全 文 :!10 (x4)、ÆpH(x5)、ÆÚµ (x6)P±z( (x7),
"!
5
#
2012
$
9
%
T
L
´
Y
µ
¶
ChineseJournalofBioprocessEngineering
Vol.10No.5
Sep.2012
doi:10.3969/j.issn.1672-3678.2012.05.002
NOPH
:2011-10-11
JQR!
:
·¸AIgÅÓ0hij
(973
ij
)
¾¿ÀÁ
(2011CB707405);
kà9¼Y¶·¸AI½¾¿ÀÁ
(ZK201001);
lÆ
mù`ÉÀI½¾¿ÀÁ
(201004001);
·¸¹º»¼I½n$I½¾¿ÀÁ
(21106067);
opmùº»¼ÅÓÀÁ
(11KJA530001)
ST.U
:
q
r
(1987—),
Ì
,
ost
,
ÑÒÅÓT
,
ÅÓÔÕ
:
ÑTL¼
;
u
v
(
ÙÚ
),
ÛÜ
,Email:biotechnology@njuteducn
`s ¡¢£¤¥][L
M
1,
N
O
1,2,
PQR
1,
S(T
1,
UVW
1,
X
Y
1
(1
.Z36/0 12[\]3405
,
.Z
211800;2
^_`ab6cde
,^
_
510316)
7
a
:
à-./0!12
,
+Õ345ϯÐ678ñò9:;ñ
(Clostridiumbeijerincki)ART124
ÑÒäã
¯ÐÓÄÅ()â<=>
。
?@A+
Placket Burman
BCDEFGHÔÕ¯ÐäãÓ
3
I°JKL
CaCO3y
NH4HCO3yK2HPO4Ó+Ü,MNOþPQRSTUVþcÕ3WX,þYZ[Õ34v\]êDE^_,` ab
JÔÕKLÓþg()
:CaCO3、NH4HCO3yK2HPO4ÓcÜdúì"!265、216y043g/L。A+íefgì
hijk-./0cÜdú!
30g/L
å
,
þgÓ¯ÐãÜ!
810g/L,
6=>lïm
5314%。
Ãþgno(
)*kðÓpCÖ×qfgijrstê
,
uÙvwxÓfgyz{Ó
。
bcd
:Clostridiumbeijerincki;¯
Ð
;
/0
;
=>
efghi
:TQ43124
6jklm
:A
6n;i
:1672-3678(2012)05-0007-06
Optimizationofbutanolfermentationwithcanemolasses
byresponsesurfacemethod
TANGYan1,GUOTing1,2,DUTengfei1,ZHANGQiuyan1,CHENXiaopeng1,JIANGMin1
(1.ColegeofBiotechnologyandPharmaceuticalEngineering,NanjingUniversityofTechnology,Nanjing211800,China;
2.GuangzhouSugarcaneIndustryResearchInstitute,Guangzhou510316,China)
Abstract:ThebutanolfermentationconditionsofClostridiumbeijerinckiART124fromsugarcanemolas
seswereoptimizedbyresponsesurfacemethod.PlacketBurmandesignwasusedtoevaluatetheinflu
encesofrelatedfactors.CaCO3,NH4HCO3andK2HPO4wereselectedasthesignificantfactorsThe
pathofsteepestascentwasundertakentoapproachtheoptimumregionofthethreesignificantfactors.
Theefectsofthethreemainfactorsonthebutanolproductionwerefurtherinvestigatedbyacentralcom
positedesign.Theobtainedoptimalconcentrationsofnutrientswere265g/L(CaCO3),216g/L
(NH4HCO3)and043g/L(K2HPO4).Acorespondingmathematicalmodelwasestablishedtopredict
thefermentationexperimentandthemaximumbutanolyieldof810g/Lwasobtained.Undertheoptimal
conditions,thebutanolconcentrationincreasedby5314%.Thestatisticalmethodwasprovedtobea
powerfultoolfortheoptimizationofbutanolproductionfromcanemolasses.
Keywords:Clostridiumbeijerincki;butanol;molasses;optimization
./ã;)wxnå
、
)yb`
、
mz{A
、
2R
&y|A
,
Ýâãäå2}~æà
[1]。
./TL01
ÞÝˤ
Clostridiumacetobutylicum、C.beijerincki、
C.saccharobutylicum
P
C.saccharoperbutylacetonicum
úðC[\td
[2]。
ÀT>ªÄy
,
.
/01YZ3
[3]。
ìí
21
îl
ö÷
2øùñ
,
./2TL01}
,
è;x,m
./012hÏ~`
,
ˤïð)2LrÆ
]^LU<=yçè01àªè$a./01
>Æ2ÅÓªAÞ
[4-7]。
:;<=ݬ
,
çè
T>àA5¤À01
,
*{îéJ)
T>ªÄ
,^
HPJ[\]<=ÍM-ôõZª2
a
,
ã;³2hÏYxù
。
À<=ª²
9
,
;½Ï*
、
ÓE
、
,y{ËÀ01
2Lp
[8],
èê³Ë¤<=01¬./
,
-
01[\89
。
4567
(responsesurfacemethod
ology,RSM)
ÝÞz WEÚ¡cæ¢[\2
£¼¡iÔ7
,
A5¤ÀOzÑTL01[
\289P£~¤Xc
[9]。
J¹#no2
1
hm./°Sh
Clos
tridiumbeijerinckiART124
èN0Sh
,
J7hµ¥
ö2:;<=çè./012Ip
,
n{|23
4EPôõ"£
,
@µ
Placket Burman(P B)
¼
2qn
,
榧¨©?
,
cЩ¼ªir45
6²³7d-«
,
89./201YZ
。
1
op%rs
11
op
111
à
:;<=
(
p(²£
):
;<
35%,
NO<
5%,
y<
10%,
s¬b9©L
3%。
112
Sh
01Shè
ClostridiumbeijerinckiART124,
@
µ
n)ÚyÏ*,¹#qn
。
113
GHI
z*GHI
(g/L):
1
30,
¡
50,
P
&`
100,CH3COONH420,NaCl20,MgSO4·
7H2O30,KH2PO410,K2HPO410,FeSO4·7H2O
01;pH60。
Ig01GHI
(g/L):CH3COONH422,
KH2PO405,K2HPO405,NaCl001,MgSO4·7H2O
001,FeSO4·7H2O001,MnSO4·H2O001,tu®
10;pH66。
12
¦§rs
121
z*©¬
²¯$À
-70℃
°±2Sz±zýz*GH
Ic
,
35℃
tCGH
12~16h。
_9Ç2z*
©J
5%
2±z(G±ý}²2z*GHI
,35℃
CGH
10~12h。
122
01GH
³01
:100mL
³´©(è
50mL,
²_
9Ç2z*©J
10%
2±z(
,
±zý01GHIc
,
@lm
N2µCGHôõ,35℃tGH72h。
²¦01
:
_9Ç2z*©±zý´;
2L
0
1GHI2
3L
01¶c
,
±z(
10%(
,ç²
£
),
01Úµ
32℃,
01µ¶c45@l
N2,Vú
è
03L/min。
13
g¨rs
131
SzTL(º»
S,TL(@µº»01©
600nm
ÁÂt
2Ãĵ
OD600a
。
132
Î<º»
¤
DNS
7º<=2Î<(
[10]。
s¬<£¤
mx©ÓÔ7
(HPLC)
º»
。
ÓÔ²³Ø
:
BioRadAminexHPX87H
~Ï*Í·ÓÔØ
;
Öº
×
:ShosexRI 101
~߸¹ÄÖº×
;
Vº
:5
mmol/LH2SO4&©;dÙ,ç:20μL;VºVú:
06mL/min;
ØÚ
:55℃[11]。
133
01>Lº»
01>Lº»£¤«ÓÔ7
。SP 6800A
~
«ÓÔÕ
,
£¤
FID
Öº×
。
ÓÔØ
:
½
Ø
,
»
:SE 30,
¾ð
:30m×032mm ×1μm。
FID
Öº×Úµ
260℃,
+«
N2,Vú 05mL/min,
²V°
10∶1。
£¤¶¿óÚ
:60℃,
9:
2min;
J
8℃/min
ó)
100℃,
9:
1min;
J
2℃/min
ó)
120℃,
9:
1min;
J
40℃/min
ó)
180℃。
}Q
7»(
,
À./çè}QL
。
14
¦§©ª
141 P B
7qn34>./2ßE
P B
¼ªiÝÞz;x2ÁbcÔ7
,
¤Jný-./>(;ñ/342*
。
ÂÃ
ÿKLP"#¼
,
Ļļn234EM
7
Å
,
²Ýè
CaCO3p(´µ(x1)、NH4HCO3p(´
µ
(x2)、K2HPO4p(´µ(x3)、
8
T
L
´
Y
µ
¶
!
10
"
ÈÅEªÆ
2
Å*bc
,
)*bc
(-1)
Pm
*bc
(+1),
Oª
4
ÅÇÈ(
,
JMN¼É
¸
。
n¤
N=12
2
P B
ªi
,
¤¡iÊ\2
STATISTICA80(
Ë·
StatSoft
mÌ
)
-¼£Ãd
ö
,
MNOE-./01ñ/`
。
142
榧¨¼ªi
ÂÃ
P B
¼2y
,
ªiñ/E2æú
¯ó©?P9Â
[12]。
sE2AÂÃO
Ex52ÍÎPÏÄ»
,
Íx5ðñ2E:
±mA
,
Îx5ðñ2E:±)A
[13]。
n»c
ÐAd§¨¼
,
Ðýæ¢ÑÇWPˤ4
56dÞ89
。
143
cЩªi89
ÂÃ榧¨¼y
,
Ļt޼bc
,
ñ/EJcÐAèÒbc
。
Ó¿
STATISTICA80
Ê,
dcЩªi
(CCD)[14],
89./T>"
£
。
¼£Ãˤ4567
,
£¤WÔÁw-«Ô
¶-£Ãd²³
。
@µ$`-«²³
,
È©ÁwW
ÀKÔ¶Õ¬45#6ÞPym$Þ
,
æ¢01
[。
ÖÛi×Tý2"£d¼
,
JØ£~
2PÙ`
,
éÄ»æÇ289y
。
2
xy%z)
21
_`[\^«a¬
P B
¼ªir45AÚ
1,
OEx5r
ñ/`²³Ú
2。
(²³c
,
å"£2ÆÛ
µÀ
90%,
W
P<01
I
,
FP-èQE-./
01;ñ/2ç¤
。
1 P B
¦§©ª®xy
Table1 ExperimentaldesignandresultsofPB
Ü
Ý
x1
ρ(CaCO3)/
(g·L-1)
x2
ρ(NH4HCO3)/
(g·L-1)
x3
ρ(K2HPO4)/
(g·L-1)
x4
ρ(<)/
(g·L-1)
x5
Æ
pH
x6
ÆÚµ
/
℃
x7
±z(
/
%
ρ(./)/
(g·L-1)
1 1(03) -1(025) 1(075) -1(3) -1(60) 1(37) 1(10) 767
2 1 1(0375) -1(05) -1 -1 1 1 757
3 -1(02) 1 1 1(4) -1 -1(35) 1 459
4 1 -1 1 -1 1(65) -1 -1(7) 726
5 1 1 -1 1 -1 -1 -1 463
6 1 1 1 1 1 1 -1 589
7 -1 1 1 -1 1 -1 1 689
8 -1 -1 1 1 -1 1 -1 693
9 -1 -1 -1 1 1 1 1 613
10 1 -1 -1 1 1 -1 1 532
11 -1 1 -1 -1 1 1 -1 741
12 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 737
2 P B
¦§¯¬LMg¨
Table2 Parameteranalysisandestimatesof
PBdesign
E x5
t F
A
P
A
x1 09238 42428 180016 001323
x2 -06154 -28268 79905 004750
x3 -17781 -81669 666985 000122
x4 01357 06231 03882 056699
x5 00225 01035 00107 092254
x6 -01652 -07587 05756 049029
x7 -02200 -10105 10212 036941
2
Pà
:
-
C.beijerinckiART124
ˤ<=
01>./
,
ã;ñ/34*2Ý
CaCO3、
NH4HCO3P K2HPO42p(´µ。<、Æ pH、
ÆÚµP±z(-45A34:{ñ/
,
+
,
²"£²³
c{ñ/2E{34Զȩ
µ2Þßtàá
。
dÞ榧¨¼2qn
c
,
n
CaCO3、NH4HCO3P K2HPO42p(´µè
#ß34E
。
22
3°±²¦§xy
P B
¼yªi#ßE2榧¨©
?
,
sc
CaCO3p(´µ;ñ/Íx5,5m´;
NH4HCO3P K2HPO4p(´µ;ñ/Îx5,5[
。
ÂÃ*
3
ÅEx5Ï2°*ª»¶þ2
9
!
5
# q
ry
:
456789:;<=01>./
9ÔÕrÂd¼
,
yU
3
Tß
。
3
3°±²¦§©ª®xy
Table3 Experimentaldesignandresultsof
steepestascent g/L
ÜÝ
ρ(CaCO3) ρ(NH4HCO3)ρ(K2HPO4) ρ(./)
1 200 250 050 712
2 225 225 045 751
3 250 200 040 789
4 275 175 035 742
5 300 150 030 693
6 325 125 025 671
3
Pà
:
./>(¼
2
P
3
Ê;ð
ñ2¯ó
,
ÇÅÆtJ
,
PÚæ801[\P
¼
2
P¼
3
Ê
,
_J¼
3
2[\è456
¼2cÐA
。
23
`^g¨
@µæ¦§¨¼Ä»/
3
Åß34E2
¼cÐA
,
ˤ
STATISTICA
¡iÊ\d
CCD
ªi¼
,
ªiryÚ
4。
4
e³´µ©ª®¦§xy
Table4 ExperimentaldesignandresultsofCCD g/L
ÜÝ
ρ(CaCO3) ρ(NH4HCO3)ρ(K2HPO4) ρ(./)
1 200 150 030 631
2 200 250 050 730
3 300 150 050 781
4 300 250 030 736
5 250 200 040 797
6 200 150 050 673
7 200 250 030 721
8 300 150 030 700
9 300 250 050 753
10 250 200 040 807
11 166 200 040 696
12 334 200 040 741
13 250 116 040 702
14 250 284 040 783
15 250 200 023 635
16 250 200 057 739
17 250 200 040 795
@µWÀK-«²³-£Ãd-«È
©
,
¤X./012£~Ô¶
:
Y=800+021x1-028x
2
1+022x2-019x
2
2+
024x3-039x
2
3-017x1x2+006x1x3-012x2x3 (1)
Kc
Y
è./>(2¥ºA
。
(Q£~Ô¶2Ô
¸²³Pà
,
ļTn¤£~mµñ/
(
5)。
R2
è
09678,
EâÇ2
R2
è
09265,
!ð;
9265%
2./>(À²¬TÅÓ2
3
Å*
c
,
sÎÀcî
735%
{éQ£~aKL
,
ðºA¥ºAÊ2ÿ`±m
,
È©¶µ
³
,
ɸ±Ï
。
5
¶"`·¸¹ºr»g¨
Table5 Analysisofvariance(ANOVA)ofregression
modelofquadraticresponse
Ô¸a{ cÔP :Ô
F
A
P
A
x1(L) 0612633 0612633 1440559 0006870
x1(Q) 0857228 0857228 2015704 0004924
x2(L) 0624058 0624058 1467423 0006746
x2(Q) 0414564 0414564 974815 0010103
x3(L) 0768806 0768806 1807788 0005486
x3(Q) 1699570 1699570 3996405 0002493
x1x2 0242960 0242960 571302 0017057
x1x3 0028968 0028968 68117 0120779
x2x3 0118087 0118087 277673 0034178
ÿÈÀ
0139269 0027854 65496 0137742
ɸ
0008505 0004253
ÂÃ-«Ô¶
,
ˤ
STATISTICA
Ê\Õ¬N
./>(E245#6ÞPym$Þ
,
yU
Þ
1~
Þ
3
Tß
。
Þ
1
è
04g/LK2HPO4[\tCaCO3r
NH4HCO3p(´µ-./>(234。Þ 1P
à
:
Þ»2´µâã}
,
./2>(ìí
CaCO3P
NH4HCO3p(´µ2m´^m´,ýãAÇ,ä
ìBCtJ
。
Péè
N
{2´µ34S,
2TL(
,
ås´µtJåS,TL([\I
,
<2ˤ%XYtJ
,
d^34æD2&>(
;
Uys´µµm
,
{ËÀX2>T
,
-æD&2
>Tá;±234
。CaCO3./01µ¶c
ýBæ©2ç¤
,
34S,2TÂP&2>T
,
ï;©¾2âã}çéýæ¢Bæxy
。
@
µ45#62²³
,
0G
CaCO3PNH4HCO3p(´
µ2èéç¤-./01234Ýñ/2
。
01
T
L
´
Y
µ
¶
!
10
"
f1 CaCO3®NH4HCO3¼½Z[\^_`
Fig.1 EfectsoftheconcentrationsofCaCO3and
NH4HCO3onbutanolyield
Þ
2
è
2g/LNH4HCO3[\tCaCO3rK2HPO4
p(´µ-./>(234
。
Þ
2
Pà
:
µm8
µ)2
CaCO3PK2HPO4p(´µê{ËÀ./0
1
。
Péè
K2HPO4²K>T PO
3-
4 ,J)/0
1©c2
pH,
|I
,
>X#
pH
áYðñtJ
,
CaCO3ï;D:Þ»2´µâã},çéý
Þ»2Bæç¤
;
Oz
,
ëXsÒ2ªP
é(Gì2µ¶cí)ÿß2ç¤
,^
H.
/201µ¶c
,
ëXsPJ²K
;x
ed&2>T
[15]。
^
,K2HPO42p(´µ
í¶µ¯34/./2>T
,
Pés´µµm
8µ)ê{ËÀ
dÞ34S,>
Xr>/2éå
。
f
2 CaCO3®K2HPO4¼½Z[\^_`
Fig.2 EfectsoftheconcentrationsofCaCO3and
K2HPO4onbutanolyield
Þ
3
è
25g/LCaCO3[\t NH4HCO3r
K2HPO4p(´µ-./>(234。Þ3Pà:
Þ»´µâã}
,NH4HCO3P K2HPO4p(´µ2
m´;¿À,m./2>(
。
NH4HCO3p(´
f
3 NH4HCO3®K2HPO4¼½Z[\^_`
Fig.3 EfectsoftheconcentrationsofK2HPO4and
NH4HCO3onbutanolyield
µ-./>(234°
,
å
K2HPO42p(´µ
îµïÞâAÇ
,
./2>(ðñ[。
24
¹º§¾xy
ÂÃ
STATISTICA
Ê\289ðéýæ8
R5[:CaCO3、NH4HCO3PK2HPO42p(´µ
²Ýè
265、216
P
043g/L,
ˤ£¼£~²
³¥ºà
,
./2æ>(è
810g/L。
è/
Ø£~Ô¶2ñÄ`P;x`
,
89[\t
d./01Ø
,
yUÞ
4
Tß
。
Þ
4
Pà
:
./>(è
803g/L,
¥ºA±è±
,
*
ðy£~¥º±èò©
。
|89"
>(
521g/L
°
,
./>(,m/
5413%,
!
ðˤ456789<=T>./201[\Ý
P2
。
f
4
¤¥[\]
Fig.4 Curvesofbutanolfermentationbycanemolasses
3
x
)
ˤ
P B
¼>ú N34./012ÿó
E
,
¤æ¦§¨7;x¼´µâã}ôõ
ÁQö£2âAÑ
,
ˤ4567-<=01>
11
!
5
# q
ry
:
456789:;<=01>./
./201YZd89
,
¤X/./>(
3
Å
ÿó*2ÁwWÀK-«£~
,
|Iˤ£~2
456Pym$-34./>(2ÿó*rs
éç¤d²³
,
N:;<=01>./2æ
¢89[:CaCO3、NH4HCO3PK2HPO42p(´
µ²Ýè
265、216
P
043g/L。
ˤ£~Ô¶i
×./æ>(2¥ºAè
810g/L,
y
è
803g/L,
°89"ˤIgGHId01
,
.
/>(,m/
5413%。
L6j
:
[1] EzejiTC,KarcherPM,QureshiN,etal.Improvingperformance
ofagasstrippingbasedrecoverysystemtoremovebutanolfrom
Clostridiumbeijerinckifermentation[J].BioprocessBiosysEng,
2005,27:207214.
[2] NiY,SunZH.Recentprogressonindustrialfermentationoface
tonebutanolethanolbyClostridiumacetobutylicuminChina[J].
ApplMicrobiolBiotechnol,2009,83:415423.
[3] QureshiN,BlaschekHP.RecentadvancesinABEfermentation:
hyperbutanolproducingClostridiumbeijerinckiBA101[J].JInd
MicrobiolBiotechnol2001,27:287291.
[4]
÷¤}
,`
Kø
,
ùú
,
y
.
ˤ<=01T>./Sh2²
Ïqnrû»
[J].
üý»®
,2010(5):3235.
[5]
uþÿ
,
!"ã
,
ÿ#
,
y
.
<./0S01<=T>./
201[\89
[J].
$»¼
,2011,18(3):278282.
[6]
%Ä&
,
(T
,
)*
.
<=01T><./2ÅÓ
[J].
Y
ÆÑTL
,1999,29(2):2832.
[7] QureshiN,LolasA,BlaschekHP.Soymolassesasfermentation
substrateforproductionofbutanolusingClostridiumbeijerincki
BA101[J].JIndMicrobiolBiotechnol,2001,26:290295.
[8]
Ö+
,
,I-
,
7Ê
,
y
.L
.WX01¤<=¥öÔ7
ÅÓ
[J].
$Y¼/¼i
,2005,16(3):1618.
[9] OoijkaasLP,WilkinsonEC,TramperJ,BuitelaarRM.Medium
optimizationforsporeproductionofConiothyriumminitansusing
statisticalybasedexperimentaldesigns[J].BiotechnolBioeng,
1999,64:92100.
[10] MilerGL.Useofdinitrosalicylicacidreagentfordetermination
ofreducingsugar[J].AnalChem,1959,31(3):426428.
[11]
!01
,
¤
,
234
,
y
.
ˤ:;<=C01>.ÁX
2ÅÓ
[J].
c·üZ
,2010(5):3538.
[12] LiC,BaiJH,CaiZLa,etal.Optimizationofaculturalmedium
forbacteriocinproductionbyLactococcuslactisusingresponse
surfacemethodology[J].JBiotechnol,2002,93:2734.
[13]
567
,
5,
89Ë
,
y
.
:;¡STB579
æ¢G
HI456
[J].
oƼi
,2009,25(1):21221.
[14] MontgomeryDC.Designandanalysisofexperiments[M].New
York:JohnWiley&Sons,2001:427450.
[15] MitchelWJ.CarbohydrateuptakeandutilizationbyClostridium
beijerinckiNCIMB8052[J].Anaerobe,1996,2(6):
櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒
379384.
,-./
¿ÀÁpÂ\ÃÄÅÆ«aÇ
=ÂÝÞzm(2>?çL
,
sôõ¾5`Ü
,
Í
、
l
、
@¨P7ÅA2Bêé±³
TÂ
,
A-èÝ0hæà¥/>Ææ;äå2àÞ
。
#
,
c·»¼/µ¶Y¶ÅÓT=Âæà¥
/T>®¯ÅÓÔ6ßdh
,
ÅÓC(}`²
“
xD
”
¥ö®¯454©~01®¯
©
,
;xKE/6¡01®¯éFm
、
a
、
²Ë¤GÞyö÷
。
HI
,
Q®¯£¤@IÊwxDJ-=Âd¥ö
,
pK6¡¥/01YZcmÚwL
2h
2©9E
®µ¶
,
ÈT>
1t
¥/MpN
10t
E®¤b
,
T]éFáJ)N
33%,
T>Ê#?@
。
sw
,
wxDJ
{]ßo´OP9¼QR
,
PJKE9¼¼o´Zª2Áwaö÷
,
STm´µ;]b2>T
,
êë
ýaÒÍM
。
æÇ
,
wxDJ2ªU9¼ç¤
,
Y;VLWXJY
,
þ¸CDW-
、
2
<ˤ2{ËE
,
;=Â¥9%,m
,
xDöÇéZ±¤À01
。
Q®¯Dé(01[ÖLc,
=Â2<
、
¬\ày
,
Gಲ]G9
、^
©_mxˤ
。
Á"ÿ®¯ghªðµ`Ëa·bÉËÜc
,
;dªè=Âæà¥/>Æ0h2¿e
,
ed
}ªmx
、
_2=¾{é{9ˤ2T~>Æf
。
(
+
)
21
T
L
´
Y
µ
¶
!
10
"