全 文 ：第７卷第４期
２００９年７月
生　物　加　工　过　程
ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｐｒｏｃｅｓｓＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ．７Ｎｏ．４
Ｊｕｌｙ２００９
ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１７６２－３６７８．２００９．０４．００７
收稿日期：２００８－１２－０１
基金项目：国家自然科学基金资助项目（２０６３６０１０，２０８７６０１１）；国家高技术研究发展计划（８６３计划）资助项目（２００６ＡＡ０２Ｚ２４５，２００７ＡＡ１００４０４）
作者简介：刘骥翔（１９８４—），男，山西运城人，硕士研究生，研究方向：生物化工；谭天伟（联系人），教授，Ｅｍａｉｌ：ｔｗｔａｎ＠ｍａｉｌ．ｂｕｃｔ．ｅｄｕ．ｃｎ
离子交换层析纯化透明质酸
刘骥翔，叶　华，苏海佳，谭天伟
（北京化工大学　生命科学与技术学院，北京 １０００２９）
摘　要：考察６种离子交换树脂的静态吸附解析效果，选出２０１７阴离子交换树脂填柱，确定洗脱流速为０６
ｍＬ／ｍｉｎ，４０ｍＬ０３ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ和５０ｍＬ０５ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ双浓度洗脱，实现透明质酸和杂蛋白的分离。制得透明质
酸产品蛋白含量为００５７％，葡萄糖醛酸含量为４３％，平均相对分子质量大于１１×１０６，收率为５４％，符合医用级
透明质酸行业标准的要求。
关键词：离子交换层析；纯化；透明质酸
中图分类号：Ｑ５３９　　　　文献标志码：Ａ　　　　文章编号：１６７２－３６７８（２００９）０４－００３２－０４
Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｈｙａｌｕｒｏｎｉｃａｃｉｄｂｙｉｏｎｅｘｃｈａｎｇｅｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ
ＬＩＵＪｉｘｉａｎｇ，ＹＥＨｕａ，ＳＵＨａｉｊｉａ，ＴＡＮＴｉａｎｗｅｉ
（ＣｏｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＢｅｉｊｉｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＣｈｅｍｉｃａｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００２９，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙｍｅｔｈｏｄｗａｓｄｅｖｅｌｏｐｅｄｔｏｐｕｒｉｆｙｈｙａｌｕｒｏｎｉｃａｃｉｄ（ＨＡ）ｏｆｍｅｄｉｃａｌｕｓａｇｅ．
Ｓｔｒｏｎｇａｃｉｄｉｃｃａｔｉｏｎｅｘｃｈａｎｇｅｒｅｓｉｎ（ｂｒａｎｄ２０１７）ｗａｓｓｅｌｅｃｔｅｄｆｏｒｔｈｅｓｅｐａｒａｔｉｏｎ．Ｔｈｅｏｐｔｉｍａｌｅｌｕｔｅ
ｒａｔｅｗａｓ０．６ｍＬ／ｍｉｎ．Ｔｈｅｏｐｔｉｍａｌｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆｅｌｕｅｎｔｓｗｅｒｅ０３ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ，ａｎｄ０５ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ
ｗｉｔｈｔｈｅｏｐｔｉｍａｌｅｌｕｔｅｖｏｌｕｍｅｓｏｆ４０ｍＬａｎｄ５０ｍＬ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ＴｈｅｐｒｏｔｅｉｎｃｏｎｔｅｎｔｏｆｔｈｅｐｕｒｉｆｉｅｄＨＡ
ｗａｓ００５７％ ａｎｄｔｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔｗａｓｍｏｒｅｔｈａｎ１１×１０６．Ｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆｇｌｕｃｕｒｏｎｉｃａｃｉｄｗａｓ
４３％．ＴｈｅｙｉｅｌｄｏｆＨＡｒｅａｃｈｅｄ５４％．ＴｈｅｐｕｒｉｆｉｅｄＨＡｒｅａｃｈｅｄｔｈｅｉｎｄｕｓｔｒｙｓｔａｎｄａｒｄｏｆｍｅｄｉｃａｌＨＡ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｉｏｎｅｘｃｈａｎｇｅ；ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃａｃｉｄ
　　透明质酸（Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃａｃｉｄ，ＨＡ）是由 β Ｄ 葡
萄糖醛酸和Ｎ 乙酰基 Ｄ 氨基葡糖交替聚合而成
的高分子黏多糖。１９３４年，ＨＡ最先从牛眼玻璃体
中分离出来［１］。随着对ＨＡ的理化性质、生理功能、
合成与代谢等研究的深入，ＨＡ越来越广范应用于
医药领域［２］。
目前透明质酸分离纯化的方法主要有季铵盐法、
酶法、氯仿法和离子交换层析等方法。季铵盐法［３］得
到的产品蛋白含量高于０１％；氯仿法［４］过程操作复
杂，且氯仿对环境不友好；酶法容易引入新的杂蛋白；
倪杭生等［５］利用强离子交层析法得到产品虽然蛋白
含量低于０１％，但需要对树脂进行修饰。
本文选取常用的强碱型阴离子交换树脂填柱，
选用对后期酒精造粉有利的ＮａＣｌ作为洗脱剂，对动
态过程进行了优化。
１　材料与方法
１１　试剂与仪器
离子交换树脂 ００１７、Ｄ０７２、Ｄ１５２、２０１７、
Ｄ２０１、Ｄ３０１南开合成科技有限公司，透明质酸标品
Ｓｉｇｍａ公司，牛血清白蛋白（ＢＳＡ）北京欣经科生物
技术有限公司，透明质酸粗品 北京化工大学生物加
工过程实验室，卡马斯亮蓝 Ｓｉｍｐｓｏｎ公司。
离子交换柱（２５０×１０ｍｍ）上海华美实验仪器
有限公司，恒流泵 Ｓ ０５１４北京圣益通技术开发有
限责任公司，紫外吸收光谱（Ｖａｒｉａｎｃａｒｙ１００）、红外
吸收光谱（Ｖａｒｉａｎ３１００ＦＴＩＲ）Ｖａｒｉａｎ公司。
１２　实验方法
静态吸附解析：分别称取６种树脂１００ｇ加入
ＢＳＡ和ＨＡ标品溶液吸附、解析。
装柱：取６０～８０目目标树脂填充至离子交换
柱，柱高径比为２０∶１；上样：加入待过柱溶液，２倍柱
体积水洗；洗脱：利用恒流泵连续加入 ＮａＣｌ溶液洗
脱；取样：定时取样（提供时间间隔）；检测：分别在
２０６、２８０ｎｍ处测定ＨＡ和ＢＳＡ吸光度。
制备产品：收集洗脱液，经浓缩、沉淀、干燥等
过程得到产品，测定葡糖醛酸和蛋白质含量、ＨＡ相
对分子质量，得出红外与紫外吸收光谱图。
１３　检测方法
蛋白质含量测定：参照 Ｂｒａｄｆｏｒｄ法［６］，与 ＢＳＡ
对照品对照。
葡糖醛酸含量测定：参照文献［７］，与葡萄糖醛
酸对照品对照。
相对分子质量的测定：采用乌氏黏度法［８］。
红外吸收光谱：ＫＢｒ压片，分辨率为４０ｃｍ－１，
范围扫描４０００～４００ｃｍ－１。
紫外吸收光谱：扫描范围２００～８００ｎｍ。
２　结果与讨论
图１　６种树脂对ＨＡ的解析率
Ｆｉｇ．１　ＨＡｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎｒａｔｅｏｆｒｅｓｉｎｓ
２１　静态吸附解析
选取６种离子交换树脂分别对ＨＡ和ＢＳＡ进行
静态吸附解析实验，实验结果见图１、图２。ＨＡ为
酸性大分子，在水溶液中发生解离，解离方程式为：
ＨＡｎＨ＋＋Ａｎ－，解离后的分子带负电，因此３种阳
离子交换树脂对ＨＡ吸附量很小，其解析率也很低，
不利于获得 ＨＡ产品。３种阴离子交换树脂对 ＨＡ
的解析率差异不大，在７０％ ～８０％之间。考察离子
交换树脂对ＢＳＡ的解析率，由图２可知，３种阴离子
交换树脂中，２０１７树脂对ＢＳＡ的解析率最低。因
此选取对 ＨＡ解析率较高而对 ＢＳＡ解析率较低的
２０１７离子交换树脂填柱进行动态实验。
图２　６种树脂对ＢＳＡ的解析率
Ｆｉｇ．２　ＢＳＡｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎｒａｔｅｏｆｒｅｓｉｎｓ
２２　洗脱条件确定
２２１　流速对洗脱效果的影响
选取０５ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ溶液为洗脱剂，分别在
０６、０８和１０ｍＬ／ｍｉｎ流速下对ＨＡ纯品溶液进行
洗脱对比，结果见图３。由图３可知，当洗脱流速为
０６ｍＬ／ｍｉｎ时，洗脱峰型陡峭，峰值较高，拖尾少，
洗脱剂用量相应也减少。随着流速的提高，洗脱峰
值减小，出现拖尾现象，洗脱剂用量也相对较高。
因此，选用０６ｍＬ／ｍｉｎ为洗脱流速。
图３　流速对洗脱的影响
Ｆｉｇ．３　Ｅｆｅｃｔｓｏｆｅｌｕｔｅｒａｔｅｓｏｎｅｌｕｔｅｐｒｏｃｅｓｓ
２．２．２　梯度洗脱确定洗脱剂浓度
１）选取洗脱梯度
利用梯度洗脱分别确定ＨＡ标品和牛血清白蛋
白的最佳洗脱浓度。选取线性梯度洗脱装置，洗脱液
浓度与体积的关系式：ｃ＝ＫＶ，Ｋ与洗脱装置中２个烧
杯溶液初始浓度和体积有关［９］。实验选取 Ｋ为
３３　第４期 刘骥翔等：离子交换层析纯化透明质酸
０００６，即洗脱液浓度与体积的关系式为ｃ＝０００６Ｖ。
２）洗脱剂浓度的影响
ＢＳＡ溶液与 ＨＡ标品溶液０５ｇ／Ｌ分别上样，
水洗５０ｍＬ，０６ｍＬ／ｍｉｎ的流速进行梯度洗脱，洗脱
曲线见图 ４。由图 ４可知，洗脱曲线分别在 ０３
ｍｏｌ／Ｌ浓度和０６ｍｏｌ／Ｌ浓度处出现吸收峰，其中
０３ｍｏｌ／Ｌ处的吸收峰为主要吸收峰，峰值较大，大
量被吸附的蛋白在此浓度下被洗脱下来，在 ０６
ｍｏｌ／Ｌ时出现另１个比较小的吸收峰，是因为少量
吸附能力比较强的蛋白在此浓度下被洗脱下来。
图４　洗脱浓度对洗脱过程的影响
Ｆｉｇ．４　Ｅｆｅｃｔｓｏｆｅｌｕｅｎｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｎｅｌｕｔｅｐｒｏｃｅｓｓ
由ＨＡ洗脱曲线可以看出，随着洗脱剂浓度的提
高，ＨＡ被逐渐洗脱出来，在 ＮａＣｌ浓度为０６ｍｏｌ／Ｌ
时，ＨＡ出现最大吸收峰，说明ＨＡ的最佳洗脱浓度为
０６ｍｏｌ／Ｌ。但是在０６ｍｏｌ／Ｌ时有少量的强吸附蛋
白被洗脱出来，因此取０５ｍｏｌ／Ｌ为ＨＡ的最佳洗脱
浓度。
为了使ＢＳＡ和 ＨＡ在不同洗脱体积被洗脱出
来，确定ＢＳＡ的最佳洗脱浓度为０３ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ，ＨＡ
最优洗脱浓度为０５ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ，采取双浓度洗脱剂
进行洗脱。
２２３　洗脱体积的影响
在０６ｍＬ／ｍｉｎ流速下分别以０３ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ
溶液和０５ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ溶液对蛋白质标品、ＨＡ标
品进行洗脱，确定２种浓度洗脱液的洗脱体积。洗
脱曲线见图５。由图５可知，０３ｍｏｌ／Ｌ的 ＮａＣｌ溶
液４０ｍＬ可以将蛋白洗脱完全；０５ｍｏｌ／Ｌ的 ＮａＣｌ
溶液５０ｍＬ可将ＨＡ洗脱完全。确定洗脱体积分别
为４０ｍＬ和５０ｍＬ。
综上，确定的洗脱条件：０６ｍＬ／ｍｉｎ流速，先４０
ｍＬ０３ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ溶液洗脱，后５０ｍＬ的０５ｍｏｌ／Ｌ
ＮａＣｌ溶液洗脱，试样收集为４０ｍＬ之后。
图５　洗脱体积对洗脱过程的影响
Ｆｉｇ．５　Ｅｆｅｃｔｓｏｆｅｌｕｔｅｖｏｌｕｍｅｏｎｅｌｕｔｅｐｒｏｃｅｓｓ
２２４　ＨＡ、ＢＳＡ双浓度洗脱的影响
分别将 ＨＡ纯品液和 ＢＳＡ溶液上样，采取 ４０
ｍＬ０３ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ和５０ｍＬ０５ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ双浓
度进行洗脱，结果见图６。由图６可知，ＢＳＡ在洗脱
体积为２０ｍＬ时出现吸收峰，之后采用０５ｍｏｌ／Ｌ
ＮａＣｌ作为洗脱剂洗脱时，没有较强的吸收峰出现；
ＨＡ在洗脱体积为５０ｍＬ时出现吸收峰。两吸收峰
完全分离，说明采取双浓度洗脱可以实现 ＢＳＡ和
ＨＡ的分离。
图６　ＨＡ、ＢＳＡ双浓度洗脱
Ｆｉｇ．６　Ｅｆｅｃｔｓｏｆｄｉｆｅｒｅｎｔｂｉｅｌｕｅｎｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
ｏｎｅｌｕｔｅｐｒｏｃｅｓｓ
２．３　粗品溶液洗脱
粗品溶液上样、洗脱，观察洗脱曲线（图７）。粗
品溶液的洗脱曲线中，杂蛋白和ＨＡ达到峰值时的洗
脱体积与标品溶液洗脱曲线（图６）峰值时的洗脱体
积基本一致，都在１０～２０ｍＬ和５０～６０ｍＬ之间，两
峰没有叠加，杂蛋白和ＨＡ实现分离。在洗脱体积为
２０～３０ｍＬ处，２０６ｎｍ有较小的吸收，可能是以非离
子形式粘附在树脂上少量的ＨＡ被洗脱出来。
２４　产品分析
收集洗脱液，利用中空纤维膜进行浓缩，加入
适量饱和ＮａＣｌ沉淀蛋白，将沉淀物在４５℃下真空
干燥，得到产品进行检测。
４３ 生　物　加　工　过　程　　 第７卷　
图７　粗品洗脱曲线
Ｆｉｇ．７　Ｅｌｕｔｅｃｕｒｖｅｓｏｆｃｒｕｄｅｐｒｏｄｕｃｔ
２４１　红外光谱
　　产品经红外光谱检测（谱图略）。在 ３３００
ｃｍ－１附近有强的Ｏ—Ｈ伸缩振动的特征吸收带，表
明存在多羟基结构；在２９００ｃｍ－１附近有—ＣＨ２—
的伸缩振动；在１６２０、１５６０ｃｍ－１处有 Ｃ Ｏ、Ｃ—Ｎ
的伸缩振动，表明乙酰基结构无差异；在１４００ｃｍ－１
和１３２０ｃｍ－１处有—Ｃ—Ｏ—的伸缩振动和—ＯＨ的
弯曲振动耦合产生的２个吸收峰。与标准品红外谱
图比较，无差异。
２４２　紫外扫描光谱
产品进行全波长扫描，在 ２８０ｎｍ处无明显吸
收，说明杂蛋白含量非常少，在２０６ｎｍ附近有较强
吸收峰，为产品的吸收峰。扫描结果与标品全波长
扫描图对照完全一致。
２４３　纯化前后产品对比
参照行业标准的要求检测产品，并考察收率，
与行业标准要求进行对照，结果见表１。
表１　不同产品与行业标准比较
Ｔａｂｌｅ１　Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｂｅｔｗｅｅｎｄｉｆｅｒｅｎｔｐｒｏｄｕｃｔｓａｎｄｉｎｄｕｓｔｒｙｓｔａｎｄａｒｄ
ＨＡ产品 蛋白含量／％ ｗ（葡萄糖醛酸）／％ 平均相对分子质量 ２８０ｎｍ紫外吸收 收率／％
粗品（纯化前） ０１～０５ ３８～４１ ８０～１００万 １０～２０ —
精品（纯化后） ００５７ ４３ ＞１１０万 ＜０６ ５４
行业标准要求 ＜０１ — ＞８４万 ≤１０ —
　　由表１可知，纯化后的产品，葡萄糖醛酸含量和
分子量都有所提高，蛋白含量降至００５７％，２８０ｎｍ
紫外吸收值小于０６，均符合行业标准的要求。透
明质酸的总收率为５４％，离子交换层析、超滤和沉
淀过程收率分别为６８６％、８５４％和９２２％。
３　结　论
２０１７离子交换树脂装柱，采用 ０３ｍｏｌ／Ｌ
ＮａＣｌ和０５ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ２种浓度分别洗脱，得到的
产品蛋白含量为 ００５７％，葡萄糖醛酸含量高于
４３％，平均相对分子质量高于 １１×１０６，收率为
５４％。纯化后的产品蛋白含量有明显的降低，符合
医用级透明质酸的要求。
参考文献：
［１］　凌裴学．透明质酸［Ｍ］．北京：中国轻工业出版社，２０００：５８．
［２］　国家食品药品监督管理局．ＹＹ０３０８—２００４医用透明质酸钠凝
胶行业标准［Ｓ］．北京：中国标准出版社，２００５．
［３］　盛瑞堂，谭天伟．用十六烷基三甲基溴化铵从发酵液中提取透
明质酸［Ｊ］．北京化工大学学报：自然科学版，２００６，３３（３）：
３３３６．
ＳｈｅｎｇＲｕｉｔａｎｇ，ＴａｎＴｉａｎｗｅｉ．Ｓｅｐａｒａｔｉｎｇｈｙａｌｕｒｏｎｉｃａｃｉｄｆｒｏｍｆｅｒ
ｍｅｎｔａｔｉｏｎｂｒｏｔｈｗｉｔｈＣＴＡＢ［Ｊ］．ＪＢｅｉｊｉｎｇＵｎｉｖＣｈｅｍＴｅｃｈ：Ｎａｔｕ
ｒａｌＳｃｉｅｎｃｅＥｄｉｔｉｏｎ，２００６，３３（３）：３３３６．
［４］　虞菊萍，高向东．透明质酸精制方法的比较［Ｊ］．药学与临床
研究，２００７，１５（４）：３００３０２．
ＹｕＪｕｐｉｎｇ，ＧａｏＸｉａｎｇｄｏｎｇ．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓｏｆ
ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃａｃｉｄ［Ｊ］．ＰｈａｒｍＣｌｉｎＲｅｓ，２００７，１５（４）：３００３０２．
［５］　倪杭生，李润，贺艳丽，等．透明质酸的离子交换层析纯化
［Ｊ］．中国医药工业杂志，２００１，３２（１１）：４８５４８８．
ＮｉＨａｎｇｓｈｅｎｇ，ＬｉＲｕｎ，ＨｅＹａｎｌｉ，ｅｔａｌ．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｈｙａｌｕｒｏｎ
ｉｃａｃｉｄｂｙｉｏｎｅｘｃｈａｎｇｅｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ［Ｊ］．ＣｈｉｎＪＰｈａｒｍ，
２００１，３２（１１）：４８５４８８．
［６］　ＢｒａｄｆｏｒｄＭＭ．Ａｒａｐｉｄａｎｄｓｅｎｓｉｔｉｖｅｍｅｔｈｏｄｆｏｒｔｈｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎｏｆ
ｍｉｃｒｏｇｒａｍｑｕａｎｔｉｔｉｅｓｏｆｐｒｏｔｅｉｎｕｔｉｌｉｚｉｎｇｔｈｅｐｒｉｎｃｉｐｌｅｏｆｐｒｏｔｅｉｎ
（ｄｙｅｂｉｎｄｉｎｇ）［Ｊ］．ＡｎａｌＢｉｏｃｈｅｍ，１９７６，７２：２４８２５４．
［７］　ＢｉｔｅｒＴ，ＭｕｉｒＭ．Ａｍｏｄｉｆｉｅｄｕｒｏｎｉｃａｃｉｄｃａｒｂａｚｏｌｅｒｅａｃｔｉｏｎ［Ｊ］．
ＡｎａｌＢｉｏｃｈｅｍ，１９６２，４：１９２４．
［８］　ＬａｕｒｅｎｔＴＣ，ＲｙａｎＭ，ＰｉｅｔｒｕｓｚｋｉｅｗｉｃｚＡ．Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎｏｆｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ
ａｃｉｄ，ｔｈｅｐｏｌｙｄｉｓｐｅｒｓｉｔｙｏｆｈｙａｌｕｒｏｎｉｃａｃｉｄｆｒｏｍｔｈｅｂｏｖｉｎｅｖｉｔｒｅｏｕｓ
ｂｏｄｙ［Ｊ］．ＢｉｏｃｈｉｍＢｉｏｐｈｙｓＡｃｔａ，１９６０，４２（３）：４７６４８５．
［９］　沈同，王镜岩．生物化学［Ｍ］．２版．北京：高等教育出版社，１９９０．
５３　第４期 刘骥翔等：离子交换层析纯化透明质酸