全 文 ：第７卷第６期
２００９年１１月
生 物 加 工 过 程
ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｐｒｏｃｅｓｓＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ．７Ｎｏ．６
Ｎｏｖ．２００９
ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１７６２－３６７８．２００９．０６．０１０
收稿日期：２００８－１２－２３
作者简介：焦士蓉（１９６８—），女，安徽安庆人，副教授，博士，研究方向：营养与食品卫生，Ｅｍａｉｌ：ｊｓｒｏｎｇ２００４＠１６３．ｃｏｍ
油菜花粉总黄酮的微波辅助提取及其
抗氧化活性研究
焦士蓉１，王 玲２，赵 燕１，郭子玉１，马 灵１
（１．西华大学 生物工程学院，成都 ６１００３９；２．西华大学 理化学院，成都 ６１００３９）
摘 要：采用微波辅助提取法提取油菜花粉总黄酮，通过单因素和正交试验，得到最佳提取条件：８０％的乙醇、１∶２０
的料液比、提取时间１４０ｓ、微波功率２４２Ｗ、提取３次，总黄酮质量分数为（２６４±００５）％。同时还研究提取物对
羟自由基、ＤＰＰＨ自由基的清除作用，以及对小鼠肝组织脂质过氧化的抑制作用，自由基半清除质量浓度和脂质过
氧化半抑制质量浓度分别为０１１５、０３２５和００６５ｍｇ／ｍＬ。
关键词：油菜花粉；总黄酮；微波辅助；抗氧化活性
中图分类号：Ｓ８９６．４ 文献标志码：Ａ 文章编号：１６７２－３６７８（２００９）０６－００５１－０４
Ｍｉｃｒｏｗａｖｅａｓｓｉｓｔｅｄｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｏｆｆｌａｖｏｎｏｉｄｓｆｒｏｍｒａｐｅｐｏｌｅｎａｎｄ
ｔｈｅａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｔｈｅｅｘｔｒａｃｔｓ
ＪＩＡＯＳｈｉｒｏｎｇ１，ＷＡＮＧＬｉｎｇ２，ＺＨＡＯＹａｎ１，ＧＵＯＺｉｙｕ１，ＭＡＬｉｎｇ１
（１．ＳｃｈｏｏｌｏｆＢｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｏｆＸｉｈｕａＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｅｎｇｄｕ６１００３９，Ｃｈｉｎａ；
２．ＳｃｈｏｏｌｏｆＰｈｙｓｉｃａｌａｎｄＣｈｅｍｉｃａｌｏｆＸｉｈｕａＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｅｎｇｄｕ６１００３９，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｏｆｆｌａｖｏｎｏｉｄｓｆｒｏｍｒａｐｅｐｏｌｅｎｗｉｔｈｍｉｃｒｏｗａｖｅａｓｓｉｓｔｅｄｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ（ＭＡＥ）ａｎｄ
ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｔｈｅｅｘｔｒａｃｔｓｗｅｒｅｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｄｅｓｉｇｎｓｏｆｓｉｎｇｌｅｆａｃｔｏｒａｎｄｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ
Ｌ９（３
４）ｗｅｒｅｏｐｔｉｍｉｚｅｄ．Ｔｈｅｏｐｔｉｍｉｚｅｄｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｗｅｒｅａｓｆｏｌｏｗｓ：ｍ（ｅｔｈａｎｏｌ）／ｍ（ｒａｐｅｐｏｌｅｎ）＝２０，
ｍｉｃｒｏｗａｖｅｐｏｗｅｒ２４２Ｗ，ａｎｄｔｈｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ３ｔｉｍｅｓｗｉｔｈｔｈｅｍｉｃｒｏｗａｖｅｆｏｒ１４０ｓ，ｅｔｈａｎｏｌｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
８０％．Ｕｎｄｅｒｔｈｅｓｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，ｔｈｅｙｉｅｌｄｏｆｔｏｔａｌｆｌａｖｏｎｏｉｄｓｗａｓ（２６４±００５）％．Ｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆ
ｅｘｔｒａｃｔｓｆｏｒｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ５０％ ｒａｄｉｃａｌｏｒｉｎｈｉｂｉｔｏｒ５０％ ｌｉｐｉｄｐｅｒｏｘｉｄａｔｉｏｎｗｅｒｅ０１１５ｍｇ／ｍＬ，０３２５
ｍｇ／ｍＬａｎｄ００６５ｍｇ／ｍＬ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｒａｐｅｐｏｌｅｎ；ｔｏｔａｌｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ；ｍｉｃｒｏｗａｖｅａｓｓｉｓｔｅｄ；ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔａｃｔｉｖｉｔｙ
花粉是全能的营养库［１］，具有防衰老、抗氧化、
辅助治疗其他疾病等功能［２］，因此对花粉活性物质
的研究尤为重要。
目前，对油菜花粉黄酮的提取主要采用冷浸法和
水浴回流法［３］，此法为黄酮类物质常用提取方法，但溶
剂用量大、耗时长。微波提取技术操作简便、省时、节
能，广泛用于天然产物的浸提，提高了提取效率［４］。
本研究以油菜花粉为对象，探讨总黄酮微波辅
助提取的最佳条件，同时对总黄酮提取物的体外抗
氧化活性进行研究。
１ 材料与方法
１１ 材料
油菜花粉，购于农贸市场；芦丁标准品（批号
１０００８０ ２００３０６），北京生物制品检定所；２，２ 二苯
代苦味酰基（２，２ｄｉｐｈｅｎｙｌ２ｐｉｃｒｙｌｈｙｄｒａｚｙｌ，ＤＰＰＨ），
Ｓｉｇｍａ公司，其余试剂均为分析纯。普通级昆明小
鼠，雄性，体重２０～３０ｇ，四川大学实验动物中心。
１２ 测定方法
１２１ 总黄酮测定
采用分光光度法，芦丁为标准品，操作方法参照
文献［５］。取一定浓度试样，加体积分数３０％的乙醇
至５ｍＬ，加质量分数５％的ＮａＮＯ２０３ｍＬ，摇匀，放置
６ｍｉｎ，加质量分数１０％的Ａｌ（ＮＯ３）３０３ｍＬ，摇匀，再
放置６ｍｉｎ，加质量分数４％的ＮａＯＨ４ｍＬ，各用蒸馏
水稀释至１０ｍＬ，放置１５ｍｉｎ，在波长５１０ｎｍ处测定
吸光度（蒸馏水作空白）。标准品回归方程为
ｍ１＝０９３８５Ａ ０００９１ （Ｒ
２＝０９９９５） （１）
式中：ｍ１为从回归方程计算得试样中黄酮质量
（ｍｇ），Ａ为吸光度。
试样中总黄酮提取率计算公式为
ｐ＝
ｍ１×Ｖ×ｎ
ｍ２×Ｖ１×１０
３×１００％ （２）
式中：ｐ为试样中总黄酮提取率（％），ｎ为稀释倍
数，Ｖ为浓缩液总体积（ｍＬ），Ｖ１为测定体积（ｍＬ），
ｍ２为投料量（ｇ）。
１２２ 羟自由基的清除能力
采用Ｆｏｎｔｏｎ反应方法，操作方法参照文献［５］。
取０７５ｍｍｏｌ／Ｌ邻二氮杂菲溶液１ｍＬ，磷酸盐缓冲液
（ＰＢＳ液，ｐＨ７４０）２ｍＬ和蒸馏水１ｍＬ，充分混匀后，
加 ０７５ｍｍｏｌ／ＬＦｅＳＯ４１ｍＬ，混匀，加体积分数
００１％的Ｈ２Ｏ２１ｍＬ，于３７℃温育６０ｍｉｎ，于５３６ｎｍ
处测其吸光度，其值为ＡＰ。用１ｍＬ蒸馏水代替１ｍＬ
体积分数００１％的Ｈ２Ｏ２，测得吸光度为ＡＢ。用试样
１ｍＬ代替１ｍＬ蒸馏水，测得吸光度为ＡＳ。测定羟自
由基清除率ｄ１，计算公式为
ｄ１ ＝
ＡＳ－ＡＰ
ＡＢ－ＡＰ
×１００％ （３）
１２３ ＤＰＰＨ自由基的清除作用［６］
准确称取 ＤＰＰＨ标准品２０ｍｇ，无水乙醇溶解
定容至 ５００ｍＬ，得质量浓度为 ００４ｍｇ／ｍＬ溶液。
取此溶液３ｍＬ，加入不同浓度的试样溶液１ｍＬ，室
温，３０ｍｉｎ，测定吸光度值 Ａ５１５，空白组以１ｍＬ无水
乙醇代替试样，清除率ｄ２计算公式为
ｄ２＝（１－Ａ试样／Ａ空白）×１００％ （４）
１２４ 脂质过氧化抑制作用［７］
小鼠处死后取肝组织，洗净血污，剪碎用生理
盐水制成３％匀浆，取０３ｍＬ加人各种试剂，反应
液总体积为 ０６７ｍＬ，含不同质量浓度试样 ０１７
ｍＬ，体积分数０００２４％Ｈ２Ｏ２０１ｍＬ，００３ｍｍｏｌ／Ｌ
ＦｅＳＯ４０１ｍＬ，３７℃保温６０ｍｉｎ，加入１ｍＬ质量分
数２０％三氯醋酸及１ｍＬ质量分数０６７％硫代巴比
妥酸（ＴＢＡ），９０℃保温１５ｍｉｎ后水冷，４０００ｒ／ｍｉｎ
离心２０ｍｉｎ，取上清液测定Ａ５３２，Ｈ２Ｏ代替ＴＢＡ的平
行实验管为各实验比色空白，蒸馏水代替药液的反
应管为空白管，脂质过氧化抑制率Ｅ的计算公式为
Ｅ＝［（Ａ空白 －Ａ试样）／Ａ空白］×１００％ （５）
２ 结果与讨论
２１ 微波辅助提取单因素试验
２１１ 乙醇体积分数的选择
精确称取２ｇ油菜花粉，料液比为１∶２０，提取功
率２４２Ｗ，每次提取时间为１００ｓ，提取３次，改变乙
醇的体积分数，总黄酮提取率结果见图１。
图１ 乙醇体积分数对提取率的影响
Ｆｉｇ．１ Ｅｆｅｃｔｓｏｆｅｔｈａｎｏｌｖｏｌｕｍｅｒａｔｉｏｏｎｆｌａｖｏｎｏｉｄｙｉｅｌｄ
由图１可以看出，随着乙醇体积分数的增大，黄
酮的提取率呈上升趋势。从经济角度考虑，选用
７０％的乙醇为最佳体积分数。
２１２ 提取功率的选择
选用体积分数７０％乙醇，其余条件同２１１，改
变功率，总黄酮提取率结果见图２。
由图２可见，黄酮类物质的提取率随微波功率
的增大而不断上升，当微波功率为２６９Ｗ时，其提
取率明显高于其他功率的提取率。功率过小或过
大时导致黄酮的溶出不充分，因此选择微波功率为
２６９Ｗ为宜。
２１３ 提取时间的选择
确定提取功率２６９Ｗ，其余条件同２１１，考察
不同提取时间对总黄酮提取率的影响，结果见图３。
２５ 生 物 加 工 过 程 第７卷
图２ 微波功率对提取率的影响
Ｆｉｇ．２ Ｅｆｅｃｔｓｏｆｍｉｃｒｏｗａｖｅｐｏｗｅｒｏｎｆｌａｖｏｎｏｉｄｙｉｅｌｄ
图３ 提取时间对提取率的影响
Ｆｉｇ．３ Ｅｆｅｃｔｓｏｆｅｘｔｒａｃｔｔｉｍｅｏｎｆｌａｖｏｎｏｉｄｙｉｅｌｄ
由图３可见，随着时间的增加，黄酮提取率先增
加，而后有所降低，当提取时间为１２０ｓ时的提取率
最高。分析原因可能是微波的强热效应长时间后
对黄酮有分解作用，且溶剂蒸发导致黄酮溶出减
少［８］。因此选择１２０ｓ为最佳微波提取时间。
２１４ 料液比的选择
在选定的乙醇体积分数、提取功率和提取时间
下，提取次数为３次。研究不同料液比对黄酮提取
率的影响，结果见图４。
图４ 料液比对提取率的影响
Ｆｉｇ．４ Ｅｆｅｃｔｓｏｆｍａｓｓｒａｔｉｏｏｎｆｌａｖｏｎｏｉｄｙｉｅｌｄ
由图４可见，随着料液比的降低，提取率先呈上
升趋势，后有所下降，１∶１５时提取率最高。在一定
范围内溶剂用量增加有助于黄酮的浸出。溶剂用
量少，提取不完全，但溶剂用量太大，会使热负荷增
大，提取完全所需要的时间增加，使所提取溶液中
黄酮浓度降低。
２１５ 提取次数的选择
在选定的乙醇体积分数、提取功率、提取时间
和料液比下，考察提取次数对总黄酮提取率的影响。
图５ 提取次数对提取率的影响
Ｆｉｇ．５ Ｅｆｅｃｔｓｏｆｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｔｉｍｅｓｏｎｆｌａｖｏｎｏｉｄｙｉｅｌｄ
由图５可见，随着提取次数的增加，黄酮得率不
断降低，前３次提取可提出大部分黄酮。综合考虑
提取率和能源消耗的因素，选择提取次数为３次较
合适。
２２ 油菜花粉总黄酮提取的正交试验
经单因素分析，微波辅助提取油菜花粉总黄酮
的最佳工艺条件是：体积分数７０％乙醇溶液，２６９Ｗ
提取功率，１２０ｓ提取时间，１∶１５的料液比，提取３
次。根据单因素试验，进一步作正交试验，因子及
水平设计见表１，结果见表２和表３。由正交结果极
差可知，各种因素对总黄酮提取率的影响次序从大
到小依次为料液比（Ｄ）、时间（Ｃ）、乙醇体积分数
（Ａ）、功率（Ｂ），总黄酮的最佳方案是 Ａ３Ｂ１Ｃ３Ｄ３，即
提取溶剂为体积分数８０％的乙醇，功率为２４２Ｗ，
提取时间为１４０ｓ，料液比为１∶２０，提取３次。按正
交试验所得最佳方案，平行提取３次，黄酮提取率为
（２６４±００５）％。
表１ 正交试验因素及水平设计
Ｔａｂｌｅ１ Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｆａｃｔｏｒｓａｎｄｌｅｖｅｌｄｅｓｉｇｎ
水平 Ａ
φ（乙醇）／％
Ｂ
功率／Ｗ
Ｃ
时间／ｓ
Ｄ
料液比
１ ６０ ２４２ １００ １∶１０
２ ７０ ２６９ １２０ １∶１５
３ ８０ ２９６ １４０ １∶２０
３５ 第６期 焦士蓉等：油菜花粉总黄酮的微波辅助提取及其抗氧化活性研究
表２ 正交试验
Ｔａｂｌｅ２ Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ
试验号 Ａ Ｂ Ｃ Ｄ ｐ／％
１ １ １ １ １ １２４５
２ １ ２ ２ ２ １０１７
３ １ ３ ３ ３ １６３９
４ ２ １ ２ ３ １６６４
５ ２ ２ ３ １ １２８７
６ ２ ３ １ ２ １６５７
７ ３ １ １ ２ ２０７４
８ ３ ２ ３ ３ ２４２８
９ ３ ３ ２ １ ０９８９
表３ 正交试验结果分析
Ｔａｂｌｅ３ Ａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ
方差源 Ａ Ｂ Ｃ Ｄ
Ｋ１ １３００ １６６１ １２９７ １１７４
Ｋ２ １５３６ １５７７ １２２３ １５８３
Ｋ３ １８３０ １４２７ １７８５ １９１０
Ｒ ０５３０ ０２３４ ０５６２ ０７３６
２３ 对自由基清除活性的测定
２３１ 对羟自由基清除活性的测定
将油菜花粉总黄酮取物对羟自由基的清除活
性进行测定并进行线性回归，得回归方程 ｙ＝
２７９３５ｌｎｘ＋１１０４９，Ｒ２＝０９６８７。自由基半清除质
量浓度为０１１５ｍｇ／ｍＬ。
２３２ 对ＤＰＰＨ自由基清除活性的测定
将油菜花粉总黄酮取物对ＤＰＰＨ自由基的清除
活性进行测定并进行线性回归，得回归方程 ｙ＝
１０６６７ｘ＋１５３４４，Ｒ２＝０９６８４。ＤＰＰＨ自由基半清
除质量浓度为０３２５ｍｇ／ｍＬ。
２４ 对小鼠肝组织脂质过氧化的抑制作用
研究油菜蜂花粉提取物对小鼠肝匀浆脂质过
氧化的抑制作用并将油菜花粉总黄酮对小鼠肝脂
质过氧化抑制作用进行线性回归，得回归方程 ｙ＝
１１９６８ｌｎｘ＋８２７５，Ｒ２＝０８４１１。脂质过氧化半抑
制质量浓度为００６５ｍｇ／ｍＬ。
３ 结 论
通过单因素及正交试验，确定了油菜花粉总黄
酮的最佳工艺条件：体积分数８０％的乙醇，料液比
为１∶２０，提取时间为１４０ｓ，提取功率为２４２Ｗ，提取
３次。按正交所得最佳方案，提取率为（２６４±
００５）％。５０％的自由基清除及抑制脂质过氧化作
用所需油菜花粉总黄酮质量浓度分别为 ０１１５、
０３２５和００６５ｍｇ／ｍＬ。试验结果表明，油菜花粉
总黄酮对小鼠肝组织匀浆脂质过氧化的抑制作用
最强。
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