全 文 ：第 38 卷 第 1 期 江西师范大学学报(自然科学版) Vol． 38 No． 1
2014 年 1 月 Journal of Jiangxi Normal University(Natural Science) Jan． 2014
收稿日期:2013-06-10
基金项目:国家自然科学基金(811160129，81302553) ，广东省高等学校国际暨港澳台科技合作创新平台项目
(2012gjhz0009)和深圳市科技计划国际科技合作(GJHZ20130408174112021)资助项目．
通信作者:刘志刚(1959-)，男，江西南昌人，教授，博士生导师，主要从事过敏性疾病过敏原的生化与分子生物学研究．
文章编号:1000-5862(2014)01-0026-04
葎草花粉主要过敏原的分离鉴定与纯化
李 莹1，肖小军2，柴文戍1，谢水祥3，何韶衡1，杨平常1，2，刘志刚1，2*
(1．辽宁医学院附属第一医院，辽宁 沈阳 121000;2．深圳大学医学院过敏反应与免疫学研究所，广东 深圳 518060;
3．赣南医学院原生物学教研室，江西 赣州 341000)
摘要:采用液氮研磨法提取葎草花粉粗蛋白，凝胶电泳(SDS-PAGE)分离粗提液蛋白组分并测定各组分
的相对分子质量，后经过离子交换层析法分离纯化几类主要的蛋白，再用 westen blotting分别检测其与花
粉过敏患者血清 IgE结合情况，鉴定每种主要蛋白质致敏原的致敏性．分析了葎草花粉变应原成分及其
变应原性、免疫原性，并鉴定主要过敏原的致敏性． SDS-PAGE 凝胶电泳结果表明，广泛的分布于 8 ～
170 kDa之间有主带 13 条，次带 10 余条;westen blotting 检测发现葎草花粉的致敏性较强，与花粉过敏患
者血清 IgE结合能力较高．离子交换层析出 4 种主要变应原蛋白，其相对分子质量分别为 55，16，15 和
25 kDa，其中结合能力最强的是 15 kDa 处蛋白条带． 葎草的主要过敏原为 55，16，15 和 25 kDa 蛋白质
组分．
关键词:葎草;花粉变应原;离子交换层析
中图分类号:Ｒ 593． 1 文献标志码:A
0 引言
变态反应又称过敏反应，其发生主要是由于人
体对生活环境中某一或若干通常无害的物质的一种
“不恰当”防御反应引起．随着人们生活水平的不断
提高，各地过敏反应的发生率呈逐年上升的趋势，在
西方国家过敏反应性疾病发病率达到 30%［1］，尤其
在欧洲花粉过敏发生率达到了 40%［2］．由于花粉过
敏症严重影响人们的正常生活，自从 1819 年，英国医
生 John Bostock首次报导花粉症以来，人们对花粉过
敏性疾病发病原因及治疗进行了大量的研究［3］．
葎草(Humulus scandens Lour)是桑科葎草属植
物，广泛分布于北半球的亚热带和温带以及亚洲诸
多国家［4］．在我国除新疆和青海外，其余各省区均
有分布［5］．由于葎草分布广泛，花粉量大，在其花期
季节过敏人群多难以避免出现不同的过敏症状． 有
学者对上海全年气传花粉进行调查，发现葎草是最
主要的气传草本花粉，而每年由葎草花粉过敏引起
的过敏性鼻炎和哮喘患者数量在同地区其他花粉中
数量最多［6］．因此，查找出葎草的主要变应原，鉴定
主要变应原的致敏性对以后研制脱敏疫苗具有较大
的临床意义．
1 材料与方法
1． 1 材料
葎草花粉采自辽宁省锦州市郊区;花粉过敏患
者血清由深圳大学过敏反应与免疫学研究所提供，
所用的血清来自于 10 个已经证实对葎草花粉过敏
的患者．
1． 2 主要仪器和设备
垂直电泳槽、转膜电泳槽(model 1 000 /500)、
DEAE-Cellulose DE-52 离子交换层析柱、快速蛋白
液相层析系统(FPLC) ;丙烯酰胺(Acr)、亚甲基双
丙烯酰胺(Bis)、十二烷基硫酸钠(SDS)、过硫酸铵
(AP)、生物素标记的 IgE二抗、硝酸纤维膜(Gelman
laboratory)、辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素
(Kirkegaard ＆ Perry Laboratories)等．
1． 3 花粉粗提液的提取
取新鲜葎草花粉 1． 0 g置于液氮中充分研磨破
DOI:10.16357/j.cnki.issn1000-5862.2014.01.019
碎，用丙酮 4 ℃侵泡 3 h去脂．过滤纸去丙酮 4 ℃风
干;以 1∶ 20 的比例加入预冷 PBS 缓冲液，4 ℃搅拌
过夜;混合液分装于 1． 5 mL EP管，4 ℃、12 000 r·
min －1离心 15 min，收集上清，将上清过 0． 45 nm 滤
膜，冷冻干燥储存．
1． 4 花粉粗提液进行 SDS -PAGE
采用 SDS-PAGE 体系分离粗提液中蛋白质组分
并测定其相对分子质量．分离胶 12%，浓缩胶 15%，
考马斯亮蓝 Ｒ-250 染色 0． 5 h，加脱色液脱色 2． 0 h，
后用凝胶成像及分析系统拍照并分析其相对分子
质量．
1． 5 花粉粗变应原的免疫学特性鉴定
采用 Western-blotting 方法配合 10 份葎草花粉
过敏患者的混合血清，对花粉变应原进行免疫学特
性的鉴定． 具体步骤如下:SDS-PAGE 后取出凝胶，
凝胶与硝酸纤维膜固定于电转夹 4 ℃，300 mA恒流
下电转 50 min;取出纤维膜，TBS清洗 3 次，每次 2 ～
3 min;3%BSA-TBS 4 ℃封闭 12． 0 h(过夜);TBS 清
洗 3 次后 TBST 清洗 3 次，每次 2 ～ 3 min;1% BSA-
TBST与花粉过敏患者混合血清 5 ∶ 1 比率混合，室
温孵育 3． 0 h;1% TBST 清洗 3 次，1% BSA-TBST 与
二抗 2 000∶ 1 比率混合，室温孵育 3． 0 h;1% TBST
清洗 3 次，1% BSA-TBST 与 HＲP 5 000 ∶ 1 比率混
合，室温孵育 1． 5 h． TBST 与 TBS 分别清洗 3 次，每
次 2 ～ 3 min;3，3 ＇-二氨基联苯胺显色 5 min，拍照
保存．
1． 6 粗提液的离子交换层析与检测
葎草花粉粗提液装截留相对分子质量为 3 500
透析袋，在 0． 02 mol·L －1(pH值为 7． 2)的 Tris-HCl
缓冲液透析过夜，过 0． 45 μm 滤膜，在快速液相层
析系统下，用 DEAE-Cellulose DE-52 离子交换层析
柱进行纯化分离．以 pH 值为 7． 2 的 0． 02 mol·L －1
Tris-HCl 缓冲液平衡层析住;上粗蛋白样，用
0． 5 mol·L －1 NaCl，0． 02 mol·L －1 Tris-HCl 洗脱液
洗脱，见峰接蛋白;冻干所接个峰蛋白，通过 SDS-
PAGE 、Western blotting分析样品，确定各峰收集液
中蛋白的免疫活性部分．
2 结果
2． 1 葎草花粉粗浸液的 SDS-PAGE 电泳
葎草花粉的电泳结果发现有 30 余条的蛋白条
带，其中在 35 ～ 70 kDa 区间蛋白含量最丰富，有主
带 13 条，分别是 60，55，53，52，40，39，38． 5，36，35，
31，30，29 和 22 kDa，余下在 170 ～ 8 kDa 之间约有
10 余条次带．其 SDS-PAGE电泳结果见图 1．
M:Standard molecular weight markers;
S:SDS-PAGE analysis of Humulus scandens Lour pollen
extract．
图 1 花粉粗提液 SDS-PAGE 图
2． 2 花粉特异性变应原鉴定
用过敏患者的阳性血清进行免疫印迹，对花粉
粗浸液中的变应原进行鉴定． 葎草花粉提取液中可
与过敏性病人血清 IgE结合反应阳性的蛋白广泛分
布于 100 ～ 10 kDa之间，其中，主要阳性反应蛋白条
带分布于 55，16 和 12，25 kDa，余下分布于 130 ～
15 kDa之间约有 10 余条弱反应条带(见图 2)．
M:Standard molecular weight markers;
S:IgE immunoblots of sera from 10 Humulus scandens
Lour pollen allergic patients．
图 2 葎草花粉免疫印迹图谱
72第 1 期 李 莹，等:葎草花粉主要过敏原的分离鉴定与纯化
2． 3 花粉变应原的纯化
2． 3． 1 花粉变应原的离子交换层析 用对 DE-52
离子交换层析缓冲液充分透析的花粉粗浸液上柱．
葎草花粉主要有 8 个蛋白峰，主峰为Ⅱ ～Ⅶ，如图 3
所示．
图 3 葎草花粉粗提液离子交换层析图
2． 3． 2 葎草花粉变应原 DE-52 离子交换 SDS-
PAGE 将 DE-25 离子交换纯化蛋白按峰进行加样
SDS-PAGE，结果如图 4 所示．
M:Standard molecular weight markers;Ⅰ ～ Ⅷ SDS-
PAGE analysis of every peak elutedprotien of Humulus scan-
densLour pollen extract．
图 4 葎草花粉变应原 DE-52 离子交换 SDS-PAGE
2． 3． 3 用花粉过敏患者血清进行免疫印迹检测
( Western-blotting) 对图 4 所纯化的花粉个峰进行
的变应原进行免疫活性鉴定，结果如图 5 所示．
图 4、图 5 检测结果表明，葎草粗提液离子交换
层析后蛋白主要分布在 I ～Ⅷ峰． 葎草粗纯蛋白与
花粉过敏患者的血清 IgE 结合，主要的过敏患者结
合反应阳性的蛋白质在Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ峰，其中，Ⅱ、Ⅲ
峰结合反应阳性结果比较相似，蛋白质分子质量大
约为 55 和16 kDa．Ⅳ峰蛋白结合反应阳性结果蛋白
主要约为 15 kDa，Ⅴ峰结合反应阳性蛋白则约为
25 kDa．
M:Standard molecular weight markers;Ⅰ ～ ⅧWest-
ern-blotting of every peak elutedprotien of Humulus scandens
Lour pollen extract．
图 5 纯化葎草花粉蛋白免疫印迹图
3 讨论
花粉过敏性疾病是一种严重危害人们健康的常
见病，研究表明，该病的产生往往与花粉中的某些多
糖和蛋白有关［7］．葎草(Humulus scandens Lour)花粉
变应原最主要的致敏成分也是蛋白质． 由于葎草分
布广泛、花粉量大，在其开花季节会引起大范围的过
敏人群过敏． 在 1995 年的气传花粉过敏原的调查
中，我国大部分地区空气中葎草花粉的含量仅次于
蒿草．有研究报道，近 10 年来，仅北京地区空气中花
粉含量大幅度增高［8］．而由于花粉过敏而导致的门
诊哮喘患者在花粉季节大幅度增高［9］．宋微微等［10］
总结了 2001—2010 年在沈阳地区沈阳军区总医院
门诊变态反应病例，在引起过敏性疾病的主要过敏
原中，葎草所占比率为 1． 95% ． 每到葎草开花季节
会引起大范围过敏人群产生哮喘、鼻炎等变态反应
性疾病，且发病率高，严重影响该地区的过敏人群的
健康和正常生活．
本研究所采用葎草花期采集花粉进行分离、鉴
定与纯化，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳发
现有葎草花粉有 30 余条的蛋白条带，其中在 35 ～
70 kDa区间蛋白含量最丰富，有主带 13 条，相对分
子质量分别是 60，39，38． 5，36，35，31，30，29 和
22 kDa等，余下在 170 ～ 8 kDa 之间约有 10 余条次
带．这与立冬栋等［1］研究结果相似，葎草花粉在
10 ～ 20 kDa 的蛋白质种类最多，其次为 20 ～
30 kDa．免疫印迹结果显示，天然的葎草花粉变应原
有约 20 余种，纯化出来的葎草花粉变应原于相对分
子质量约为 55，6 和 15，25 kDa 与葎草花粉过敏患
者血清结为阳性，其中相对分子质量为 15 kDa 处蛋
白条带阳性结合显色最明显，致敏性最强，与孙秀珍
等［11］报道的葎草花粉过敏原中，8 种蛋白为主要蛋
82 江西师范大学学报(自然科学版) 2014 年
白致敏成分基本吻合，23． 2 kDa 和 11． 8 kDa 和 H．
S． Park等［12］在 2001 年对 Humulus japonicus 研究发
现，相对分子质量为 10 kDa的葎草花粉变应原能够
与 72%的花粉过敏患者血清结合的结果较相似，吻
合度较高(见图 2、图 5)．这个发现为临床用天然纯
化的葎草花粉过敏性疾病的诊断奠定了一定的理论
基础，也为治疗葎草花粉过敏的患者提供了一定的
实验依据．相对于人工合成的葎草花粉蛋白，天然纯
化的葎草花粉蛋白变应原更接近花粉过敏患者的致
敏过程，用天然纯化的蛋白作为免疫疫苗，更形象模
拟了天然诱发过敏过程，使患者产生的免疫耐受直
接来自天然致敏物质．
但是由于本实验的蛋白是粗纯，不能够更进一
步说明葎草花粉过敏患者具体对哪种蛋白过敏，所
以还需要更进一步改进纯化技术，争取具体到某种
致敏原蛋白，以便更加系统科学地治疗葎草花粉过
敏性疾病，缩短临床治疗时间，为葎草花粉过敏患者
带来福音．
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The Characterization for the Antigenic Properties of Pollen
Allergens in Humulus scandens Lour
LI Ying1，XIAO Xiao-jun2，CHAI Wen-shu1，XIE Shui-xiang3，HE Shao-heng1，YANG Ping-chang1，2，LIU Zhi-gang1，2*
(1． The Firstaffliate Hospital of Liaoning Medical University，Shengyang Liaoning 121000，China;
2． Allergy and Immunology Institute，Shenzhen University，Shenzhen Guangdong 518060，China;
3． Department of Pathogenic Biology，Ganna Medical College，Ganzhou Jiangxi 341000，China)
Abstract:To characterize and purify the pollen allergens isolated from Humulus scandens Lour，identified the aller-
genicity of these main allergen． The pollen of Humulus scandens Lour were grinded in liquid nitrogen to extract the
total protin，analyzed total protin with SDS-PAGE，detective the proteins’allergenicity with westen-blotting，Ion-ex-
change chromatography with DE-52 was used for the purification of the antigens． For the pollen extract of Humulus
scandens Lour，30 protein bands were detected in SDS-PAGE． Among them，weights bewteen 8 and 170 kDa has 13
main protiens，more than 10 kinds of secondary protiens． Fore of these protein bands，with a molecular weight of
55 kDa，16 kDa and 15 kDa，25 kDa，showed immunoreactivity with IgE in the sera from patients with allergy to pol-
len of Humulus scandens Lour． Pollen allergens from Humulus scandens Lour were purified and characterized． The re-
sult will provide a theoretical foundation for the diagnosis and treatment of allergy to the pollen allergens from Hu-
mulus scandens Lour．
Key words:Humulus scandens Lour;pollen allergen;ion-exchange chromatography
(责任编辑:刘显亮)
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