁃ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｙｌ ｍａｌｏｎａｔｅ：
ＵＳ，５５１６９３４Ａ［Ｐ］．１９９６⁃０５⁃１４．
［ ４ ］ 　 Ｈｕａｎｇ Ｊ， Ｌｉｕ Ｙ， Ｗａｎｇ Ｘ． Ｓｉｌａｎｉｚｅｄ ｐａｌｙｇｏｒｓｋｉｔｅ ｆｏｒ ｌｉｐａｓｅ
ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ［ Ｊ］ ． Ｊ Ｍｏｌ Ｃａｔａｌ Ｂ： Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ， ２００９， ５７ （ １ ）：
１０⁃１５．
［ ５ ］ 　 Ｌｉ Ｙ， Ｗａｎｇ Ｗ， Ｈａｎ Ｐ． Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｎｄｉｄａ ｓｐ． ９９⁃１２５
ｌｉｐａｓｅ ｏｎｔｏ ｓｉｌａｎｉｚｅｄ ＳＢＡ⁃１５ ｍｅｓｏｐｏｒｏｕｓ ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｂｙ ｐｈｙｓｉｃａｌ
ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ［Ｊ］ ．Ｋｏｒ Ｊ Ｃｈｅｍ Ｅｎｇ，２０１４，３１（１）：９８⁃１０３．
［ ６ ］ 　 Ｚｈｕ Ｋ，Ｗａｎｇ Ｊ， Ｗａｎｇ Ｙ， ｅｔ ａｌ． Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｒｅｔｉｎｙｌ ｐａｌｍｉｔａｔｅ
ｃａｔａｌｙｚｅｄ ｂｙ Ｃａｎｄｉｄａ ｓｐ． ９９⁃１２５ ｌｉｐａｓｅ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｏｎ ｆｉｂｅｒ⁃ｌｉｋｅ
ＳＢＡ⁃１５ ｍｅｓｏｐｏｒｏｕｓ ｍａｔｅｒｉａｌ［ Ｊ］ ． Ｊ Ｎａｎｏｓｃｉ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０１１，
１１（９）：７５９３⁃７６０２．
［ ７ ］ 　 Ｙｉｎ Ｃ，Ｌｉｕ Ｔ，Ｔａｎ Ｔ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｖｉｔａｍｉｎ Ａ ｅｓｔｅｒｓ ｂｙ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ
Ｃａｎｄｉｄａ ｓｐ． ｌｉｐａｓｅ ｉｎ ｏｒｇａｎｉｃ ｍｅｄｉａ［Ｊ］ ．Ｃｈｉｎ Ｊ Ｃｈｅｍ Ｅｎｇ，２００６，
１４（１）：８１⁃８６．
［ ８ ］ 　 胡集铖，王欢，李亚，等．γ Ｆｅ２Ｏ３ 凹土超顺磁性纳米复合材
料固载猪胰脂肪酶［Ｊ］ ．生物加工过程，２０１４，１２（２）：１２⁃１６．
［ ９ ］ 　 朱凯，张文娟，韩萍芳，等．超声酶促维生素 Ａ 棕榈酸酯反应
的动力学［Ｊ］ ．南京工业大学学报：自然科学版，２０１１，３３（３）：
５３⁃５７．
［１０］ 　 Ｌｉｕ Ｙ，Ｊｉｎ Ｑ，Ｓｈａｎ Ｌ，ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ ｏｎ ｌｉｐａｓｅ⁃
ｃａｔａｌｙｚｅｄ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｏｆ ｓｏｙ ｏｉｌ ｉｎ ｓｏｌｖｅｎｔ⁃ｆｒｅｅ ｓｙｓｔｅｍ［Ｊ］ ．Ｕｌｔｒａｓｏｎ
Ｓｏｎｏｃｈｅｍ，２００８，１８（４）：４０２⁃４０７．
［１１］ 　 朱国辉，黄卓烈，丘泰球，等．功率超声对酶促反应的影响［ Ｊ］ ．
应用声学，２００１，２０（４）：４５⁃４８．
［１２］ 　 彭杨，穆青，魏微，等．超声辅助脂肪酶催化 Ｌ 抗坏血酸脂肪
酶酯的合成［Ｊ］ ．食品科学，２０１１，３２（１２）：１０１⁃１０５．
［１３］ 　 胡海洋，姜权，郭灿城．高效液相色谱法分析对硝基甲苯氧化
产物［ Ｊ］ ．湖南城市学院学报：自然科学版，２００６，１５ （ ２）：
６０⁃６１．
［１４］ 　 Ｂｒａｇｉｎｓｋａｙａ Ｆ Ｉ，Ｚａｉｔｚｅｖａ Ｅ Ａ，Ｚｏｒｉｎａ Ｏ Ｍ，ｅｔ ａｌ． Ｌｏｗ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ
ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｙｅａｓｔ ｈｅｘｏｋｉｎａｓｅ［Ｊ］ ． Ｒａｄｉａｔ Ｅｎｖｉｒｏｎ
Ｂｉｏｐｈｙｓ，１９９０，２９（１）：４７⁃５６．
［１５］ 　 刘辉，朱凯，王伟，等．酶法制备一氯乙酸对硝基苄酯及催化
反应动力学模型 ［ Ｊ］ ．高校化学工程学报， ２０１２， ２６ （ ２）：
２７２⁃２７８．
［１６］ 　 Ｅｎｔｅｚａｒｉ Ｍ Ｈ， Ｋｒｕｕｓ Ｐ． Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｏｎ ｓｏｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ
ｒｅａｃｔｉｏｎｓ：Ｉ． ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｏｄｉｄｅ［ Ｊ］ ．Ｕｌｔｒａｓｏｎ Ｓｏｎｏｃｈｅｍ，１９９４，１
（２）：７５⁃７９．
［１７］ 　 钱卫卫，韩萍芳，吕效平．超声作用下 ＫＦ ／ ＣａＯ 催化酯交换反
应制备生物柴油［Ｊ］ ．燃料化学学报，２０１０，３８（１）：５２⁃５６．
［１８］ 　 Ｘｉａｏ Ｙ Ｍ，Ｗｕ Ｑ，Ｃａｉ Ｙ，ｅｔ ａｌ．Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ⁃ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ
ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｓｕｇａｒ ｅｓｔｅｒｓ ｉｎ ｎｏｎａｑｕｅｏｕｓ ｓｏｌｖｅｎｔｓ ［ Ｊ］ ． Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ
Ｒｅｓ，２００５，３４０（１３）：２０９７⁃２１０３．
［１９］ 　 Ｂｒａｃｅｙ Ｅ，Ｓｔｅｎｎｉｎｇ Ｒ Ａ，Ｂｒｏｏｋｅｒ Ｂ Ｅ．Ｒｅｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｍｉｃｒｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅ
ｏｆ ｅｎｚｙｍｅ ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎｓ ｉｎ ｏｒｇａｎｉｃ ｓｏｌｖｅｎｔｓ ｔｏ ｔｈｅｉｒ ｋｉｎｅｔｉｃ ｂｅｈａｖｉｏｒ
［Ｊ］ ．Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ Ｔｅｃｈｎｏｌ，１９９８，２２（３）：１４７⁃１５１．
［２０］ 　 Ｔｉａｎ Ｚ Ｍ，Ｗａｎ Ｍ Ｘ，Ｗａｎｇ Ｓ Ｐ，ｅｔ ａｌ． Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ ａｎｄ
ａｄｄｉｔｉｖｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｒｙｐｓｉｎ ［ Ｊ］ ． Ｕｌｔｒａｓｏｎ
Ｓｏｎｏｃｈｅｍ，２００４，１１（６）：３９９⁃４０４．
［２１］ 　 Ｇｅｂｉｃｋａ Ｌ，Ｇｅｋｉｃｋｉ Ｊ Ｌ．Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ ｏｎ ｈｅｍｅ ｅｎｚｙｍｅｓ
ｉｎ ａｑｕｅｏｕｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ［Ｊ］ ．Ｊ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ，１９９７，１２
（２）：１３３⁃１４１．
（责任编辑　 荀志金）
６４ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷　
＼ ＼ＤＺ１９ ＼Ｄ ＼孙桂云 ＼生物加工 ２０１５ ＼第 ４期 ＼第 ４期．ＰＳ　 ４校样　 排版：孙桂云　 修改日期：２０１５ ／ ０７ ／ ０８