全 文 ：第 ! 卷第 # 期
#$%% 年 & 月
生"物"加"工"过"程
9=QCJ(JTDIOCBEDN\QD)ODHJ((@CMQCJJOQCM
2DE*! -D*#
B`O*#$%%
KDQ"%$*&!7!:e*Q((C*%78# 6&783*#$%%*$#*$$3
收稿日期"#$%$ 6$8 6%#
作者简介"胡慧东#%!3%$&男&山西吕梁人&硕士研究生&研究方向"微生物固态发酵(许赣荣#联系人$&教授&@FPBQE"MOGI%#&f%#7*HDP
黑曲霉固态发酵及酶解玉米皮
胡慧东&许赣荣
#江南大学 生物工程学院 工业生物技术教育部重点实验室&无锡 #%0%##$
摘"要"以玉米提取淀粉后的玉米皮渣为主要原料&采用黑曲霉固态发酵法产酶再酶解的二步法降解玉米皮中纤
维素类物质 经>EBHcJAF\IOPBC法及响应面设计优化发酵条件得"温度 &$ k&接种量 %$g&初始水分体积分数
7$g&物料厚度#j08 HP&初始 ).j8!&发酵时间7 K(滤纸比酶活可达%%j$% S:M&较原始酶活提高了 0$j7%g(产酶
结束后加入 ).0*3 醋酸 醋酸钠缓冲液&置于 $ k下酶解 %00 =&中性洗涤纤维与酸性洗涤纤维降解率分别为
07j$!g)03j3#g&还原糖质量分数达到 !j$#g
关键词"黑曲霉(纤维素(玉米皮(降解(固态发酵(
中图分类号"d+!#$j!""""文献标志码"Y""""文章编号"%78# 6&783##$%%$$# 6$$&! 6$
a0;45H5E.2/27:24/K45/KM 126.HF1E5E0704J0/E5E.2/31./; :";#*<0($",0<#*
.S.IQKDCM&1SWBCODCM
#_JXUB;DOBADOXDN,CKI(AOQBE\QDAJH=CDEDMXDNA=J` QCQ(AOXDN@KIHBAQDC&4H=DDEDN\QDAJH=CDEDMX&TQBCMCBC SCQZJO(QAX&RIGQ#%0%##&9=QCB$
*K1E45:E"d=JOJ(QKIJ(DNHDOC ;OBC LJOJI(JK B(PBQC (I;(AOBAJ(NDO(DEQKF(ABAJNJOPJCABAQDC# 44[$
BCK A=JHJEIED(JQC HDOC ;OBC LB(KJMOBKJK*d=JNQO(A(AJ) LB(HJEIEB(J)ODKIHAQDC LQA= 9":#*;2($"
G2;#*;X44[BCK A=J(JHDCK (AJ) LB(JC
\IOPBC BCK bJ()DC(J4IONBHJ` JA=DK(LJOJI(JK NDOD)AQPQ
#j08 HP&).DNj8!&NJOPJCABAQDC AQPJ7 K*d=JNQEAJO)B)JOBHAQZQAXLB(%%j$% S:MBCK QCHOJB(JK
0$j7%g =QM=JOA=BC A=JDOQMQCBEJC
AJCALB(!j$#g*
L0M I24H1"9":#*;2($",2;#*( HJEIED(J( HDOC ;OBC( KJMOBKBAQDC( (DEQKF(ABAJNJOPJCABAQDC
""玉米皮是玉米籽粒的表皮部分&是玉米淀粉加
工的副产物&含淀粉 #$g)纤维素 %%g)半纤维素
&3g)蛋白质 %%j3g)灰分 %j#g*%+ #以质量分数
计$ 我国玉米皮的利用率很低&通常被用作廉价
饲料&甚至直接丢弃&造成资源浪费 近年来&玉米
皮的再利用得到了越来越广泛的关注&有文献报道
可以利用玉米皮生产柠檬酸*#+ )微生物孢子*&+ )蛋
白饲料*0+等 由于玉米皮中纤维素类物质含量很
高&但对其利用有限&所以很有必要降解其中的纤
维素类物质 目前&降解玉米皮中纤维素的方法主
要有酸解法* 67+ )碱解法*8+以及酶解法*3 6%$+ &但是
用酸解或碱解会产生大量的废水 而酶解法反应
条件温和&效率高&价格昂贵&且需多种酶共同作用
才有良好的效果 本研究利用玉米皮作原料&固态
发酵培养黑曲霉&由黑曲霉在生长过程中所产的复
合酶再酶解玉米皮中的纤维素类物质&以期简化酶
的提取过程&提高降解效率
C?材料与方法
C=C?实验材料
黑曲霉. &由江南大学工业生物技术教育部
重点实验室保藏(玉米皮&由山东菱花集团有限公
司提供(麸皮&购自无锡市三里桥农贸市场
C=@?培养基
%$斜面培养基"麸皮%$$ M&琼脂#$ M&水% U&
).自然&%#% k灭菌#$ PQC 麸皮煮沸&$ PQC&纱布
过滤&再加入琼脂&溶化后补足水至% U
""#$种子培养基"羧甲基纤维素纳%$ M&#-.
0
$
#
45
0
%j0 M&_.
#
>5
0
#j$ M& M`45
0
$j& M&水% U& ).自然&
%#% k 灭菌 #$ PQC
""&$固态发酵培养基#每个三角瓶用量&以干物料
计$"玉米皮#粉碎过#$
"
P筛$%!j# M&麸皮 0j3 M&
M`45
0
$j& M&_
#
.>5
0
$j7 M&%#% k 灭菌 &$ PQC
C=O?玉米皮的固态发酵及酶解
将活化后的斜面菌株黑曲霉 . 接入种子培
养基&置于&$ k恒温摇床培养&03 =后作为固态发
酵种子液 同时将黑曲霉. 种子液接于一定量
的固态发酵培养基中&调整料水比&并调整初始 ).&
混合均匀&置于&$ k恒温培养箱固态发酵7 K&每个
实验设 & 个重复试样
发酵结束后&立即加入&$$ PU)$j# PDE:U)).
0j3 醋酸 醋酸钠缓冲液&置于$ k培养箱中酶解
%00 =&同时用封口膜将瓶口扎紧&以防水分蒸发
C=P?分析方法
""中性洗涤纤维#-^ [$)酸性洗涤纤维#Y^ [$)酸
性洗涤木质素#Y^ U$含量的测定采用范式法*%% 6%&+ (
水分的测定采用红外水分分析法(还原糖含量测定采
用 && 二硝基水杨酸比色# -^4比色$法*%0+
酶活测定以滤纸酶活为主要指标& 9` 9酶
活*%+ )木聚糖酶活*%7+为辅
滤纸酶活 #[>Y$ 测定方法"取# PU的比色
管&加入%j PU).0j3 醋酸 醋酸钠缓冲液&再加
入滤纸条$ PM#约% HPp7 HP&将滤纸条卷成小卷
放入比色管中$&在$ k水浴中预热 h%$ PQC&再
加入酶液$j PU&$ k水浴中保温% =后取出&立即
往比色管中加入& PU -^4溶液以终止酶反应&充分
摇匀后沸水浴 PQC&取出冷却后用蒸馏水定容至
# PU&充分混匀 以%$$ k沸水浴中灭活 PQC的
粗酶液为空白对照调零点&在0$ CP波长下测定比
色管液的光密度值并记录结果 固态发酵酶活力
计算公式"
""滤纸酶比活力o
""
+#葡萄糖$ p稀释倍数 p*7
?#反应液中酶液$ p+#试样$ p时间 #%$
将在一定反应条件#).)温度$下&每分钟由底
物生成%
"
PDE葡萄糖所需的酶量&定义为一个滤纸
酶活力单位#S:M$
C=Q?发酵工艺条件优化
选择培养基含水量)麸皮含量)dOQAQDC 含量)装
料量) 玉米浆) _.
#
>5
0
) M`45
0
) 葡萄糖含量)
#-.
0
$
#
45
0
)初始 ).)9I45
0
%% 个因素&以发酵产物
的滤纸酶活作为考察指标&进行 >EBHcJAF\IOPBC 试
验&选出显著性好的因素进行中心组合设计&以获
得产酶最优条件
@?结果与讨论
@=C?X65:b0EF834J5/设计法筛选纤维素酶发酵
条件的重要影响因素
""根据固态发酵培养特性以及黑曲霉生长所需
营养要素的基本原则和发酵影响因素的一般规律&
本试验选用实验次数Go% 的实验设计&对含水量
#Y$ )麸皮含量#\$)dOQAQDC 质量分数#9$)物料层
厚度 # $^)玉米浆 #@$)_.
#
>5
0
质量分数 #[$)
M`45
0
质量分数 #W$)葡萄糖质量分数 #.$)
#-.
0
$
#
45
0
质量分数#,$)初始 ).#T$)9I45
0
质量
分数#_$%% 个因素进行考察&每个因素取 # 个水
平&响应值为滤纸比酶活#M$ 另设 & 个中心点 对
实验结果进行分析&得出各因素的 D值和 !值 一
般选择!值 q$j$ 的因素作为重要因素 实验设
计及实验结果见表 %&各因素主效应分析结果见表
# 由于@)[).和 ,这 0 个影响因子 !值过低&显
著性不好&因此在表 # 中未列出
$0 生"物"加"工"过"程"" 第 ! 卷"
表 C?X8试验因素和水平设计
D5K60C?X65:b0EF834J5/0G904.J0/E56H01.;/J5E4.G 5/H0G904.J0/E5640136E1
实验号 Y \ 9 ^ @ [ W . , T _
M:#S!M
6%
$
% % % % 6% 6% 6% % 6% % % 6% 8j87
# 6% 6% 6% % 6% % % 6% % % % 8j$3
& 6% % % 6% % % % 6% 6% 6% % 8j7%
0 6% % % % 6% 6% 6% % 6% % % 8j0
$ $ $ $ $ $ $ $ $ $ $ 8j%#
7 % 6% % % 6% % % % 6% 6% 6% !j30
8 % % 6% % % % 6% 6% 6% % 6% 8j07
3 % 6% % % % 6% 6% 6% % 6% % !j88
! 6% % 6% % % 6% % % % 6% 6% 8j!!
%$ % % 6% 6% 6% % 6% % % 6% % 3j8
%% $ $ $ $ $ $ $ $ $ $ $ 8j%
%# 6% 6% % 6% % % 6% % % % 6% 3j$3
%& % 6% 6% 6% % 6% % % 6% % % 7j!
%0 $ $ $ $ $ $ $ $ $ $ $ 8j%7
% 6% 6% 6% 6% 6% 6% 6% 6% 6% 6% 6% 8j8
表 @?各因素的主效应
D5K60@?S0W06127W54.5K6015/H75:E241./
X65:b0EF834J5/H01.;/
实验
因素
水平
6% %
D值 !值 显著性
Y $ 7$ %&*07 $j$%$ &
\ 3 %$ 0*%# $j$33 8 8
9 $j0 $j ##j!& $j$$& $ #
^ #j% #j7 !j% $j$#% 7 0
W $j $j7& 0*& $j$88 0 7
T %j$ %j# *%! $j$7& $
_ * 7*! 0#j73 $j$$$ 7 %
""由表 % 和表 # 可知"黑曲霉固态发酵玉米皮产
纤维素酶发酵过程中&初始 ).)dOQAQDC 质量分数)含
水量和物料层厚度 0 个因素对纤维素酶产量影响显
著&且!值 q$j$&可考虑作为主要因素进一步作
响应面实验 而其他因素的取值则根据各因素效
应的正负和大小"正效应的因素均取较高值&负效
应的因素均取较低值
@N@?中心组合法优化工艺条件
""以初始 ).#=
%
$)dOQAQDC 质量分数#=
#
$)含水量
#=
&
$以及物料厚度#=
0
$四因素为考察对象&以滤纸
比酶活#S:M$为响应值 M
%
&运用 J^(QMC @G)JOA8j$
软件进行中心组合响应面设计 因素和水平的具
体安排及试验设计分别见表 & 和表 0
表 O?中心组合实验变量及其水平
D5K60O?S0W0615/H75:E241./0G904.J0/E56H01.;/
因素
水平
6%j73# 6% $ % %j73#
=
%
0j77 j$ j 7j$ 7j&0
=
#
$j#& $j& $j0 $j $j8
=
&
#%j! 7$ 7 73j0%
=
0
$j&# %j$ #j$ &j$ &j73
%0"第 # 期 胡慧东等"黑曲霉固态发酵及酶解玉米皮
表 P?中心组合实验设计及其结果
D5K60P?,,aH01.;/5/H0G904.J0/E5640136E1
实验号
因素
=
%
=
#
=
&
=
0
M
%
:
#S!M
6%
$
% $ $ $ %j73# !j$7
# 6% 6% 6% 6% 3j%0
& % % % 6% %$j7
0 %j73# $ $ $ %$j$
6%j73# $ $ $ !j&
7 6% % % % 8j$%
8 % 6% % % %$j&&
3 $ $ $ 6%j73# 3j3$
! $ %j73# $ $ %$j%#
%$ $ $ $ $ %$j8#
%% % 6% 6% % !j!
%# $ $ 6%j73# $ !j70
%& $ $ %j73# $ %$j0#
%0 $ $ $ $ %$j7!
% $ $ $ $ %$j8$
%7 6% 6% % 6% 3j7$
%8 6% % 6% % 8j7
%3 $ 6%j73# $ $ %$j$7
%! % % 6% 6% !j#$
""根据表 0 结果&运用 J^(QMC @G)JOA8j$ 软件&对
试验数据进行四元二次线性回归分析&得到回归方
程"M
%
o%$j3 /$j#!=
%
/$j$%8=
#
/$j#%=
&
/$j$8!=
0
/
$j#8=
%
=
#
/ $j#0=
%
=
&
/$j&0=
%
=
0
6$j$%7=
#
=
&
6
$j8!=
#
=
0
6$j#7=
&
=
0
6$j&7=
#
%
6$j&&=
#
#
6$j&=
#
&
6
$j80=
#
0
回归方程方差分析显著性检验表明"方程
的D值为 %&j$!&!值为$j$%% 8 说明该模型回归
显著 另外该模型决定系数 C# o$j!83 7&说明回
归方程的拟合程度较好&预测值和实测值之间具有
高度的相关性
用 J^(QMC @G)JOA8*$ 对其最大值进行预测得"
当=
%
o*8!&=
#
o$j08&=
&
o!j&&&=
0
o#j08 时&滤
纸比酶活达到最大值%%j$% S:M&经过 & 次实验验
证&滤纸比酶活分别为 %$j8)%%j&0 和%$j3! S:M
由验证结果可知&实验值与预测值吻合良好&该方
程可在考察范围进行有效预报 同时对 9` 9酶活
与木聚糖酶活作了考察&& 次实验平均为 8&j#7
和% #!8j#! S:M&
@=O?纤维素类物质质量随酶解时间的变化
由于酶是由微生物固态发酵得到&所以酶的
成分比较复杂 酶解过程是以纤维素酶)半纤维
素酶以及其他酶所组成的酶系对玉米皮中的纤维
素类物质进行降解&在酶解过程中分别考察了中
性洗涤纤维#-^ [$)酸性洗涤纤维# Y^ [$)滤纸酶
活以及还原糖质量随酶解时间的变化&结果如图 %
所示
图 C?纤维素类物质质量随酶解时间的变化
U.;=C?#70:E127E.J0I.E-0/[MJ5E.:-MH426M1.1
""从图 % 可以看出"随着酶解的进行&-^ [与
Y^ [质量逐渐降低&同时还原糖质量逐渐增加&这
就说明纤维素物质不断被降解成单糖 滤纸酶活
在酶解初期不断上升&酶解8# =时达到7j&# S:M&
随即开始下降&当时间大于%00 =后&酶活显著下降&
纤维素物质质量基本保持不变&同时还原糖质量也
基本不再增加&此时可判定酶解结束
在酶解过程中&经过最初的8# =&总滤纸酶比活
力从最初的%&j! S:M上升到7j&# S:M&这是由于
缓冲液加入后&随着时间的进行&酶不断从固体中
溶出造成液体中滤纸酶活上升 而且在此阶段&
-^ [)Y^ [)还原糖质量的变化也是最显著的
@=P?发酵前与酶解后玉米皮中纤维素类物质质量
的比较
""玉米皮经发酵产酶)酶解 # 个步骤处理后&中性
洗涤纤维及酸性洗涤纤维质量分别从发酵前的
%0j!8)&j&3 M降至3j$8)%j8& M&降解率达到07j$!g)
03j3#g 还原糖质量从$j$83 M上升至%j3$0 M&具体
数据如表 所示
#0 生"物"加"工"过"程"" 第 ! 卷"
表 Q?玉米皮发酵前与酶解后主要指标比较#以干物质计$
D5K60Q?,2J954.12/27b0M ./H.:5E241K07240704J0/E5E.2/
5/H57E04-MH426M1.1#./E04J127H4M J5E04$?;
项目 +#-^ [$ +#Y^ [$ +#还原糖$
发酵前 %0j!8 &j&3 $j$83
酶解后 3j$8 %j8& %j3$0
O?结论
本研究用 >EBHcJAF\IOPBC 设计法和响应面分
析法对黑曲霉以玉米皮为底物固态发酵产酶的条
件进行了优化&获得最佳培养基组成"玉米皮与麸
皮质量比 3i#&水分质量分数 !j&&g&dOQAQDC 质量
分数 $j08g&物料厚度#j08 HP&).j8!(在&$ k发
酵7 K&滤纸比酶活由优化前 8j3& S:M提高到
%%j$% S:M&增加了 0$j7%g
玉米皮经黑曲霉固态发酵产酶)酶解两步法处
理&简化了酶的提取过程&使酶的损失达到最小&提高
了降解效率 酶解%00 =&中性洗涤纤维及酸性洗涤
纤维降解率分别为 07j$!g)03j3#g&还原糖质量分
数从 $j&!g上升至 !j$#g 玉米皮营养价值得到了
提高&也可作为后续发酵产品所用9源&不仅减少了
成本&而且为玉米皮的用途提供了更多的选择
参考文献"
* % +"尤新*玉米深加工技术* +`*# 版*北京"中国轻工业出版社&
#$$3"#0#F#0&*
* # +".BCM] &^RDDKBP(@@*9DOC =I(c" B)DAJCAQBE(I;(AOBAJNDO
)ODKIHAQDC DNHQAOQHBHQK ;X9":#*;2($",2;#**T+*UJ;JC(PFRQ((
dJH=CDE&#$$$&&&"#$F#%*
* & +"UQ9]&_QP.R&RDC 4 b&JABE*9DOC =I(c B(B)DAJCAQBE
(DIOHJDNBCA=DHXBCQC(*T+*YMOQHIEAIOBEBCK [DDK 9=JPQ(AOX&
#$$3&7" %%0%&F%%0%7*
* 0 +"王普&虞炳钧&陈铭&等*玉米皮渣直接固态发酵生产饲料蛋
白的研究*T+*饲料工业&%!!8&%3#7$"#7F#3*
* +"姜岷&姚嘉&吴昊&等*稀酸水解玉米皮制备丁二酸发酵糖
液的研究*T+*食品与发酵工业&#$$8&&&#%$$"7F!*
* 7 +"李道义&闫巧娟&江正强&等*酵母菌发酵玉米皮酸水解液制
备结晶 - 阿拉伯糖的研究*T+*食品科学&#$$8 #0$"
%#F%#3*
* 8 +"罗艳玲&欧仕益*碱解玉米皮制备阿魏酸的研究*T+*中国食
品学报&#$$8&8#$"!8F%$$*
* 3 +".BCM] &^RDDKBP(@@*@C
* ! +"詹小明*酶法降解玉米皮制备功能性寡糖的研究* +^*杭州"
浙江大学&#$$*
*%$+"薛枫*双酶法降解玉米鼓皮制备阿魏酸和低聚糖的研究
* +^*广州"暨南大学&#$$7*
*%%+"国家技术监督局*W\:d#$3$7%#$$7 饲料中中性洗涤纤维
#-^ [$的测定*4+*北京"中国标准出版社&#$$8*
*%#+"中华人民共和国农业部*-]:d%0!%#$$8 饲料中酸性洗涤
纤维的测定*4+*北京"中国农业出版社&#$$8*
*%&+"国家技术监督局*W\:d#$3$%#$$7 饲料中酸性洗涤木质
素#Y^ U$的测定*4+*北京"标准出版社&#$$8*
*%0+"齐香君&苟金霞&韩戌臖&等*&& 二硝基水杨酸比色法测定
溶液中还原糖的研究*T+*纤维素科学与技术&#$$0&%##&$"
%8F%!*
*%+"王琳&刘国生&王林嵩&等*^-4 法测定纤维素酶活力最适条
件研究*T+*河南师范大学学报"自然科学版&%!!3#&$"
77F7!*
*%7+"曾莹&钟晓凌&夏服宝*木聚糖酶活力测定条件研究*T+*生物
技术&#$$&&%&#$"#%F##*
&0"第 # 期 胡慧东等"黑曲霉固态发酵及酶解玉米皮