全 文 ：Aug．2007·38·生物加工过程Chinese
Joumal ofBioprocess
Engineering 第5卷第3期2007年8月
金龟子绿僵茵固态发酵产壳聚糖酶刘桦，张涛，王玉明
(成都医学院
医学检验系生物化学与分子生物学教研室，成都610083)
摘要：对金龟子绿僵茵(A如￡岔小玩“舰勰蠡opzi雠)AS3．4606产壳聚糖酶进行了固态发酵条件优化及酶学部分特征
的研究。正交实验结果表明，以麸皮为碳源，日本根霉菌丝体粉末为氮源，在起始pH5．0，m(碳)：m(氨)为1：4，
m(干重)：ml凹引i霪i；i、耋j蚕窭荔誉酶冀i妻善摹；茎毛掣手墓瑙鬟囱i；=爹}裹塞!荔些垂羹i，剧引药鎏《降舔薹黧
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膜表面的疏水和亲水性质对酶活性的影响。
相对于树脂而言，纤维素是天然可再生的材
料，而且易得 、价廉。以纤维素为主要成分的帆布
具有较高的强度和支撑性，适宜于作脂肪酶的固定
化载体，并且适合工业化生产应用。纤维素结构中
存在着大量的羟基，通过高碘酸钠将连接邻二羟基
的碳键(c2、C3位健)氧化成醛基¨1，继而与酶蛋白
上的胺基进行醛胺缩合反应形成希夫碱H8。9J，通过
共价交联得到 固定化脂肪酶。本文将就帆布的活
化方法、脂肪酶的固定化及其性能进行较为系统的
研究，研究结果对其他酶的固定化也有借鉴作用。
1 实验部分
1．1试剂与药品
实验用酶：粗制干粉假丝酵母脂肪酶A．S．2．
1405菌种，经深层发酵后制得，购自无锡酶制剂厂；
固定化载体：所用帆布为市售白帆布，厚度1．08
mm；实验用药品：高碘酸钠，亚硫酸氢钠，碘，聚乙烯
醇，橄榄油等均为市售分析纯试剂。
1．2实验方法
脂肪酶的固定化分为帆布活化、酶液制备和交
联 3个步骤。
1．2．1帆布活化
剪取4mm×4mm的四方帆布块，用0．6mol／L
KOH溶液浸泡30min以便除去帆布表面吸附的杂
质，然后用NalO。溶液氧化，经过一段时间后取出用
去离子水洗净，加入一定量甘油反应20min，除去未
反应的NalO。，洗净待用。
1．2．2酶液制备
称 5g粗制干粉脂肪酶溶于50mL0．025mol／L
的磷酸缓冲液(pH7．5)中，搅拌均匀，再用超声波
细胞粉碎机分两次间歇破碎10min，使胞内酶充分
溶出。在8000r／min转速下离心10min，然后取上
清液贮于冰箱内备用。
万方数据
2007年8月 刘桦等：金龟子绿僵菌固态发酵产壳聚糖酶的研究 ·39·
方法。
本研究以糖化工业中常见的根霉菌丝体替代
纯壳聚糖为诱导原料，对金龟子绿僵菌固态发酵产
壳聚糖酶的培养条件及部分酶学性质进行了研究。
1材料与方法
1．1 菌种
日本根霉(R^却w冲onicw)由中国科学院成
都生物所提供。金龟子绿僵菌(讹fo如如ium口n括o．
彬oeAs3．4606)购于中国科学院微生物研究所。
1．2试剂
壳聚糖(脱乙酰度≥90％，上海伯奥生物科技
有限公司)，盐酸氨基葡萄糖(中国医药集团上海试
剂公司)，其他试剂均为分析纯。
1．3培养基
1．3．1营养盐溶液
MgS04．5∥L，KH2P040．5g／L，KCl0．5g／L，
FeS04·7H200．01g／L，ZnS040．1∥L，pH5．0。
1．3．2斜面培养基
土豆汁20g／L，葡萄糖2∥L，琼脂1．5g／L，
MgS04·7H200．5g／L，K2HP040．3g／L，pH5．6。
1．3．3液体种子培养基
蛋白胨10g／L，酵母浸膏10∥L，葡萄糖5g／L。
1．4培养条件
1．4．1 日本根霉菌丝体的制备
参考文献[11]的方法。
1．4．2种子培养
在250mL三角瓶中加入100mL培养液，灭菌
后，接种金龟子绿僵菌AS3．4606孢子液3mL，于26
℃，150r／min振荡培养3d后作为绿僵菌种子液。
1．4．3固态发酵及条件选择优化
称取适量根霉干燥菌丝体粉末和麸皮，加入
0．8g木屑作为固态发酵培养基。取10g干培养基
加入到250mL三角瓶中，121℃灭菌30min。取灭
菌好的固体培养基，加入营养液和3mL金龟子绿僵
菌As3．4606种子液，搅拌均匀，恒温培养。按照拟
定培养温度(A)、培养基起始pH值(B)、发酵时间
(c)、培养基碳源氮源比例(D)、培养基固体与营养
液质量比(E)这5个因素，每个因素取4个水平(表
1)，按照正交表L，。(45)进行正交试验，每组3瓶，考
察每组单位于培养基产壳聚糖酶的活力，选择最佳
培养条件，并做验证实验。
1．5 固态发酵酶液的制备和部分酶学性质研究
1．5．1 固态发酵酶液的制备
取一瓶培养好的金龟子绿僵菌固体曲，加入
100mL醋酸缓冲液(pH5．6，20mmoL／L)捣碎，机械
搅拌1h，四层纱布过滤。收集滤液，50％～75％冷
丙酮分级沉淀。将沉淀溶于醋酸缓冲液中即得壳
聚糖酶液，供测定用。
表1 正交试验因素水平表
Table1 Factorsfonhogonaldesigntest
1．5．2壳聚糖酶酶学性质研究
取壳聚糖酶液，测定其在不同温度、pH、底物浓
度等条件下的酶活力大小，研究其最适温度、最适
pH、温度稳定性、酸碱稳定性等性质。
1．6 分析方法
1．6．1壳聚糖含量测定方法
采用茚三酮显色比色法¨21测定菌丝体的壳聚
糖含量。
1．6．1蛋白质含量测定方法
采用考马氏亮兰G250测定方法‘13|。
1．6．2壳聚糖酶活力测定
参考文献[14]，采用二甲氨基苯甲醛(PMAB)
法。以盐酸氨基葡萄糖(GlcN—Hcl)溶液做标准曲
线。一个酶活力单位定义为每分钟释放1¨gGlcN—
HCl还原糖所需要的酶量。
2结果与讨论
2．1 日本根霉菌丝体的制备
将日本根霉发酵液过滤，得到为乳黄色，多聚
集呈长条状的菌丝体。121℃干燥、粉碎后获得黄
褐色的菌丝体粉末。通过茚三酮法测定壳聚糖质
量分数为10．22％。
2．2金龟子绿僵菌AS3．4606固态发酵情况
发酵36h后，固态培养基上出现散落的金龟子
万方数据
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