全 文 ：第5卷第3期
2007年8月
生物加工过程
ChineseJoumalofBi叩rocessEngineering
Aug．2007
· 69·
夏枯草多糖分离纯化、相关性质及药效
张 敏，尹鸿萍，王 曼
(中国药科大学 生命科学与技术学院，南京210009)
摘要：研究了夏枯草多糖的提取工艺、分离纯化、部分理化性质以及夏枯草多糖的免疫学活性。夏枯草经水提醇
沉，去蛋白、脱色、凝胶柱色谱等步骤分离纯化得到夏枯草精多糖(PurepolysaccahridesofSPicopm珊耽e，PPsP)。
HPGPc法测其相对分子质量，红外光谱法对其结构进行初步分析，柱前对氨基苯甲酸衍生化HPLC法测其单糖组
成。免疫学实验证明夏枯草精多糖单独作用或协同conA均可显著促进小鼠脾淋巴细胞增殖，夏枯草精多糖在200
¨g／mL质量浓度下对正常小鼠的廓清指数和吞噬指数有明显促进作用。
关键词：多糖；夏枯草；免疫活性
中图分类号：0629．12；Q539文献标识码：A 文章编号：1672—3678(2007)03—0069—05
Separation，puri6cationandactiVityofpha珊acodynamic
actionof．印记口pr“乃PZ玩Ppolysaccharide
ZHANGMin，YINHong—ping，WANGMin，
(SchoolofLifeScienceandTechnology，ChinaPh釉aceuticalUniversity，Nanjing210009，China)
Abstract：PurepolysacchaIideof印 copm船朋缸，wasisolatedf而maqueousextractsof heChineseme。
dicinalherb，Pre，Lez2h钟L以g口r妇，afterp ecipitationbyalcoh01thecmdepolysaccharidew sobtainedan
purifiedtochmmatogmphichomogeneity．Thecontentsof hepolysaccharideandpI．oteinwereassayedby
Sulfuricacid—phen01a dG-250analysisre pectively．HPGPCindicatesthmolecularweightandHPLC
indicatesthpresenceofglucose，galactose，xylose，arabinose，rhamnoseandm nnose．Studyonitsim—
munityactivitywasc删edoutinvivoandvitr0，andresultsshowedthatmultiplicationofthespleenlym—
phocyteofmicewasoluiouslypromotedbysingle印；c口PrMne比口ewithconcentrationof200斗g／mL，orby
itcooperatedwi hConA．
Keywords：p01ysaccharide；spicopm聊fZoe； mmuneactiVity
中药夏枯草H1是唇形科夏枯草属植物，具有清
火、明目、清肝、散结及消肿之功效，用于治疗肺结
核、急性肝炎、目赤肿痛和高血压等症，现代药理学
研究表明，夏枯草含有多种活性化学成分，具有抗
菌、降压、抗炎、抗肿瘤、降血糖等作用。
据报道_2。3o夏枯草具有抗肿瘤、抗病毒等活性，
特别是抗艾滋病毒(HIV)活性，同时文献[4]认为
夏枯草在免疫调节方面也具有良好的效果，而多糖
正是夏枯草的活性成分之一。为此，研究从夏枯草
粉中分离纯化得到的夏枯草多糖，并进一步研究了
其相关的免疫学作用等。
收稿日期：2007旬3．29
基金项目：云南省科委基金资助项目(2001MAABAcHDA028)
作者简介：张敏(1982一)，女，江苏仪征人，硕士研究生，研究方向：天然活性产物。
联系人：尹鸿萍，副教授，E—mail：yinhongping@hotmail．com
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· 70· 生物加工过程 第5卷第3期
1材料与仪器
夏枯草，南京百信大药房。
旋转蒸发仪(上海申胜生物技术有限公司)；
752紫外光栅分光光度计(上海精密仪器厂)；循环
水式真空泵(河南太康科教仪器厂)；数显恒温水浴
锅(上海申胜生物技术有限公司)；真空干燥箱(上
海实验仪器总厂)；Agilent高效液相色谱系统；320．
S型pH计(METTLERTOLEDO)。
2主要试剂
DEAESigma公司；标准糖(中国药品生物制品
检定所)；盐酸、乙醇、氢氧化钠、氯化钠均为国产分
析纯；重蒸苯酚(上海生工)；RPMI一1640培养基(美
国GIBC0公司)。
3 实验方法
3．1夏枯草多糖的提取、分离、纯化
3．1．1提取
夏枯草粉碎以15倍水加热提取2次，每次3～
4h，离心取上清液，合并滤液浓缩至原体积的1／4，
去蛋白，分级醇沉，无水乙醇洗涤，烘干，得夏枯草
粗多糖CPSP。
3．1．2分离纯化
CPSP水溶，经大孔树脂吸附后滤液用双氧水脱
色，透析，进行DEAE凝胶过滤柱色谱分级(第1—
100管以磷酸盐缓冲液做洗脱液，第101～300管以
0．01moL／L、lmoL／LNacl梯度混合溶液做洗脱液；
流速6mL／min)，苯酚一硫酸法跟踪检测，做吸光度-
管数曲线，将高峰部分合并、透析60h后浓缩、冷冻
干燥得夏枯草精多糖PPSPl，PPsP2，PPsP37 PPSP4
4个级分。洗脱图谱及HPLc测定结果表明PPsP3
为主要成分，故选择PPsP3进行后续研究。
3．2 纯度鉴定及相对分子质量测定
3．2．1相对分子质量测定"1
将葡聚糖标准品配制成质量分数为0．15％的
溶液，由小分子到大分子依次进样，正确记录各样
品相应的保留时间f。和色谱图。色谱柱：IJltrahydr0一
gellMLinear((b300mm×7．8mm×2)；流动相：O．1
moL／L醋酸钠；流速：0．9mL／min；柱温：45℃；进样
量：20汕。将CPsP和PPSP3多糖配制成一定浓度
的溶液，其HPLc操作条件同上(进样50灿)。
3．2．2多糖含量测定
多糖含量采用硫酸．苯酚法测定∞1。
3．2．3蛋白含量测定
蛋白质含量考马斯亮蓝法测定旧o。
3．3多糖的结构研究
3．3．1HPLC分析¨“J
取50¨L单糖标准品和多糖样品的水溶液(质
量浓度为3．6—4．2mg／mL)，分别加100灿对氨基
苯甲酸的甲醇溶液，70℃下反应30min，冷却后加
水定容至2mL，0．45灿m微孔膜过滤后供进样。
色谱条件：色谱柱Adantisdcl8柱(妒．6
mm×250mm，5斗m，美国Waters公司)；流动相A
为0．1m0L／L磷酸盐缓冲液(pH2．5)，含lo
mmoL／L四丁基硫酸氢铵；B为缓冲液A加体积分数
为50％的甲醇；流速：0．8mL／min；紫外检测波长
A=303nm，荧光检测A。=313nm，A。。=358nm；柱
温：30℃；进样量：10斗L。
3．3．2红外扫描
多糖的红外光谱多糖2mg与KBr压片∽j，于
4000二400cm。处进行红外扫描。
3．4 P蚂P3体外促进正常小鼠脾淋巴细胞增殖活性M1
3．4．1 体外单独促进正常小鼠脾淋巴细胞增殖
作用
用RPMI一1640完全培养液调整小鼠脾淋巴细胞
至5．O×106／mL，于96孔细胞培养板每孔加细胞悬
液100灿，并加入不同浓度的药物PPSP3各100止，
设阳性对照孔(加100止质量浓度为5灿g／mL的刀
豆蛋白溶液)和空白对照孔(加100灿RPMl-1640
完全培养液)，混合均匀后放置孵箱孵育48h，培养结
束前4h各孔加入四甲基偶氮唑盐(M，ITI’，5n衫mL)
20止，放置上述孵箱中继续孵育4h，2000r／IIlin离
心10IIlin，弃上清液，每孔加入二甲基亚砜150止，充
分振荡混匀后于酶标仪570nm处测0D值。
3．4．2协同刀豆蛋白(ConA)促进小鼠脾淋巴细胞
增殖实验
用RPMI一1640完全培养液调整小鼠脾淋巴细
胞至5．0×106／mL，并加入终质量浓度为5恤g／mL
的conA，于96孔细胞培养板每孑L加细胞悬液100
灿，再加入不同浓度的药物PPsP3各100止，并设
空白对照孔，其余操作同上，于酶标仪570nm处测
DD值。
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