全 文 ：
摇 摇 摇 摇 摇 生 态 学 报
摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 (SHENGTAI XUEBAO)
摇 摇 第 33 卷 第 4 期摇 摇 2013 年 2 月摇 (半月刊)
目摇 摇 次
前沿理论与学科综述
森林水源涵养功能的多尺度内涵、过程及计量方法 王晓学,沈会涛,李叙勇,等 (1019)………………………
植物叶片水稳定同位素研究进展 罗摇 伦,余武生,万诗敏,等 (1031)……………………………………………
城市景观格局演变的生态环境效应研究进展 陈利顶,孙然好,刘海莲 (1042)…………………………………
城市生物多样性分布格局研究进展 毛齐正,马克明,邬建国,等 (1051)…………………………………………
基于福祉视角的生态补偿研究 李惠梅,张安录 (1065)……………………………………………………………
个体与基础生态
土著菌根真菌和混生植物对羊草生长和磷营养的影响 雷摇 垚,郝志鹏,陈保冬 (1071)………………………
干旱条件下 AM真菌对植物生长和土壤水稳定性团聚体的影响 叶佳舒,李摇 涛,胡亚军,等 (1080)…………
转 mapk双链 RNA干扰表达载体黄瓜对根际土壤细菌多样性的影响 陈国华,弭宝彬,李摇 莹,等 (1091)…
北京远郊区臭氧污染及其对敏感植物叶片的伤害 万五星,夏亚军,张红星,等 (1098)…………………………
茅苍术叶片可培养内生细菌多样性及其促生潜力 周佳宇,贾摇 永,王宏伟,等 (1106)…………………………
低温对蝶蛹金小蜂卵成熟及其数量动态的影响 夏诗洋,孟玲,李保平 (1118)…………………………………
六星黑点豹蠹蛾求偶行为与性信息素产生和释放的时辰节律 刘金龙,荆小院,杨美红,等 (1126)……………
氟化物对家蚕血液羧酸酯酶及全酯酶活性的影响 米摇 智,阮成龙,李姣蓉,等 (1134)…………………………
不同温度对脊尾白虾胚胎发育与幼体变态存活的影响 梁俊平,李摇 健,李吉涛,等 (1142)……………………
种群、群落和生态系统
生态系统服务多样性与景观多功能性———从科学理念到综合评估 吕一河,马志敏,傅伯杰,等 (1153)………
不同端元模型下湿地植被覆盖度的提取方法———以北京市野鸭湖湿地自然保护区为例
崔天翔,宫兆宁,赵文吉,等 (1160)
………………………
……………………………………………………………………………
基于光谱特征变量的湿地典型植物生态类型识别方法———以北京野鸭湖湿地为例
林摇 川,宫兆宁,赵文吉,等 (1172)
……………………………
……………………………………………………………………………
浮游植物群落对海南小水电建设的响应 林彰文,林摇 生,顾继光,等 (1186)……………………………………
菹草种群内外水质日变化 王锦旗,郑有飞,王国祥 (1195)………………………………………………………
南方红壤区 3 种典型森林恢复方式对植物群落多样性的影响 王摇 芸,欧阳志云,郑摇 华,等 (1204)…………
人工油松林恢复过程中土壤理化性质及有机碳含量的变化特征 胡会峰,刘国华 (1212)………………………
不同区域森林火灾对生态因子的响应及其概率模型 李晓炜,赵摇 刚,于秀波,等 (1219)………………………
景观、区域和全球生态
快速城市化地区景观生态安全时空演化过程分析———以东莞市为例 杨青生,乔纪纲,艾摇 彬 (1230)………
海岸带生态系统健康评价中能质和生物多样性的差异———以江苏海岸带为例
唐得昊,邹欣庆,刘兴健 (1240)
…………………………………
…………………………………………………………………………………
干湿交替频率对不同土壤 CO2 和 N2O释放的影响 欧阳扬,李叙勇 (1251)……………………………………
西部地区低碳竞争力评价 金小琴,杜受祜 (1260)…………………………………………………………………
基于 HEC鄄HMS模型的八一水库流域洪水重现期研究 郑摇 鹏,林摇 韵,潘文斌,等 (1268)……………………
基于修正的 Gash模型模拟小兴安岭原始红松林降雨截留过程 柴汝杉,蔡体久,满秀玲,等 (1276)…………
长白山北坡不同林型内红松年表特征及其与气候因子的关系 陈摇 列,高露双,张摇 赟,等 (1285)……………
资源与产业生态
河西走廊绿洲灌区循环模式“农田鄄食用菌冶生产系统氮素流动特征 李瑞琴,于安芬,赵有彪,等 (1292)……
施肥对旱地花生主要土壤肥力指标及产量的影响 王才斌,郑亚萍,梁晓艳,等 (1300)…………………………
耕作措施对土壤水热特性和微生物生物量碳的影响 庞摇 绪,何文清,严昌荣,等 (1308)………………………
基于改进 SPA法的耕地占补平衡生态安全评价 施开放,刁承泰,孙秀锋,等 (1317)…………………………
学术争鸣
基于生态鄄产业共生关系的林业生态安全测度方法构想 张智光 (1326)…………………………………………
中国生态学学会 2013 年学术年会征稿须知 (玉)…………………………………………………………………
期刊基本参数:CN 11鄄2031 / Q*1981*m*16*318*zh*P* ￥ 90郾 00*1510*34*
室室室室室室室室室室室室室室
2013鄄02
封面图说: 石羊河———石羊河流域属大陆性温带干旱气候,气候特点是:日照充足、温差大、降水少、蒸发强、空气干燥。 石羊河
源出祁连山东段,河系以雨水补给为主,兼有冰雪融水成分。 上游的祁连山区降水丰富,有雪山冰川和残留林木,是
河流的水源补给地。 中游流经河西走廊平地,形成武威和永昌等绿洲,下游是民勤,石羊河最后消失在腾格里沙漠
中。 随着石羊河流域人水矛盾的不断加剧,水资源开发利用严重过度,荒漠化日趋严重,民勤县的生态环境已经相
当恶化,继续下去将有可能变成第二个“罗布泊冶。
彩图及图说提供: 陈建伟教授摇 北京林业大学摇 E鄄mail: cites. chenjw@ 163. com
第 33 卷第 4 期
2013 年 2 月
生 态 学 报
ACTA ECOLOGICA SINICA
Vol. 33,No. 4
Feb. ,2013
http: / / www. ecologica. cn
基金项目:国家自然科学基金项目(31070443,30970523); 江苏高校优势学科建设工程资助项目; 江苏省工程中心创新能力提升项目; 江苏省
教育厅产业化推进项目(JHB2012鄄16); 南京市科委工程中心创新能力提升项目(201105058)
收稿日期:2012鄄08鄄03; 摇 摇 修订日期:2012鄄10鄄26
*通讯作者 Corresponding author. E鄄mail: daichuanchao@ njnu. edu. cn
DOI: 10. 5846 / stxb201208031103
周佳宇,贾永,王宏伟,戴传超.茅苍术叶片可培养内生细菌多样性及其促生潜力.生态学报,2013,33(4):1106鄄1117.
Zhou J Y, Jia Y, Wang H W, Dai C C. Diversity and plant growth鄄promoting potential of culturable endophytic bacteria isolated from the leaves of
Atractylodes lancea. Acta Ecologica Sinica,2013,33(4):1106鄄1117.
茅苍术叶片可培养内生细菌多样性及其促生潜力
周佳宇,贾摇 永,王宏伟,戴传超*
(南京师范大学生命科学学院,江苏省微生物与功能基因组学重点实验室,江苏省微生物资源产业化工程技术研究中心, 南京摇 210023)
摘要:对江苏省道地药材茅苍术叶片可培养内生细菌的多样性及其固氮、解磷、解钾、产生长素的能力进行研究。 依据菌落形态
的不同,共分离得到 52 株内生细菌。 能正常传代培养的 45 株内生细菌经 ARDRA 分析后归入 14 个聚类簇,簇内菌株的 BOX鄄
PCR指纹图谱相似度不高,在属水平上显示出茅苍术内生细菌丰富的多样性。 各聚类簇代表菌株 16S rDNA 的序列分析表明
分离得到的内生细菌与泛菌属、微杆菌属、短杆菌属、农杆菌属、假单胞菌属、芽孢杆菌属细菌亲缘关系相近,优势内生细菌与假
单胞菌属细菌亲缘关系相近。 45 株能正常传代培养的内生细菌中,有 10 株能够在无氮培养基上正常生长,具固氮潜力。 使用
nifH基因通用引物对其基因组进行扩增后,除 ALEB 33 外,其它 9 株内生细菌均可获得与 nifH 基因片段大小相近的条带。 分
别使用 NBRIP 培养基和蒙金娜有机磷培养基筛选后获得 19 株和 15 株能够溶解磷酸钙和卵磷脂的内生细菌,其中 ALEB 43 溶
解无机磷的能力最强,达(251. 43依6. 55) mg / L;ALEB 4A溶解有机磷的能力最强,达(23. 63依1. 46) mg / L。 部分内生细菌溶解
无机磷的能力与其产酸能力呈正相关,而菌株溶解有机磷的能力却无此相关性。 通过硅酸盐培养基的筛选,获得具有解钾潜力
的菌株 24 株。 43 株内生细菌能够将色氨酸转化为生长素,其中 ALEB 44 产生长素的能力最强,达(268. 44依10. 12) 滋g / mL。 本
研究首次揭示了江苏省道地药材茅苍术体内丰富的内生细菌资源及其促生长潜力,对进一步阐述茅苍术与内生菌之间的相互
关系具有重要意义。
关键词:茅苍术;内生细菌;多样性;促生潜力
Diversity and plant growth鄄promoting potential of culturable endophytic bacteria
isolated from the leaves of Atractylodes lancea
ZHOU Jiayu, JIA Yong, WANG Hongwei, DAI Chuanchao*
Jiangsu Engineering and Technology Research Center for Industrialization of Microbial Resources, Jiangsu Key Laboratory for Microbes and Functional
Genomics, College of Life Science, Nanjing Normal University, Nanjing 210023, China
Abstract: Atractylodes lancea is a medicinal plant grown in Jiangsu Province, China. The diversity of the endophytic
bacteria culturable from the leaves of A. lancea and their plant growth鄄promoting potential, including nitrogen fixation,
phosphorus solubilization, potassium solubilization and indole acetic acid (IAA) production were investigated. According to
morphological characteristics of bacterial colonies, 52 endophytic bacterial strains were obtained and 45 could be
subcultured normally in vitro and subjected to amplified ribosomal DNA restriction analysis ( ARDRA). Based on the
ARDRA fingerprints, the 45 subculturable endophytic bacterial strains could be classified into 14 clusters. The 16S rDNA
fragments of representative strains from different clusters were sequenced and deduced by a BLAST search to identify similar
strains. The results showed that the isolated endophytic bacteria most likely belong to Pantoea sp. , Microbacterium sp. ,
Curtobacterium sp. , Agrobacterium sp. , Pseudomonas sp. , or Bacillus sp. Among them, the Pseudomonas sp. was the
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most dominant genera. BOX鄄PCR was then used to study the diversity of the endophytic bacteria in the main ARDRA
clusters. The BOX鄄PCR fingerprints showed that the endophytic bacteria in the same cluster were not similar, indicating a
broad genetic diversity within the same genera. Ten of the 45 subculturable endophytic bacteria could grow normally on
Burk忆s medium, which indicates their potential to fix nitrogen. We also amplified the nifH genes in these strains and all
strains generated a band of the expected size except for ALEB 33. Among all subculturable endophytic bacteria, 19 and 15
strains could dissolve insoluble calcium phosphate and lecithin, respectively, and then release dissociative phosphorus into
the medium. ALEB 43 could dissolve the largest amount of phosphorous from calcium phosphate, reaching (251. 43依6. 55)
mg / L. Furthermore, ALEB 4A could dissolve the largest amount of phosphorous from lecithin, reaching (23. 63依1. 46)
mg / L. After comparing the amount of phosphorous dissolved from calcium phosphate by the endophytic bacteria and the pH
of the bacterial inoculum, we deduced that some phosphate鄄solubilizing bacteria dissolve insoluble calcium phosphate by
secreting certain types of acids. However, the pH of the fermentation solution of endophytic bacteria capable of dissolving
lecithin was not related to the release of dissociative phosphorus. There were 24 strains that could grow on silicate medium,
indicating these strains had the potential to dissolve insoluble potassium feldspar and release dissociative potassium, which
was available to plants. Forty three endophytic bacterial strains could produce and release IAA into the medium. The
amount of IAA released by ALEB 44 was the highest, reaching (268. 44依10. 12) 滋g / mL. These endophytic bacteria could
promote the growth of host plants by increasing the amounts of available nutrients or phytohormones. This paper is the first
to reveal the diversity of endophytic bacteria in A. lancea and their plant growth鄄promoting potential. Continued research
will be needed to clarify the interactions between A. lancea and its endophytes.
Key Words: Atractylodes lancea; endophytic bacteria; diversity; plant growth鄄promoting potential
茅苍术(Atractylodes lancea (Thunb. ) DC. )为菊科苍术属多年生草本植物,其干燥根茎为著名药材苍术。
江苏省茅山地区为茅苍术道地产区,由于近年来掠夺性的采挖,加之生境破坏严重,茅苍术资源面临濒危和枯
竭[1]。 目前,茅苍术药材基本来自人工栽培,因此,研究影响茅苍术活性成分积累和配比的因素对高质量茅
苍术药材的栽培和生产至关重要[2]。 一些植物内生菌与宿主植物长期共存、协同进化。 茅苍术体内高挥发
油含量的特殊环境使其蕴含有独特的内生菌资源,而内生菌也能够影响茅苍术的生长发育及其药用活性成分
的组成和积累[3]。 一些内生真菌能够促进茅苍术组培苗的生长,增强其对环境的适应性,提高其成活率[4]。
由于茅苍术叶片是挥发油合成的主要部位,且其中的内生细菌尚无相关研究,本文探究了茅苍术叶片中
可培养内生细菌的多样性及其固氮、解磷、解钾和产生长素的能力。 通过本研究筛选得到一些具有植物促生
潜力的茅苍术内生细菌资源,初步揭示了内生细菌与茅苍术之间的相互关系,为进一步将内生细菌回接茅苍
术植株,增加茅苍术药材的产量和药理活性物质的积累提供了重要依据。
1摇 材料与方法
1. 1摇 植物来源与内生细菌的分离
多年生茅苍术植株 100 株来源于茅苍术道地产区江苏省茅山地区九龙药材公司茅苍术药材种植园,移栽
至南京师范大学植物园生长超过 2a,长势良好、无病虫害。 2011 年秋季,随机挑选 20 株花果期健康的茅苍术
植株并摘取其完整的中上部叶片,共 20 片。
茅苍术叶片经自来水和双蒸水分别清洗后,用 70%乙醇消毒 1 min,0. 1%升汞消毒 10 min,无菌水冲洗
多次[4],研磨后分别涂布于牛肉膏蛋白胨培养基和 Luria Bertani(LB)培养基上,同时也分别涂布最后一次洗
涤液,作为叶片表面灭菌彻底的对照。 涂布好的培养基于 30 益培养,待有菌落形成时,依据菌落形态的差异,
分别挑取不同的内生细菌单菌落,纯化后于 LB斜面上 4益保藏。 主要依据的形态特征有:菌落大小、菌落形
状、菌落边缘是否齐整、菌落颜色、菌落透明度、菌落光泽度以及菌落表面是否光滑、是否存在特殊结构。
7011摇 4 期 摇 摇 摇 周佳宇摇 等:茅苍术叶片可培养内生细菌多样性及其促生潜力 摇
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1. 2摇 茅苍术内生细菌的多样性分析
使用通用引物 27F 和 1492R[5],采用菌液 PCR 对分离得到的茅苍术内生细菌进行 16S rDNA 片段的扩
增。 扩增后获得大小在 1500 bp左右的片段,经 1%琼脂糖凝胶电泳检验合格后进行核糖体 DNA扩增片段限
制性内切酶分析(ARDRA)。
将一部分 16S rDNA片段扩增产物使用限制性内切酶 Hae 芋和 Alu玉在 37 益下分别消化 4 h,用 3%琼脂
糖凝胶 120 V 电泳后紫外成像并拍照。 使用 Gelcompar域软件[6]对获得的限制性片段多态性图谱进行
UPGMA聚类分析[7]。
在各 ARDRA聚类簇中挑选代表菌株,对其 16S rDNA 片段进行测序。 序列测定委托北京六合华大基因
科技股份有限公司进行,测序引物与扩增相同,PCR产物直接测通。 测序结果在 Genbank中进行 BLAST同源
性比对,推测其分类地位。
对主要 ARDRA聚类簇中的内生细菌进行 BOX鄄PCR 分析。 BOX鄄PCR 产物经上述凝胶电泳、成像、拍照
和聚类分析后,得到主要 ARDRA聚类簇中内生细菌的聚类分析图,研究聚类簇水平上内生细菌的多样性[8]。
BOX鄄PCR采用通用引物 BOX A1R[9],50 滋L反应体系,扩增条件:94 益预变性 5 min;94 益变性 1 min,45 益
退火 1 min,72 益延伸 1. 5 min,35 个循环;72 益延伸 6 min。
1. 3摇 茅苍术内生细菌促生潜力的分析
1. 3. 1摇 内生细菌固氮能力的测定
能够在 Burk忆s无氮培养基上正常生长的内生细菌菌株具有固氮潜力[10]。 提取具固氮潜力的内生细菌的
总 DNA,使用引物 nifH鄄F 和 nifH鄄R[11]扩增其 nifH 基因,能够获得大小在 450 bp 左右条带的内生细菌含有
nifH基因[12]。 并对其 16S rDNA片段进行扩增、测序,在 Genbank 中进行 BLAST 同源性比对后,获得相似菌
株的序列,Clustal X多重比对后,使用 Mega 5. 0 软件,采用 Neighbor鄄Joining法构建系统发生树,对各固氮菌株
的系统发生地位进行分析,Bootstrap 1000 次检验各分支的置信值。
1. 3. 2摇 内生细菌解磷能力的测定
将内生细菌分别接种于 National Botanical Research Institute Phosphate(NBRIP)培养基[13]和蒙金娜有机磷
培养基[14]上后,通过观察是否有溶磷圈的形成来确定其是否具有溶解无机磷或有机磷的能力。 进一步通过
钼锑抗比色法定量测定细菌溶解无机磷或有机磷的能力[15],同时测定菌液的 pH值。
钼锑抗比色法的具体步骤如下:将 OD600 调节一致的茅苍术内生细菌悬液 1 mL 接种于 35 mL NBRIP 液
体培养基或蒙金娜有机磷液体培养基中。 30益,220 r / min培养 7 d后 8000 r / min离心 10 min,取 1 mL上清液
于 50 mL容量瓶中,加入钼锑抗混合显色剂 5 mL后加水定容至刻度,静置 30 min后,于 660 nm测定吸光值。
吸光值带入磷酸二氢钾标准曲线 y = 0. 007x+0. 026,R2 = 0. 997 即可计算得到发酵液中可溶性磷元素的含
量[15]。 每个样品 3 次重复。
1. 3. 3摇 内生细菌解钾能力的测定
内生细菌的解钾能力使用添加钾长石粉作为唯一钾源的硅酸盐培养基进行检测。 将内生细菌分别接种
于硅酸盐培养基上,于 30 益培养 10 d后观察,能够生长的菌株具有解钾潜力[16]。 每个样品 3 次重复。
1. 3. 4摇 内生细菌产生长素能力的测定
将 OD600 调节一致的茅苍术内生细菌悬液 1 mL接种于含 5 mmol / L L鄄色氨酸的 25 mL LB培养基中。 220
r / min,30 益,避光培养 48 h后,8000 r / min离心 10 min,取 1 mL上清液与 2 mL Salkowski试剂混匀后于黑暗
处室温温育 30 min,使用分光光度计于 530 nm处检测其吸光值,带入吲哚乙酸标准曲线计算出菌株 48 h 的
生长素产生量[17]。 每个样品 3 次重复。 生长素标准曲线使用已知的吲哚乙酸浓度分别在 0—60 滋g / mL 和
60—300 滋g / mL的标准溶液显色后在 530 nm 处的吸光值分别进行拟合[18]。 生长素标准曲线分别为 y =
0郾 002x-0. 001,R2 =0. 997(0—60 滋g / mL)和 y=0. 003x-0. 079,R2 =0. 999(60—300 滋g / mL)。
1. 4摇 数据及图谱分析
使用 Excel软件计算各菌株测定指标不同重复的平均值和标准差,并绘制图形。 ARDRA和 BOX鄄PCR指
8011 摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 33 卷摇
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纹图谱分析使用 Gelcompar域软件。 系统发育树的构建使用 Mega 5. 0 软件。
2摇 结果与分析
2. 1摇 茅苍术内生细菌的分离
依据单菌落形态的差异,从茅苍术叶片中分离得到 52 株可培养内生细菌,其中 7 株在传代培养过程中停
止生长,不纳入实验范围。 对可正常传代培养的 45 株内生细菌分别编号为 ALEB 1B、ALEB 2A、ALEB 2B、
ALEB 3A、ALEB 3B、ALEB 4A、ALEB 5A、ALEB 5B、ALEB 6B、ALEB 7A、ALEB 7B、ALEB 8、ALEB 10、ALEB
11、ALEB 13—ALEB 15、ALEB 19—ALEB 22、ALEB 24—ALEB 47。
2. 2摇 茅苍术内生细菌的多样性分析
2. 2. 1摇 内生细菌的 ARDRA分析
45 株茅苍术内生细菌的限制性片段多态性图谱经 UPGMA 聚类分析后,以 60%的相似度为标准划分为
14 个聚类簇(图 1)。 各聚类簇中代表菌株的 16S rDNA全序列测定结果经 Genbank 同源性比对后,确定其可
能的分类学地位(表 1)。
表 1摇 茅苍术叶片可培养内生细菌 ARDRA聚类簇
Table 1摇 ARDRA clusters of the culturable endophytic bacteria from the leaves of Atractylodes lancea
聚类簇
Clusters
菌株
Strains
科
Family
相似菌株
The Similar Strains
序列相似性
Sequence Identity / %
1 ALEB 4A, ALEB 26*, ALEB32 Enterobacteriaceae Pantoea dispersa 99
2 ALEB 38, ALEB 42*, ALEB 46 Microbacteriaceae Microbacterium oleivorans 95
3 ALEB 44, ALEB 45, ALEB 47* Microbacteriaceae Curtobacterium luteum 99
4 ALEB 14*, ALEB 15 Enterobacteriaceae Pantoea agglomerans 100
5 ALEB 5A*, ALEB 5B, ALEB 13, ALEB 22 Rhizobiaceae Agrobacterium tumefaciens 100
6
ALEB 2A, ALEB 2B, ALEB 3A, ALEB 6B,
ALEB 7A, ALEB 7B, ALEB 8, ALEB 11,
ALEB 19, ALEB 20*, ALEB 21
Pseudomonadaceae Pseudomonas fluorescens 100
7 ALEB 10*, ALEB 24 Bacillaceae Bacillus magaterium 99
8 ALEB 35* Bacillaceae Bacillus magaterium 98
9 ALEB 3B, ALEB 33, ALEB 34, ALEB 39
*,
ALEB 40, ALEB43
Pseudomonadaceae Pseudomonas fulva 99
10 ALEB 41* Pseudomonadaceae Pseudomonas fulva 99
11 ALEB 25, ALEB 28, ALEB 29, ALEB 30* Pseudomonadaceae Pseudomonas plecoglossicida 99
12 ALEB 27, ALEB 31*, ALEB 37 Pseudomonadaceae Pseudomonas viridiflava 98
13 ALEB 1B* Microbacteriaceae Microbacterium oleivorans 100
14 ALEB 36* Microbacteriaceae Microbacterium arborescens 100
摇 摇 *测序的代表菌株
2. 2. 2摇 主要 ARDRA聚类簇内的 BOX鄄PCR分析
在 ARDRA聚类簇水平上使用 BOX鄄PCR 获得的指纹图谱对茅苍术内生细菌主要聚类簇 6 和 9 进行细
分,并进行 UPGMA聚类分析(图 2)。 聚类簇 6 中的 11 株内生细菌中亲缘关系最近的菌株 ALEB 6B和 ALEB
11 及 ALEB 7A和 ALEB 7B的相似度为 95% ;聚类簇 9 中亲缘关系最近的菌株 ALEB 40 和 ALEB 43 的相似
度为 92% 。 说明相同茅苍术内生细菌 ARDRA聚类簇中的菌株具有丰富的多样性,应属于同一属的不同种或
同一种的不同菌株。 BOX鄄PCR指纹图谱的分析结果也表明茅苍术体内蕴藏着丰富的内生细菌资源。
2. 3摇 茅苍术内生细菌促生潜力的筛选
45 株茅苍术内生细菌中有 10 株能够在 Burk忆s无氮培养基上正常生长,表明其具有固氮潜力。 分别有 19
株和 15 株内生细菌具有溶解无机磷和有机磷的能力。 有 24 株茅苍术内生细菌能够在硅酸盐培养基上正常
生长,具有解钾潜力。 其中 ALEB 5A、ALEB 13 和 ALEB 35 同时具有固氮、溶解有机磷和解钾的能力,ALEB
14 和 ALEB 47 同时具有固氮、溶解无机磷和解钾的能力,ALEB 11、ALEB 27、ALEB 29 和 ALEB 37 同时具有
9011摇 4 期 摇 摇 摇 周佳宇摇 等:茅苍术叶片可培养内生细菌多样性及其促生潜力 摇
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Alu Ⅰ
图 1摇 茅苍术内生细菌限制性内切酶酶切指纹图谱聚类分析
Fig. 1摇 Fingerprints and dendrogram of 45 endophytic bacteria based on ARDRA
溶解无机磷和有机磷的能力,但并没有发现同时具有固氮、溶解无机磷和有机磷、解钾和产生长素能力的内生
细菌菌株。
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摇 图 2摇 聚类簇 6 和聚类簇 9 中内生细菌 BOX鄄PCR指纹图谱聚类
分析
Fig. 2摇 Fingerprints and dendrogram of endophytic bacteria from
ARDRA cluster 6 and 9 based on BOX鄄PCR
45 株茅苍术内生细菌中有 43 株具有生长素产生
能力,其中 ALEB 44 产生长素的能力最强,在 30 益,
220 r / min培养 48 h 后的生长素产生量达到(268. 44依
10郾 12) 滋g / mL。 有 25 株内生细菌的生长素产生量高
于 100 滋g / mL。
2. 4摇 茅苍术内生固氮细菌 nifH 基因的扩增与 16S r
DNA的序列测定
2. 4. 1摇 茅苍术内生固氮细菌 nifH基因的扩增
对茅苍术内生固氮细菌的 nifH 基因片段进行扩增
后,ALEB 5A、ALEB 5B、ALEB 13、ALEB 14、ALEB 26、
ALEB 35、ALEB 39、ALEB41 和 ALEB 47 能够获得大小
在 450 bp左右的目的条带,表明这 9 株内生细菌中含
有 nifH基因[11]。 而 ALEB 33 在 450 bp处并没有条带,
其可能通过其它途径获得生长所需的氮元素。 结合
ARDRA聚类分析的结果,有近 1 / 2 的聚类簇中包含有
具固氮潜力的茅苍术内生细菌,其中 ALEB 26 属于聚
类簇 1,ALEB 47 属于聚类簇 3,ALEB 14 属于聚类簇 4,
ALEB 5A、ALEB 5B和 ALEB 13 属于聚类簇 5,ALEB 35
属于聚类簇 8,ALEB 33 和 ALEB 39 属于聚类簇 9,ALEB 41 属于聚类簇 10。
表 2摇 茅苍术内生细菌促生潜力的筛选
Table 2摇 Plant growth鄄promoting potential of endophytic bacteria
编号
Number
固氮能力
Nitrogen fixation
ability
解磷能力
Phosphorus solubilization ability
无机磷
Inorganic
phosphate
有机磷
Organic phosphorus
解钾能力
Potassium
solubilization ability
生长素产生量
Production of IAA
/ (滋g / mL)
ALEB 1B - - - + 112. 89依9. 34
ALEB 2A - + - + 139. 67依4. 91
ALEB 2B - + - + 122. 78依2. 67
ALEB 3A - + - - 105. 33依2. 03
ALEB 3B - - + - 69. 22依4. 83
ALEB 4A - - + - 13. 83依1. 76
ALEB 5A + - + + 144. 78依1. 07
ALEB 5B + - - + 114. 44依4. 25
ALEB 6B - + - - 91. 00依4. 58
ALEB 7A - + - + 104. 89依8. 11
ALEB 7B - + - + 111. 00依2. 52
ALEB 8 - - - - 41. 17依3. 75
ALEB 10 - - + + 108. 78依7. 52
ALEB 11 - + + - 91. 44依3. 10
ALEB 13 + - + + 130. 00依1. 20
ALEB 14 + + - + 110. 00依8. 29
ALEB 15 - - + + 29. 00依17. 39
ALEB 19 - + - - 95. 89依1. 95
ALEB 20 - + - + 102. 78依4. 74
1111摇 4 期 摇 摇 摇 周佳宇摇 等:茅苍术叶片可培养内生细菌多样性及其促生潜力 摇
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摇 摇 续表
编号
Number
固氮能力
Nitrogen fixation
ability
解磷能力
Phosphorus solubilization ability
无机磷
Inorganic
phosphate
有机磷
Organic phosphorus
解钾能力
Potassium
solubilization ability
生长素产生量
Production of IAA
/ (滋g / mL)
ALEB 21 - + - - 181. 00依14. 77
ALEB 22 - - + + 172. 22依2. 22
ALEB 24 - - + - 46. 5依13. 48
ALEB 25 - - - - 46. 50依13. 48
ALEB 26 + - - + 105. 78依2. 87
ALEB 27 - + + + 63. 67依7. 13
ALEB 28 - - - + 134. 44依6. 17
ALEB 29 - + + - 195. 67依2. 40
ALEB 30 - - - + 169. 89依9. 85
ALEB 31 - + - - 120. 11依11. 55
ALEB 32 - - - - 21. 50依9. 18
ALEB 33 + - - - 185. 33依9. 33
ALEB 34 - + - + 38. 83依3. 82
ALEB 35 + - + + 120. 56依2. 50
ALEB 36 - + - + 91. 33依6. 24
ALEB 37 - + + - 72. 89依0. 38
ALEB 38 - - - -
ALEB 39 + - + - 69. 00依4. 16
ALEB 40 - - - - 165. 22依10. 20
ALEB 41 + - - + 60. 78依4. 23
ALEB 42 - - - + 257. 00依17. 62
ALEB 43 - + - - 123. 67依5. 21
ALEB 44 - - + + 268. 44依10. 12
ALEB 45 - - - - 17. 83依5. 97
ALEB 46 - - - -
ALEB 47 + + - + 22. 00依2. 78
总计 Total 10 19 15 24 43
2. 4. 2摇 茅苍术内生固氮细菌 16S rDNA序列的测定及系统发育树的构建
以 10 株具固氮潜力的茅苍术内生细菌 16S rDNA 基因为基础构建的系统发育树(图 4)表明 ALEB 5A、
ALEB 5B和 ALEB 13 与土壤杆菌属的典型菌株聚在相同位置,ALEB 14 和 ALEB 26 与泛菌属的典型菌株聚
在相同位置,ALEB 33、ALEB 39 和 ALEB 41 与假单胞菌属的典型菌株聚在相同位置,ALEB 35 与芽孢杆菌属
的典型菌株聚在相同位置,ALEB 47 与短小杆菌属的典型菌株聚在相同位置。
2. 5摇 茅苍术内生细菌溶解无机磷的定量检测及细菌发酵液 pH值的测定
结合菌液中可溶性磷元素的含量和 pH 值进行分析(图 5)。 ALEB 43 发酵液中可溶性磷元素的含量最
高,达(251. 43依4. 16) mg / L,并且其 pH值(pH=4. 16)与不接菌的培养基(pH = 6. 90)相比明显下降。 ALEB
3A、ALEB 7A、ALEB 7B、ALEB 21、ALEB 29 和 ALEB 47 发酵液中可溶性磷元素的含量均大于 100 mg / L,并且
其发酵液的 pH值均低于 5. 00。 但 ALEB 14 和 ALEB 20 发酵液的 pH值分别为 4. 62 和 4. 53,其发酵液中可
溶性磷元素的含量却较低,仅为(46. 67 依6. 55) mg / L 和(60. 95 依21. 33) mg / L。 而 ALEB 2A、ALEB 31 和
ALEB 34 的溶磷量均超过了 150 mg / L,但其发酵液的 pH值却均高于 6. 00。
2. 6摇 茅苍术内生细菌溶解有机磷的定量检测及细菌发酵液 pH值的测定
茅苍术内生细菌中具溶解有机磷能力的菌株数要低于具溶解无机磷能力的菌株数,并且磷元素的释放量
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图 3摇 茅苍术内生固氮细菌 nifH基因的扩增
摇 Fig. 3摇 Amplification of nifH genes from nitrogen鄄fixing
endophytic bacteria摇
也较低,2 / 3 解有机磷菌株的磷元素释放量低于 5
mg / L。 ALEB 4A溶解有机磷的能力最强,磷元素释放
量为(23. 63 依 1. 46) mg / L。 同时测定菌液的 pH 值
(图 6)。 摇
3摇 讨论
3. 1摇 茅苍术内生细菌多样性
本课题组的前期研究已经证明茅苍术体内存在丰
富的内生真菌资源,并且其对茅苍术的生长和道地性的
形成产生了很大影响。 本研究通过 ARDRA 和 BOX鄄
PCR相结合的方法揭示了茅苍术内生细菌的多样性。
ARDRA是一种简单而可靠的细菌分类方法[19],能够在
图 4摇 茅苍术内生固氮细菌 16S rDNA系统发育树
Fig. 4摇 Phylogenetic dendrogram of the nitrogen鄄fixing endophytic bacteria from Atractylodes lancea based on the 16S rDNA fragments
16S rDNA片段的基础上估计分离物中存在的最低限度的细菌种类数目[20]。 许多研究者将 ARDRA应用于不
同来源细菌的初步分类与鉴定[8,21]。 本研究中的 14 个 ARDRA 聚类簇代表菌株的 16S rDNA 序列测定结果
表明分离得到的茅苍术内生细菌与泛菌属、微杆菌属、短杆菌属、农杆菌属、假单胞菌属、芽孢杆菌属细菌亲缘
关系相近,其中茅苍术叶片优势内生细菌与假单胞菌属细菌亲缘关系相近。 这些属的细菌均已被报道作为内
生细菌存在于不同植物体内,其中一些还具有植物促生能力[22鄄25]。 与 ARDRA相比,使用 BOX鄄PCR获得的指
纹图谱能够区分亲缘关系更近的细菌菌株[26],因此利用 BOX鄄PCR 对茅苍术内生细菌主要 ARDRA 聚类簇 6
3111摇 4 期 摇 摇 摇 周佳宇摇 等:茅苍术叶片可培养内生细菌多样性及其促生潜力 摇
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图 5摇 茅苍术内生细菌无机磷溶解量与发酵液 pH值
Fig. 5摇 The amount of dissociative phosphorus released by inorganic phosphate solubilizing bacteria and the pH of their
fermentation solutions
图 6摇 茅苍术内生细菌有机磷溶解量与发酵液 pH值
Fig. 6摇 The amount of dissociative phosphorus released by organic phosphate solubilizing bacteria and the pH of their fermentation solutions
和 9 中的菌株进行分析。 BOX鄄PCR指纹图谱聚类分析结果表明,主要 ARDRA 聚类簇中的内生细菌菌株也
具有丰富的多样性。
3. 2摇 茅苍术内生细菌的促生潜力
氮、磷、钾是植物生长发育过程中不可缺少的重要营养元素。 在作物生长过程中常需要人工施加氮、磷、
钾等肥料以满足作物对养分的需求。 本研究获得了多株具有固氮、溶解无机磷或有机磷、解钾和产生长素能
力的内生细菌。 如果这些具有多种促生潜力的内生细菌菌株能够与茅苍术建立良好的共生关系,那么它们能
够为宿主植物提供更多可被利用的氮、磷、钾元素和植物激素,这必然会对茅苍术药材的产量和品质产生有益
影响。 但本实验中并没有发现同时具有固氮、溶解无机磷和有机磷、解钾和产生长素能力的内生细菌菌株,因
4111 摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 33 卷摇
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此在生产实践中可以将不同茅苍术内生细菌组合使用,使它们协同发挥促生功能,从一定程度上解决茅苍术
栽培过程中土壤营养元素失衡的问题,增加苍术药材的产量和品质[27]。
依据 16S rDNA序列测定结果构建的系统发育树,茅苍术内生固氮细菌分别与土壤杆菌属、泛菌属、假单
胞菌属、芽孢杆菌属和短小杆菌属的典型菌株聚为一类,应属于这些属的不同种或同一种的不同菌株,而这些
属的细菌均已被报道具有固氮能力[24,28鄄29]。 但不同无氮培养基间存在一定的差异,使用某一种无氮培养基进
行固氮细菌的筛选不能够得到所有具固氮潜力的细菌,茅苍术体内应该还存在有其他种属的固氮细菌有待于
进一步的发现与研究。
ARDRA聚类簇 6 中的 9 个菌株均具有溶解无机磷的能力,并且其溶磷量与产酸能力呈正相关。 因此,推
测部分茅苍术内生细菌通过分泌一些酸性物质来溶解磷酸钙,释放难溶性的磷元素。 但有些内生细菌溶解无
机磷的量很高,同时其菌液的 pH值也较高。 说明分泌酸性物质并不是内生细菌溶解磷酸盐的唯一途径,这
些菌株可能通过分泌胞外磷酸酶来释放磷元素,并且不同的作用途径间可能存在协同。 除 ALEB 14 和 ALEB
47 外,其他具溶解无机磷能力的菌株都与假单胞菌属菌株近缘,这与之前研究报道的假单胞菌属细菌溶解无
机磷的能力相符[30]。 具有机磷溶解能力的内生细菌菌株 ALEB 10 和 ALEB 35 经 16S rDNA序列测定、比对,
与巨大芽孢杆菌的相似度分别为 99%和 98% 。 巨大芽孢杆菌为已知的解磷菌种,并已经作为微生物菌剂广
泛使用[31]。 细菌发酵液 pH值的测定结果表明,内生细菌溶解有机磷的能力与其产酸能力无相关性。 因此推
测茅苍术内生细菌通过分泌胞外磷酸酶来溶解卵磷脂,释放磷元素。 植物促生细菌在植物体外,通过释放土
壤中不溶性的磷元素,促进植物生长和次级代谢物积累的能力已有报道[32鄄33]。 而植物内生细菌很可能来源
于土壤,通过植物根部的自然孔洞或伤口侵入植物体内,成为植物体微生态体系的一部分,因此,可以利用内
生细菌在植物根际土壤中的定殖来改善植物的磷素营养[34]。 而具有解钾潜力的内生细菌几乎分布于各
ARDRA聚类簇,不具有种属差异。
大多数茅苍术内生细菌能够将培养基中的 L鄄色氨酸转化为 IAA,并将其分泌至体外。 虽然培养时间以及
色氨酸含量可能对细菌的生长素产生量存在一定影响,但从本实验获得的结果可以看出很大一部分茅苍术内
生细菌具有较强的 IAA产生能力,并且部分菌株产生长素的能力要大于一些实验者分离得到的其他来源的
细菌菌株[17]。 虽然本实验未对茅苍术植株体内色氨酸的含量进行测定,但其作为植物合成 IAA的前体物质,
应当在菊科高等植物茅苍术中也广泛存在。 因此,作者推测内生细菌在与茅苍术建立共生后,可以利用植物
体内游离的色氨酸合成 IAA,供宿主植物使用。
综上所述,本研究首次探究了江苏省道地药材茅苍术叶片内可培养内生细菌的多样性,并研究了其固氮、
解磷、解钾和产生长素的促生潜力。 初步揭示了内生细菌与茅苍术之间的相互关系,为进一步将内生细菌回
接茅苍术植株,研究其对茅苍术药材产量和道地性形成的影响提供了重要依据。
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ACTA ECOLOGICA SINICA Vol. 33,No. 4 February,2013(Semimonthly)
CONTENTS
Frontiers and Comprehensive Review
Concepts, processes and quantification methods of the forest water conservation at the multiple scales
WANG Xiaoxue, SHEN Huitao, LI Xuyong, et al (1019)
………………………………
…………………………………………………………………………
Advances in the study of stable isotope composition of leaf water in plants LUO Lun, YU Wusheng, WAN Shimin, et al (1031)……
Eco鄄environmental effects of urban landscape pattern changes: progresses, problems, and perspectives
CHEN Liding, SUN Ranhao, LIU Hailian (1042)
………………………………
…………………………………………………………………………………
An overview of advances in distributional pattern of urban biodiversity MAO Qizheng, MA Keming, WU Jianguo,et al (1051)………
Ecological compensation boosted ecological protection and human well鄄being improvement LI Huimei,ZHANG Anlu (1065)…………
Autecology & Fundamentals
Effects of indigenous AM fungi and neighboring plants on the growth and phosphorus nutrition of Leymus chinensis
LEI Yao, HAO Zhipeng, CHEN Baodong (1071)
……………………
…………………………………………………………………………………
Influences of AM fungi on plant growth and water鄄stable soil aggregates under drought stresses
YE Jiashu, LI Tao, HU Yajun, et al (1080)
………………………………………
………………………………………………………………………………………
The effect of transgenic cucumber with double strands RNA of mapk on diversity of rhizosphere bacteria
CHEN Guohua, MI Baobin, LI Ying, et al (1091)
………………………………
…………………………………………………………………………………
The ambient ozone pollution and foliar injury of the sensitive woody plants in Beijing exurban region
WAN Wuxing, XIA Yajun, ZHANG Hongxing, et al (1098)
…………………………………
………………………………………………………………………
Diversity and plant growth鄄promoting potential of culturable endophytic bacteria isolated from the leaves of Atractylodes lancea
ZHOU Jiayu, JIA Yong, WANG Hongwei, et al (1106)
………
……………………………………………………………………………
Effects of the low temperature treatment on egg maturation and its numerical dynamics in the parasitoid Pteromalus puparum
(Hymenoptera: Pteromalidae) XIA Shiyang,MENG Ling,LI Baoping (1118)……………………………………………………
Circadian rhythm of calling behavior and sexual pheromone production and release of the female Zeuzera leuconotum Butler
(Lepidoptera: Cossidae) LIU Jinlong, JING Xiaoyuan, YANG Meihong, et al (1126)…………………………………………
Influence of fluoride on activity of carboxylesterase and esterase in hemolymph of Bombyx mori
MI Zhi, RUAN Chenglong, LI Jiaorong, et al (1134)
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Effects of water temperature on the embryonic development, survival and development period of larvae of ridgetail white prawn
(Exopalaemon carinicauda) reared in the laboratory LIANG Junping, LI Jian, LI Jitao,et al (1142)……………………………
Population, Community and Ecosystem
Diversity of ecosystem services and landscape multi鄄functionality: from scientific concepts to integrative assessment
L譈 Yihe, MA Zhimin, FU Bojie, et al (1153)
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Research on estimating wetland vegetation abundance based on spectral mixture analysis with different endmember model: a case
study in Wild Duck Lake wetland, Beijing CUI Tianxiang, GONG Zhaoning, ZHAO Wenji,et al (1160)………………………
Identifying typical plant ecological types based on spectral characteristic variables: a case study in Wild Duck Lake wetland,
Beijing LIN Chuan, GONG Zhaoning, ZHAO Wenji,et al (1172)…………………………………………………………………
Responses of phytoplankton community to the construction of small hydropower stations in Hainan Province
LIN Zhangwen,LIN Sheng,GU Jiguang,et al (1186)
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Diurnal variation of water quality around Potamogeton crispus population WANG Jinqi,ZHENG Youfei,WANG Guoxiang (1195)……
Effects of three forest restoration approaches on plant diversity in red soil region, southern China
WANG Yun, OUYANG Zhiyun, ZHENG Hua, et al (1204)
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Dynamics of soil physical鄄chemical properties and organic carbon content along a restoration chronosequence in Pinus tabulaeformis
plantations HU Huifeng, LIU Guohua (1212)………………………………………………………………………………………
Probability models of forest fire risk based on ecology factors in different vegetation regions over China
LI Xiaowei, ZHAO Gang, YU Xiubo,et al (1219)
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Landscape, Regional and Global Ecology
Landscape ecological security dynamics in a fast growing urban district: the case of Dongguan City
YANG Qingsheng, QIAO Jigang, AI Bin (1230)
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The difference between exergy and biodiversity in ecosystem health assessment: a case study of Jiangsu coastal zone
TANG Dehao, ZOU Xinqing, LIU Xingjian (1240)
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Impacts of drying鄄wetting cycles on CO2 and N2O emissions from soils in different ecosystems
OUYANG Yang, LI Xuyong (1251)
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Evaluation of low鄄carbon competitiveness in Western China JIN Xiaoqin, DU Shouhu (1260)…………………………………………
Flood return period analysis of the Bayi Reservoir Watershed based on HEC鄄HMS Model
ZHENG Peng, LIN Yun, PAN Wenbin,et al (1268)
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Simulation of rainfall interception process of primary korean pine forest in Xiaoxing忆an Mountains by using the modified Gash
model CHAI Rushan, CAI Tijiu, MAN Xiuling, et al (1276)……………………………………………………………………
Characteristics of tree鄄ring chronology of Pinus koraiensis and its relationship with climate factors on the northern slope of
Changbai Mountain CHEN Lie, GAO Lushuang, ZHANG Yun, et al (1285)……………………………………………………
Resource and Industrial Ecology
Nitrogen flows in“crop 鄄edible mushroom冶production systems in Hexi Corridor Oasis Irrigation Area
LI Ruiqin,YU Anfen, ZHAO Youbiao,et al (1292)
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Effects of fertilization on soil fertility indices and yield of dry鄄land peanut
WANG Caibin, ZHENG Yaping, LIANG Xiaoyan, et al (1300)
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Effect of tillage and residue management on dynamic of soil microbial biomass carbon
PANG Xu,HE Wenqing,YAN Changrong,et al (1308)
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Evaluation of eco鄄security of cultivated land requisition鄄compensation balance based on improved set pair analysis
SHI Kaifang,DIAO Chengtai,SUN Xiufeng, et al (1317)
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Opinions
Methodology for measuring forestry ecological security based on ecology鄄industry symbiosis: a research framework
ZHANG Zhiguang (1326)
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《生态学报》2013 年征订启事
《生态学报》是由中国科学技术协会主管,中国生态学学会、中国科学院生态环境研究中心主办的生态学
高级专业学术期刊,创刊于 1981 年,报道生态学领域前沿理论和原始创新性研究成果。 坚持“百花齐放,百家
争鸣冶的方针,依靠和团结广大生态学科研工作者,探索自然奥秘,为生态学基础理论研究搭建交流平台,促
进生态学研究深入发展,为我国培养和造就生态学科研人才和知识创新服务、为国民经济建设和发展服务。
《生态学报》主要报道生态学及各分支学科的重要基础理论和应用研究的原始创新性科研成果。 特别欢
迎能反映现代生态学发展方向的优秀综述性文章;研究简报;生态学新理论、新方法、新技术介绍;新书评价和
学术、科研动态及开放实验室介绍等。
《生态学报》为半月刊,大 16 开本,300 页,国内定价 90 元 /册,全年定价 2160 元。
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